1、I C S 1 1 . 0 2 0 C C S C 6 1 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准 W S / T 7 9 2 2 0 2 1 日 本 血 吸 虫 抗 体 检 测 标 准 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 法 D e t e c t i o n s t a n d a r d o f a n t i b o d y a g a i n s t S c h i s t o s o m a j a p o n i c u m E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y 2 0 2 1 1
2、 1 2 3 发 布 2 0 2 2 0 5 0 1 实 施 中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 健 康 委 员 会 发 布W S / T 7 9 2 2 0 2 1 I 前 言 本 标 准 由 国 家 卫 生 健 康 标 准 委 员 会 寄 生 虫 病 标 准 专 业 委 员 会 负 责 技 术 审 查 和 技 术 咨 询 ， 由 中 国 疾 病 预 防 控 制 中 心 负 责 协 调 性 和 格 式 审 查 ， 由 国 家 卫 生 健 康 委 疾 病 预 防 控 制 局 负 责 业 务 管 理 、 法 规 司 负 责 统 筹 管 理 。 本 标 准 起 草 单 位 ： 杭 州 医
3、学 院 （ 浙 江 省 医 学 科 学 院 ） 、 中 国 疾 病 预 防 控 制 中 心 寄 生 虫 病 预 防 控 制 所 、 安 徽 省 血 吸 虫 病 防 治 研 究 所 、 宁 波 市 疾 病 预 防 控 制 中 心 、 江 西 省 寄 生 虫 病 防 治 研 究 所 。 本 标 准 主 要 起 草 人 ： 闻 礼 永 、 严 晓 岚 、 熊 彦 红 、 郑 彬 、 张 剑 锋 、 汪 天 平 、 俞 丽 玲 、 许 国 章 、 林 丹 丹 、 周 晓 农 。W S / T 7 9 2 2 0 2 1 2 日 本 血 吸 虫 抗 体 检 测 标 准 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 法
4、 1 范 围 本 标 准 规 定 了 检 测 日 本 血 吸 虫 抗 体 的 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 方 法 。 本 标 准 适 用 于 各 级 疾 病 预 防 控 制 机 构 和 医 疗 机 构 对 人 体 血 清 中 日 本 血 吸 虫 抗 体 的 检 测 。 2 规 范 性 引 用 文 件 本 标 准 没 有 规 范 性 引 用 文 件 。 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 标 准 。 3 . 1 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a
5、 y ； E L I S A 利 用 抗 原 抗 体 之 间 专 一 性 键 结 之 特 性 ， 对 检 体 进 行 检 测 ； 由 于 结 合 于 固 体 承 载 物 上 之 抗 原 或 抗 体 仍 可 具 有 免 疫 活 性 ， 因 此 设 计 其 键 结 机 制 后 ， 配 合 酵 素 呈 色 反 应 ， 即 可 显 示 特 定 抗 原 或 抗 体 是 否 存 在 ， 并 可 利 用 呈 色 之 深 浅 进 行 定 量 分 析 的 试 验 。 3 . 2 可 溶 性 虫 卵 抗 原 s o l u b l e e g g a n t i g e n 血 吸 虫 虫 卵 经 匀 浆 和 超
6、 声 破 碎 等 处 理 后 离 心 收 集 的 上 清 液 ， 含 蛋 白 质 、 糖 蛋 白 、 多 糖 等 多 种 成 分 复 合 物 。 3 . 3 金 黄 色 葡 萄 球 菌 蛋 白 A s t a p h y l o c o c a l p r o t e i n A 从 金 黄 色 葡 萄 球 菌 细 胞 壁 分 离 的 蛋 白 质 ， 能 与 人 及 多 种 哺 乳 动 物 血 清 中 I g G 分 子 的 F c 片 段 结 合 ， 作 为 第 二 抗 体 。 4 仪 器 设 备 4 . 1 台 式 低 速 离 心 机 最 高 转 速 大 于 或 等 于 2 5 0 0 r
7、 / m i n ， 或 最 大 相 对 离 心 力 大 于 或 等 于 8 0 0 g 。 4 . 2 酶 标 专 用 比 色 计 带 有 4 5 0 n m 、 4 9 2 n m 和 6 3 0 n m 滤 光 片 ， 分 辨 率 0 . 0 0 1 光 密 度 （ o p t i c a l d e n s i t y ， O D ） 值 。 4 . 3 恒 温 水 浴 箱W S / T 7 9 2 2 0 2 1 3 控 温 范 围 5 9 9 . 9 ， 温 度 分 辨 率 / 波 动 度 0 . 1 / 0 . 5 。 4 . 4 微 量 移 液 器 量 程 范 围 1 L 1
8、0 L ， 增 量 0 . 1 L ； 量 程 范 围 1 0 L 1 0 0 L ， 增 量 1 L ； 量 程 范 围 1 0 0 L 1 0 0 0 L ， 增 量 5 L 。 5 试 剂 或 材 料 5 . 1 酶 标 反 应 板 9 6 孔 或 4 0 孔 微 量 聚 苯 乙 烯 或 聚 氯 乙 烯 塑 料 凹 孔 反 应 板 。 5 . 2 包 被 抗 原 可 溶 性 虫 卵 抗 原 ， 制 备 方 法 见 附 录 A 中 A . 1 。 5 . 3 包 被 缓 冲 液 0 . 0 5 m o l / L p H 9 . 6 碳 酸 盐 缓 冲 液 ， 制 备 方 法 见 附 录
9、A . 2 。 5 . 4 样 品 洗 涤 液 含 0 . 0 5 % 吐 温 - 2 0 的 0 . 0 1 m o l / L p H 7 . 4 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ P B S - T ） ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 3 。 5 . 5 封 闭 液 2 % 牛 血 清 白 蛋 白 （ B S A ） ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 4 。 5 . 6 阳 性 对 照 血 清 感 染 日 本 血 吸 虫 的 兔 混 合 血 清 ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 5 。 5 . 7 阴 性 对 照 血 清 健 康 兔 混 合 血 清 ， 制 备 方 法 见
10、附 录 A . 6 。 5 . 8 样 品 稀 释 液 含 0 . 1 % B S A 的 P B S - T ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 7 。 5 . 9 酶 标 记 物 金 黄 色 葡 萄 球 菌 蛋 白 A 标 记 辣 根 过 氧 化 物 酶 ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 8 。 5 . 1 0 底 物 缓 冲 液 p H 5 . 0 磷 酸 - 柠 檬 酸 缓 冲 液 ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 9 。 5 . 1 1 底 物 使 用 液 3 , 3 ， 5 , 5 - 四 甲 基 联 苯 胺 （ T M B ） 或 邻 苯 二 胺 （ O P D
11、） ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 1 0 。 5 . 1 2 终 止 液 2 m o l / L 硫 酸 ， 制 备 方 法 见 附 录 A . 1 1 。W S / T 7 9 2 2 0 2 1 4 6 检 测 步 骤 示 意 图 和 注 意 事 项 见 附 录 B 。 6 . 1 样 本 准 备 采 集 末 梢 血 1 0 0 L 或 静 脉 血 2 m L ， 室 温 下 放 置 至 血 块 收 缩 后 ， 8 0 0 g 离 心 5 m i n ， 分 离 出 血 清 进 行 检 测 。 6 . 2 样 本 检 测 6 . 2 . 1 抗 原 包 被 于 酶 标 反 应 板
12、 凹 孔 中 ， 加 入 1 0 0 L 以 包 被 缓 冲 液 1 : 1 0 0 0 1 : 3 0 0 0 稀 释 的 可 溶 性 虫 卵 抗 原 ， 置 4 冰 箱 过 夜 。 次 日 ， 倾 去 抗 原 ， 用 样 品 洗 涤 液 洗 涤 3 次 ， 每 次 3 m i n 5 m i n ， 甩 干 。 为 减 少 非 特 异 性 反 应 ， 小 孔 中 可 再 加 1 0 0 L 封 闭 液 过 夜 ， 甩 干 。 4 保 存 备 用 。 6 . 2 . 2 加 受 检 和 对 照 血 清 用 样 品 稀 释 液 1 : 1 0 0 比 例 稀 释 受 检 者 、 阴 性 对 照
13、 和 阳 性 对 照 血 清 ， 各 取 1 0 0 L 稀 释 血 清 加 入 酶 标 反 应 板 的 小 孔 中 ， 每 板 同 时 设 置 两 孔 阴 性 对 照 血 清 、 一 孔 阳 性 对 照 血 清 和 一 孔 样 品 稀 释 液 空 白 对 照 ， 置 恒 温 水 浴 箱 内 3 7 孵 育 1 h 。 如 6 . 2 . 1 洗 涤 甩 干 。 6 . 2 . 3 加 酶 标 记 物 用 样 品 缓 冲 液 1 : 1 0 0 0 1 : 4 0 0 0 比 例 稀 释 酶 标 记 物 ， 取 1 0 0 L 加 入 酶 标 反 应 板 的 小 孔 中 ， 置 恒 温 水 浴
14、 箱 内 3 7 孵 育 1 h 。 如 6 . 2 . 1 洗 涤 甩 干 。 6 . 2 . 4 加 底 物 每 孔 加 入 新 配 置 的 底 物 使 用 液 1 0 0 L ， 置 恒 温 水 浴 箱 内 3 7 反 应 3 0 m i n 。 6 . 2 . 5 终 止 反 应 每 孔 加 入 5 0 L 终 止 液 终 止 反 应 。 6 . 2 . 6 结 果 判 定 以 空 白 对 照 调 零 ， 读 取 酶 标 专 用 比 色 计 上 各 孔 4 5 0 n m （ T M B 为 底 物 ） 或 4 9 2 n m （ O P D 为 底 物 ） 波 长 的 O D 值 ，
15、 以 6 3 0 n m 作 为 参 比 波 长 。 以 受 检 样 本 孔 O D 值 / 阴 性 对 照 孔 O D 值 （ P / N ） 2 . 1 倍 判 为 阳 性 。 当 阴 性 对 照 O D 值 低 于 0 . 0 5 时 ， 按 0 . 0 5 计 算 。W S / T 7 9 2 2 0 2 1 5 A A 附 录 A （ 资 料 性 ） 主 要 试 剂 材 料 制 备 方 法 A . 1 包 被 抗 原 取 冻 干 虫 卵 ， 0 . 0 1 % 硫 柳 汞 生 理 盐 水 配 制 悬 液 ， 组 织 匀 浆 器 研 磨 并 置 2 0 反 复 冻 融 3 次 ， 1
16、0 0 0 0 g 离 心 3 0 m i n ， 取 上 清 液 。 测 定 蛋 白 含 量 后 ， 用 硫 柳 汞 生 理 盐 水 稀 释 至 0 . 7 5 m g / m L ， 分 装 后 置 2 0 保 存 备 用 。 A . 2 包 被 缓 冲 液 称 取 碳 酸 钠 （ N a 2 C O 3 ） 1 . 5 9 g ， 碳 酸 氢 钠 （ N a H C O 3 ） 2 . 9 3 g ， 加 去 离 子 水 （ 或 蒸 馏 水 ） 至 1 0 0 0 m L ， 即 为 0 . 0 5 m o l / L p H 9 . 6 碳 酸 盐 缓 冲 液 ， 密 封 盖 好 ，
17、4 保 存 备 用 ， 有 效 期 2 周 。 A . 3 样 品 洗 涤 液 （ P B S - T ） 称 取 磷 酸 二 氢 钾 （ K H 2 P O 4 ） 0 . 2 g ， 十 二 水 合 磷 酸 氢 二 钠 （ N a 2 H P O 4 . 1 2 H 2 O ） 2 . 9 g ， 氯 化 钠 （ N a C l ） 8 . 0 g ， 氯 化 钾 （ K C l ） 0 . 2 g ， 加 去 离 子 水 （ 或 蒸 馏 水 ） 至 1 0 0 0 m L ， 即 为 0 . 1 5 m o l / L p H 7 . 4 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ P B S ） ，
18、再 加 0 . 5 m L 吐 温 - 2 0 ， 即 配 成 含 0 . 0 5 吐 温 - 2 0 的 洗 涤 缓 冲 液 （ P B S - T ） ， 4 保 存 备 用 。 A . 4 封 闭 液 称 取 2 g B S A ， 加 入 P B S - T 缓 冲 液 1 0 0 m L ， 即 为 2 % 牛 血 清 白 蛋 白 ， 4 保 存 备 用 。 A . 5 阳 性 对 照 血 清 选 择 体 重 2 . 5 k g 3 . 0 k g 的 健 康 家 兔 ， 每 只 感 染 8 0 0 条 1 0 0 0 条 日 本 血 吸 虫 尾 蚴 ， 饲 养 6 0 d 后 ，
19、抽 取 心 脏 全 血 ， 分 离 血 清 ， 混 合 后 按 每 支 0 . 1 m L 分 装 于 微 量 离 心 管 冻 干 ， 作 为 阳 性 对 照 血 清 。 阳 性 对 照 血 清 检 测 效 价 不 低 于 1 ： 6 4 0 。 A . 6 阴 性 对 照 血 清 选 择 体 重 2 . 5 k g 3 . 0 k g 的 健 康 家 兔 ， 抽 取 心 脏 全 血 ， 分 离 血 清 ， 选 出 没 有 溶 血 的 血 清 灭 活 补 体 （ 5 6 灭 活 3 0 m i n ） ， 混 合 后 按 每 支 0 . 1 m L 分 装 微 量 离 心 管 冻 干 ， 作
20、为 阴 性 对 照 血 清 。 阴 性 对 照 血 清 检 测 效 价 不 高 于 1 ： 5 。 A . 7 样 品 稀 释 液 称 取 0 . 1 g B S A ， 加 入 P B S - T 缓 冲 液 至 1 0 0 m L ， 4 保 存 备 用 。 A . 8 酶 标 记 物W S / T 7 9 2 2 0 2 1 6 常 用 过 碘 酸 钠 法 标 记 。 称 取 5 m g 辣 根 过 氧 化 物 酶 （ H R P ） 溶 于 0 . 5 m L 蒸 馏 水 中 ， 加 入 新 鲜 配 制 的 0 . 0 6 m o l / L 过 碘 酸 钠 （ N a I O 4 ）
21、 水 溶 液 0 . 5 m L ， 混 匀 置 4 3 0 m i n ， 取 出 加 入 0 . 1 6 m o l / L 乙 二 醇 水 溶 液 0 . 5 m L ， 室 温 放 置 3 0 m i n 后 ， 加 入 含 5 m g 纯 化 抗 体 的 水 溶 液 1 m L ， 混 匀 并 装 透 析 袋 ， 在 0 . 0 5 m o l / L p H 9 . 5 碳 酸 缓 冲 液 缓 慢 搅 拌 透 析 6 h 或 过 夜 ， 然 后 加 5 m g / m L 硼 氢 化 钠 （ N a B H 4 ） 溶 液 0 . 2 m L ， 置 4 2 h 。 将 上 述 结
22、 合 物 混 合 液 加 入 等 体 积 饱 和 硫 酸 铵 ， 4 3 0 m i n 后 离 心 ， 将 所 得 沉 淀 物 溶 于 少 许 0 . 0 2 m o l / L p H 7 . 4 磷 酸 盐 缓 冲 液 中 ， 并 透 析 过 夜 ， 次 日 离 心 除 去 不 溶 物 ， 即 得 酶 - 抗 体 结 合 物 ， 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 加 至 5 m L 进 行 测 定 后 冷 冻 干 燥 保 存 。 A . 9 底 物 缓 冲 液 称 取 磷 酸 氢 二 钠 （ N a 2 H P O 4 ） 2 8 . 4 g ， 加 去 离 子 水 （ 或 蒸 馏 水 ） 至
23、 1 0 0 0 m L ， 为 A 液 ； 称 取 柠 檬 酸 1 9 . 2 g ， 加 去 离 子 水 （ 或 蒸 馏 水 ） 至 1 0 0 0 m L ， 为 B 液 。 取 A 液 2 5 . 7 m L ， B 液 2 4 . 3 m L 混 合 ， 并 加 去 离 子 水 （ 或 蒸 馏 水 ） 5 0 m L ， 即 为 p H 5 . 0 磷 酸 - 柠 檬 酸 缓 冲 液 。 现 配 现 用 。 A . 1 0 底 物 使 用 液 A . 1 0 . 1 T M B 使 用 液 称 取 1 0 0 m g T M B 溶 解 在 1 0 m L 二 甲 基 亚 砜 （ D
24、 M S O ） 或 无 水 乙 醇 中 ， 配 成 1 % T M B 溶 液 ， 4 保 存 6 个 月 以 内 使 用 。 用 底 物 缓 冲 液 9 . 9 m L 加 入 0 . 1 m L 1 % T M B 保 存 液 ， 使 用 前 ， 按 每 1 m L T M B 溶 液 加 入 3 0 % 过 氧 化 氢 （ H 2 O 2 ） 1 L ， 混 匀 后 立 即 使 用 。 A . 1 0 . 2 O P D 使 用 液 称 取 4 m g O P D 溶 解 在 1 0 m L 底 物 缓 冲 液 中 ， 再 加 3 0 % H 2 O 2 1 5 L ， 避 光 保 存
25、 。 使 用 前 现 配 现 用 。 A . 1 1 终 止 液 蒸 馏 水 1 7 8 . 3 m L ， 逐 滴 加 入 9 8 % 浓 硫 酸 2 1 . 7 m L ， 即 为 2 m o l / L 终 止 液 。W S / T 7 9 2 2 0 2 1 7 B B 附 录 B （ 资 料 性 ） 检 测 步 骤 和 注 意 事 项 B . 1 检 测 步 骤 检 测 步 骤 示 意 图 见 图 B . 1 。 图 B . 1 检 测 步 骤 示 意 图W S / T 7 9 2 2 0 2 1 8 B . 2 注 意 事 项 B . 2 . 1 样 本 采 集 与 保 存 ： 末
26、 梢 血 一 般 采 用 聚 乙 烯 塑 料 管 采 集 ， 塑 料 管 孔 径 2 m m ， 长 度 1 0 c m 。 静 脉 血 一 般 采 用 一 次 性 真 空 采 血 管 采 集 。 全 血 采 集 后 应 在 4 h 内 进 行 血 清 分 离 。 血 清 样 本 不 能 混 有 红 细 胞 或 被 细 菌 污 染 ， 血 清 量 应 不 少 于 1 0 L 。 血 清 样 本 若 不 能 及 时 检 测 ， 可 在 2 8 保 存 3 d 5 d ， 长 时 间 保 存 应 置 于 2 0 以 下 冷 冻 保 存 。 B . 2 . 2 试 剂 准 备 ： 检 测 试 剂 如
27、 果 从 冰 箱 取 出 ， 应 放 在 室 温 条 件 下 平 衡 3 0 m i n 以 上 再 行 使 用 。 B . 2 . 3 加 样 ： 使 用 移 液 器 加 样 ， 每 检 测 一 个 样 本 应 更 换 吸 头 ， 加 样 时 应 将 液 体 加 在 孔 底 ， 避 免 产 生 气 泡 ， 从 而 影 响 吸 液 量 的 准 确 性 ； 加 底 物 和 终 止 液 时 也 要 去 除 孔 内 气 泡 ， 避 免 影 响 样 本 O D 值 。 B . 2 . 4 洗 涤 ： 每 次 洗 涤 时 一 定 要 彻 底 洗 净 甩 干 ， 否 则 影 响 结 果 。 B . 2 .
28、 5 加 样 后 的 酶 标 反 应 板 应 封 板 （ 加 盖 玻 璃 板 或 一 次 性 封 口 膜 ， 或 放 置 密 闭 湿 盒 内 ） 后 ， 方 可 置 3 7 恒 温 水 浴 箱 湿 育 。 B . 2 . 6 加 底 物 前 ， 酶 标 反 应 板 经 洗 涤 甩 干 后 ， 不 宜 在 空 气 中 暴 露 过 久 ， 应 速 加 底 物 ， 以 免 影 响 酶 的 活 力 而 影 响 结 果 。 底 物 溶 液 需 放 置 在 棕 色 瓶 （ 或 其 它 避 光 瓶 ） 内 ， 溶 液 应 清 晰 无 色 ， 反 应 需 在 暗 处 进 行 。 底 物 O P D 有 一 定
29、 毒 性 ， 应 避 免 污 染 。 B . 2 . 7 结 果 判 定 ： 应 在 1 0 m i n 内 完 成 结 果 测 量 ， 测 定 O D 值 时 应 注 意 擦 干 反 应 板 底 部 的 小 水 珠 ， 以 免 影 响 结 果 测 量 。 B . 2 . 8 实 验 室 应 设 置 独 立 的 工 作 区 域 ， 包 括 样 品 处 理 区 与 E L I S A 检 测 区 ， 以 防 止 交 叉 污 染 。 CW S / T 7 9 2 2 0 2 1 9 参 考 文 献 1 W S 2 6 1 2 0 0 6 血 吸 虫 病 诊 断 标 准 . 2 吴 观 陵 . 人
30、体 寄 生 虫 学 （ 第 4 版 ） M . 北 京 ： 人 民 卫 生 出 版 社 ， 2 0 1 3 . 3 闻 礼 永 . 血 吸 虫 病 监 测 手 册 M . 北 京 ： 人 民 卫 生 出 版 社 ， 2 0 1 4 . 4 周 晓 农 . 血 吸 虫 病 消 除 手 册 M . 上 海 ： 上 海 科 学 技 术 出 版 社 ， 2 0 2 1 . 5 E n g v a l l E , P e r l m a n n P . E n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A )
31、q u a n t i t a t i v e a s s a y o f i m m u n o g l o b u l i n G J . I m m u n o c h e m i s t r y , 1 9 7 1 , 8 ( 9 ) : 8 7 1 - 8 7 4 . 6 郭 春 祥 ， 郭 锡 琼 . 介 绍 一 种 简 单 、 快 速 、 高 效 的 辣 根 过 氧 化 物 酶 标 记 抗 体 的 过 碘 酸 钠 法 J . 上 海 免 疫 学 杂 志 ， 1 9 8 3 ， 3 ( 2 ) ： 9 7 - 1 0 0 . _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
