1、I C S 0 7. 1 0 0. 3 0 C C S X 0 4 中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 S N / T 5 3 6 1 2 0 2 1 出 口 食 品 中 阪 崎 克 罗 诺 杆 菌 检 测 方 法 f u s A 基 因 测 序 法 D e t e c t i o n o f C r o n o b a c t e r s a k a z a k i i i n e x p o r t f o o d f u s A g e n e s e q u e n c i n g m e t h o d 2 0 2 1 - 1 1 - 2 2 发
2、布 2 0 2 2 - 0 6 - 0 1 实 施 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 发 布 以正式出版文本为准中 华 人 民 共 和 国 出 入 境 检 验 检 疫 行 业 标 准 出 口 食 品 中 阪 崎 克 罗 诺 杆 菌 检 测 方 法 f u s A 基 因 测 序 法 SN / T 5361 2021 * 中 国 海 关 出 版 社 有 限 公 司 出 版 发 行 北 京 市 朝 阳 区 东 四 环 南 路 甲 1 号( 100023 ) 编 辑 部:( 010 ) 65194242 - 7509 网 址 www. cus t omskb. c om / book 中
3、国 标 准 出 版 社 秦 皇 岛 印 刷 厂 印 刷 * 开 本 88012301 / 16 印 张 0. 5 字 数 15 千 字 2022 年 6 月 第 一 版 2022 年 6 月 第 一 次 印 刷 印 数 1 500 * 书 号: 155175 730 定 价 8. 0 0 元 以正式出版文本为准前 言 本 文 件 按 照 GB / T 1. 1 2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1 部 分: 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起 草。 本 文 件 由 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 提 出 并 归 口。 本 文 件 起 草 单
4、位: 中 国 海 关 科 学 技 术 研 究 中 心。 本 文 件 主 要 起 草 人: 汪 琦、 曾 静、 徐 蕾 蕊、 付 溥 博、 赵 晓 娟、 李 丹、 马 丹、 魏 海 燕、 王 紫 薇、 张 西 萌。 S N / T 5 3 6 1 2 0 2 1 以正式出版文本为准以正式出版文本为准出 口 食 品 中 阪 崎 克 罗 诺 杆 菌 检 测 方 法 f u s A 基 因 测 序 法 1 范 围 本 文 件 规 定 了 出 口 食 品 中 阪 崎 克 罗 诺 杆 菌 的 检 测 方 法。 本 文 件 适 用 于 出 口 食 品 中 阪 崎 克 罗 诺 杆 菌( C r o n o b
5、 a c t e r s a k a z a k i i ) 的 检 测。 本 文 件 也 适 用 于 出 口 食 品 中 克 罗 诺 杆 菌 属 其 他 六 个 种, 分 别 为 丙 二 酸 盐 阳 性 克 罗 诺 杆 菌 ( C r o n o b a c t e r m a l o n a t i c u s )、 苏 黎 世 克 罗 诺 杆 菌( C r o n o b a c t e r t u r i c e n s i s )、 穆 汀 斯 克 罗 诺 杆 菌 ( C r o n o b a c t e r m u y t j e n s i i )、 都 柏 林 克 罗 诺 杆
6、 菌( C r o n o b a c t e r d u b l i n e n s i s )、 尤 尼 沃 斯 克 罗 诺 杆 菌 ( C r o n o b a c t e r u n i v e r s a l i s ) 和 康 帝 蒙 提 克 罗 诺 杆 菌( C r o n o b a c t e r c o n d i m e n t i ) 的 检 测。 2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 对 于 本 文 件 的 应 用 是 必 不 可 少 的。 凡 是 注 日 期 的 引 用 文 件, 仅 注 日 期 的 版 本 适 用 于 本 文 件。 凡 是 不 注 日
7、期 的 引 用 文 件, 其 最 新 版 本( 包 括 所 有 的 修 改 单) 适 用 于 本 文 件。 GB 4789. 40 食 品 安 全 国 家 标 准 食 品 微 生 物 学 检 验 克 罗 诺 杆 菌 属( 阪 崎 肠 杆 菌) 检 验 GB / T 6682 分 析 实 验 室 用 水 规 格 和 试 验 方 法 GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求 GB / T 27403 实 验 室 质 量 控 制 规 范 食 品 分 子 生 物 学 检 测 3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件。 3. 1 管 家 基 因 h
8、o u s e k e e p i n g g e n e 其 是 所 有 细 胞 中 均 要 表 达 的 一 类 基 因, 其 产 物 是 对 维 持 细 胞 基 本 生 命 活 动 所 必 需 的, 其 基 因 序 列 高 度 保 守 并 且 在 大 多 数 情 况 下 持 续 表 达。 其 又 称 看 家 基 因, 持 家 基 因。 3. 2 T a q D N A 酶 T h e r m u s a q u a t i c u s D N A p o l y m e r a s e 其 是 从 T h e r m u s a q u a t i c u s 细 菌 中 提 取 的 耐
9、热 DNA 聚 合 酶。 3. 3 多 位 点 序 列 分 型 m u l t i l o c u s s e q u e n c e t y p i n g 其 是 一 种 基 于 核 酸 序 列 测 定 的 细 菌 分 型 方 法。 这 种 方 法 通 过 PCR 扩 增 多 个 管 家 基 因 内 部 片 段 并 测 定 其 序 列 以 分 析 菌 株 的 差 异。 4 缩 略 语 下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件。 BHI : 脑 心 浸 出 液 肉 汤( br a i n he a r t i n f us i on b r o t h ); DNA : 脱 氧 核 糖 核
10、 酸( deoxy r i bonuc l e i c a c i d ); dNTP : 脱 氧 核 糖 核 苷 三 磷 酸( deoxy - r i bonuc l eo s i de t r i pho spha t e ); EDTA : 乙 二 胺 四 乙 酸( e t hy l ene d i ami ne t e t r a a c e t i c a c i d ); 1 S N / T 5 3 6 1 2 0 2 1 以正式出版文本为准 f u s A : 延 长 因 子 G 基 因( e l onga t i on f a c t o r G ); GTP : 三 磷 酸
11、鸟 苷( guanos i ne t r i pho spha t e ); MLST : 多 位 点 序 列 分 型( mu l t i l o cus s equenc e t yp i ng ); PCR : 聚 合 酶 链 式 反 应( po l yme r a s e cha i n r e a c t i on )。 5 原 理 f u s A 基 因 是 细 菌 延 长 因 子 的 编 码 基 因。 在 克 罗 诺 杆 菌 属 细 菌 中 负 责 编 码 延 长 因 子 G , 该 因 子 在 翻 译 延 长 过 程 中 催 化 GTP 依 赖 的 核 糖 体 的 转 运。 f
12、u s A 基 因 是 克 罗 诺 杆 菌 属 MLST 分 型 使 用 的 七 个 管 家 基 因 之 一, 其 基 因 的 序 列 对 克 罗 诺 杆 菌 属 的 分 类 效 果 好, 相 同 的 f u s A 基 因 序 列 基 本 不 会 同 时 存 在 于 两 种 克 罗 诺 杆 菌 中。 因 此, 可 利 用 该 基 因 片 段 的 序 列 信 息 区 分 克 罗 诺 杆 菌 属 的 不 同 种。 6 试 剂 和 材 料 除 有 特 殊 说 明 外, 所 有 实 验 用 试 剂 均 为 分 析 纯 或 生 化 试 剂。 实 验 用 水 符 合 GB / T 6682 中 一 级
13、水 的 要 求。 所 有 试 剂 均 用 无 DNA 酶 污 染 的 容 器 分 装。 6. 1 Ex T a q DNA 聚 合 酶。 6. 2 dNTP : dATP 、 dTTP 、 dCTP 、 dGTP 。 6. 3 DNA 提 取 试 剂: DNA 提 取 试 剂 盒。 6. 4 10Ex T a q 缓 中 液。 6. 5 MgCl 2 溶 液( 25 mmo l / L )。 6. 6 TE 缓 冲 液: 10 mmo l / L Tr i s -HCl ( pH 8. 0 ), 1 mmo l / L EDTA ( pH 8. 0 )。 6. 7 琼 脂 糖。 6. 8 50
14、TAE 缓 冲 液: 2 mo l / L Tr i s -HCl ( pH 8. 4 ), 1 mo l / L 乙 酸, 0. 1 mo l / L EDTA 。 6. 9 DNA 分 子 量 标 记 物( 100 bp2 000 bp )。 6. 1 0 参 考 菌 株: 阪 崎 克 罗 诺 杆 菌 ATCC 29544 。 7 仪 器 和 设 备 7. 1 PCR 扩 增 仪。 7. 2 电 泳 仪。 7. 3 凝 胶 成 像 系 统。 7. 4 离 心 机: 离 心 力 不 小 于 12 000 g 。 7. 5 恒 温 培 养 箱: 36 1 。 7. 6 恒 温 水 浴 锅: 4
15、4 0. 5 。 7. 7 微 量 移 液 器 和 无 菌 吸 头: 10 L 、 100 L 、 200 L 、 1 000 L 。 7. 8 天 平: 感 量 为 0. 1 g 。 7. 9 灭 菌 三 角 烧 瓶: 500 mL 、 250 mL 。 7. 1 0 灭 菌 平 皿: 90 mm15 mm 。 7. 1 1 无 菌 离 心 管: 1. 5 mL 、 200 L 。 2 S N / T 5 3 6 1 2 0 2 1 以正式出版文本为准8 检 测 步 骤 8. 1 样 品 制 备、 增 菌 培 养 和 分 离 样 品 的 制 备、 增 菌 培 养 和 分 离 步 骤 参 照
16、GB 4789. 40 的 方 法 进 行。 8. 2 模 板 D N A 的 制 备 取 分 离 菌 株 BHI 液 体 培 养 物 适 量, 加 到 1. 5 mL 无 菌 离 心 管 中, 13 000 r / mi n 离 心 5 mi n , 吸 弃 上 清, 加 50 L TE 缓 冲 液, 混 匀 后 沸 水 浴 10 mi n , 13 000 r / mi n 离 心 5 mi n , 上 清 液 用 于 后 续 实 验。 也 可 使 用 商 业 化 的 DNA 提 取 试 剂 盒, 并 按 其 说 明 制 备 模 板 DNA 。 8. 3 P C R 反 应 体 系 8.
17、3. 1 P C R 扩 增 和 测 序 引 物 序 列 扩 增 正 向 引 物: 5 -GAA ACC GTA TGG CGT CAG- 3 ; 扩 增 反 向 引 物: 5 -AGA ACC GAA GTG CAG ACG- 3 ; 测 序 正 向 引 物: 5 -GCT GGA TGC GGT AAT TGA- 3 ; 测 序 反 向 引 物: 5 -CCC ATA CCA GCG ATG ATG- 3 。 8. 3. 2 P C R 反 应 体 系 见 表 1 。 表 1 P C R 反 应 体 系 试 剂 贮 备 液 浓 度 加 样 体 积/ L 终 浓 度 双 蒸 水 补 至 50
18、 L 10PCR 缓 冲 液 5. 0 1 MgCl 2 25 mmo l / L 3. 0 1. 5 mmo l / L dNTP 2. 5 mmo l / L e a ch 4. 0 0. 2 mmo l / L e a ch 上 游 引 物 10 pmo l / L 2. 0 0. 4 pmo l / L 下 游 引 物 10 pmo l / L 2. 0 0. 4 pmo l / L T a q 酶 5 U / L 0. 5 0. 05 U / L 模 板 DNA 2. 0 注: 反 应 体 系 中 各 试 剂 的 量 可 根 据 具 体 情 况 或 不 同 的 反 应 总 体 积 进
19、 行 适 当 调 整。 8. 3. 3 反 应 条 件 96 预 变 性 1 mi n ; 96 变 性 1 mi n , 58 退 火 1 mi n , 72 延 伸 2 mi n , 30 个 循 环; 72 延 伸 5 mi n ; 4 保 存 反 应 产 物。 注: PCR 反 应 参 数 也 可 根 据 基 因 扩 增 仪 型 号 的 不 同 进 行 适 当 的 调 整。 检 测 过 程 中 分 别 设 阳 性 对 照、 空 白 对 照。 阳 性 对 照 为 阪 崎 克 罗 诺 杆 菌 参 考 菌 株 ATCC 29544 的 基 因 组 DNA , 空 白 对 照 为 无 菌 水。 S N / T 5 3 6 1 2 0 2 1 以正式出版文本为准
