1、 HHP ICS 13.310 CCS A 92 中 华 人 民 共 和 国 公 共 安 全 行 业 标 准 GA/T 法庭科学 生物检材 中钩吻素 甲 和 钩吻素子 检验 气相 色谱- 质谱 法 Forensic sciences Examination methods for gelsemine and koumine in biological samples GC-MS - 发布 - - 实施 中 华 人 民 共 和 国 公 安 部 发布 GA GA/T I 前 言 本文件 按 照 GB/T 1.1 2020 标 准化 工作 导则 第 1 部分： 标准 化文 件的 结构 和起草 规则
2、的 规定 起草。 请 注意 本文 件的 某些 内容 可能涉 及专 利。 本文 件的 发布机 构不 承担 识别 专利 的责任 。 本 文件 由全 国刑 事技 术标 准化技 术委 员会 毒物 分析 分技术 委员 会 （SAC/TC 179/SC 1 ） 提 出并 归口。 本 文件 起草 单位 ： 江西 省 公安厅 刑事 科学 技术 研究 所、 广东 省公 安厅 刑事 技 术中心 、 广州 市公 安局 刑事技 术所 、济 南市 公安 局刑事 科学 技术 研究 所 。 本 文件 主要 起草 人： 刘勇 孜、曹 达锋 、王 洪宗 、裴 茂清、 张小 婷、 宋蕊 。 GA/T 1 法庭科学 生 物检 材中
3、钩吻 素甲 和 钩吻素子 检验 气 相色谱- 质谱 法 1 范围 本 文件规定了法庭科学生物检材（ 血液、尿液、 肝组织）中钩吻素甲、钩吻素子 的气相色谱-质谱 （GC-MS ）检 验方 法。 本 文件 适用 于 法 庭科 学 生 物检材 （血 液、尿 液 、 肝 组织） 中 钩 吻素 甲、 钩吻 素子 的 定性 分析 和定量 分析。 其他 检材 可参 照使 用。 2 规范 性引 用文 件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期 的 引用 文件， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件
4、， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用于 本 文件。 GB/T 6682 分析 实验室 用 水规格 和试 验方 法 GA/T 122 毒 物分 析名 词术 语 3 术语 和定 义 GA/T 122 界 定的 术语 和定 义适用 于本 文件 。 4 原理 以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，进行提取、净化及浓缩，采用气相色谱-质谱 法定性 定量 ， 以 保留 时间 、 质谱 特征 离子 和离 子丰 度比作 为定 性判 断依 据 ； 以峰面 积为 依据 ， 采 用外 标 法或内 标法 进行 定量 。 5 试剂 和材 料 5.1 试剂 实验用 水应 符 合GB/T 668
5、2 中规定 的 三 级水 。分 析中 使用的 试剂 均为 分析 纯， 试剂包 括： a) 甲醇； b) 乙酸乙 酯； c) 5% 氢氧 化钠 溶液 ： 准 确称 量 5.0g 氢 氧化 钠， 加 水溶 解 并定容至 100mL ， 常温 密封保 存， 有效 期 6 个 月； d) 2% 甲 醇 水溶液 ： 准确 量取 甲醇 2.0mL ，加 水稀 释并 定容 至 100mL ， 常 温密 封 保存， 有效 期 6 个月； e) 标准溶 液： 1) 1.0mg/mL 单 一标 准物 质储 备溶液 ：根 据 钩 吻素 甲和 钩吻素 子 标 准物 质 的 纯度 和盐型 换 算 后， 各称 取适 量
6、， 用 甲醇 分别配 制 1.0mg/mL 钩 吻 素甲和 钩吻 素子 标准 物质 储备溶 液 ， 密 封，-18 以 下保 存， 有效 期 12 个月； 2) 0.1 mg/mL 单一 标 准物 质 工作溶 液： 移 取 1.0mg/mL 的钩吻 素甲 和钩 吻素 子标 准物质 储备 溶液， 用甲 醇分别 配制成 0.1mg/mL 钩吻 素甲 和钩 吻 素子单一 标准 物质 工作 溶 液，密封 ，GA/T 2 04 保存 ， 有 效 期 6 个 月 ； 实 验 中 所 用 其 他 浓 度 的 单 一 标 准 物质工 作 溶 液 均 由 1.0mg/mL 标准 物质 溶液 用 甲醇稀 释得 到
7、； 3) 0.1mg/mL 混合 标准物 质工作 溶液 ：分 别移 取 1.0mg/mL 的 钩吻 素甲和 钩吻 素 子标准 物 质 储备溶 液， 用甲 醇配 制 成 0.1mg/mL 钩吻 素甲 和钩 吻 素子混 合标准 物质 工作 溶 液，密封 ， 04 保存 ， 有 效 期 6 个 月 ； 实 验 中 所用其他 浓 度 的 混 合 标 准 物质工 作 溶 液 均 由 1.0mg/mL 标准 物质 储备 溶 液用甲 醇稀 释得 到； 4) 1.0mg/mL 内 标 储 备 溶 液 ： 以 士 的 宁 作 为 内 标 ， 根 据 其 纯 度 和 盐 型 换 算 后 ， 用 甲 醇 配 制 1
8、.0mg/mL 内标 储备 溶液 ， 密封，-18 以下 保存 ，有 效期 12 个 月； 5) 0.1mg/mL 内 标工 作 溶 液： 移取 1.0mg/mL 的 内标 储备 溶液 ， 用甲醇 配 制成 浓度 为 0.1mg/mL 的内标 工作 溶液 ，密封，04保存， 有效期 6 个月。 实 验中 所用 其他 浓度 的内标 工 作 溶液均 由 1.0mg/mL 内标 储 备溶液 配制 得到 。 5.2 材料 材料包 括 ： a) 具盖离 心管 ； b) 具塞玻 璃试 管 ； c) 固相萃 取柱 ：Oasis HLB 柱或等 效固 相萃 取柱 。 注 ： Oasis HLB柱是Waters
9、 公司 产品的商品名称， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不是表示对该产品 的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 6 仪器 和设 备 仪器和 设备 包括 ： a) 气相色 谱- 质 谱仪 ：配 有电 子轰击 源（EI ） ； b) 振荡器 ； c) 电子天 平 ： 分度 值 d 0.01mg ； d) 离心机 ； e) 移液器 ； f) 超声仪 ； g) 浓缩器 。 7 操作 方法 7.1 定 性分 析 7.1.1 样品 前处 理 7.1.1.1 液 液萃 取 移取血 液等 液体 检材 样 品 2.0mL ， 或称 取铰 碎的 肝脏 等固体 检材 样 品 2
10、.0g 于 具 盖离心 管中 ， 用 5% 氢氧化 钠 溶 液调 pH 值大于 10 ， 加入 乙酸 乙酯 3.0mL ， 振荡 10min ，不 低于 5000r/min 离心 10min，分 离有机 相 ； 重 复提 取一 次， 合并两 次提 取的 有机 相， 置于浓 缩器 上 50 浓 缩至 干， 残留 物用 甲醇 200 L 溶解， 作为 检材 样品 提取 液，供 仪器 检测 。 注： 检材样品取样量、溶剂体积及定容体积可根据实际情况调整。 7.1.1.2 固 相萃 取 GA/T 3 移取血 液等 液体 检材 样 品 2.0mL ，或 称取 铰碎 的肝 脏 等固体 检材 样 品 2.0
11、g 于 具 盖离心 管中 ，加入 2% 的甲醇 水 溶液 6mL ， 混匀 、 振荡 10min ， 不 低于 5000r/min 离心 10min ， 取 上 清液转 移至 已活 化好 的 固相萃 取柱 中（ 使用 前依 次用甲 醇、 水进 行活 化） ，上清 液过 柱流 速不 超 过 0.5mL/min，用水 4mL 淋 洗，用 乙酸 乙酯 6mL 洗脱 ，洗脱 液过 柱流 速不 超过 0.5mL/min ， 收集 洗脱 液， 置于浓 缩器 上 50 浓缩 至干， 残留 物用 甲醇 200 L 溶 解， 作为 检材 样品 提 取液， 供仪 器检 测。 注： 检材样品取样量和 定容体积可根据
12、实际情况调整。 7.1.1.3 质控 样 品制 备 取等量 相似 基质 的空 白样 品 （ 若无 相似 基质 空白 样 品可用 血液 替代 ） 两份 于 具 盖离 心管 中 ， 一 份作 为空白 样品 ，一 份添 加标 准物质 工作 溶液 ，使 钩吻 素甲、 钩吻 素子 浓度 为 1 g/mL(g) ，作 为添 加样 品， 与检材 样品 平行 操作 ，得 到空白 样品 提取 液和 添加 样品提 取液 ，供 仪器 检测 。 7.1.2 仪器 检测 7.1.2.1 气 相色 谱- 质谱 仪 条件 以下为 参考 条件 ： a) 色谱柱 ：DB-5MS 毛细 管 色谱柱(30m0.32mm0.25m)
13、 或其他 等效 柱； 注：DB-5MS 毛细管色谱柱是 Agilent 公司产品的商品名称， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则 可使用这些等效产品。 b) 色谱柱 升温 程序 ： 100 保持 1min，以 10/min 速率 升温 至 200 ， 保持 1min ， 再以 20/min 速率升 温 至 280 ， 保持 14min ； c) 进样口 温度 ：280 ； d) 传输线 温度 ：260 ； e) 载气： 高纯 氦气 ； f) 电子轰 击能 量：70eV ； g) 离子源 温度 ：250 ； h) 扫描方 式： 全
14、扫 描（Scan ）或选 择离 子监 测（SIM ）； i) 溶剂延 迟：3min ； j) 柱流量 ：1.5mL/min ； k) 进样方 式： 分流 进样 ； l) 分流比 ：5:1 ； m) 质量范 围：40amu 450amu ； n) 定性定 量离 子： 钩吻 素甲 （m/z ，108* 、322 、279 、120） ，钩 吻素 子（m/z ，306* 、70 、120 、 223） ，士 的宁 （m/z ，334* 、120 、162 、77 ）。 注： 带* 号离子为定量离子。 7.1.2.2 进样 分别吸 取空 白溶 剂、 添加 样品提 取液 、 空 白样 品提 取液、 检材
15、 样品 提取 液、 标准物 质工 作溶 液， 按 7.1.2.1 仪器 条件 进行 检测 。进样 顺序 和进 样次 数应 确保结 果有 效。 7.2 定 量分 析 7.2.1 样品 前处 理 移取血液等液体检材样品2.0mL 两份，或称取铰 碎的 肝脏等固体检材样品2.0g 两份，按7.1.1进行 操 作，得 到检 材样 品提 取液 ，供仪 器检 测。 取与检 材样 品等 量的 相似 基质空 白样 品， 与检 材样 品 平行操 作， 得到 空白 样品 提 取液， 供仪 器检 测。 GA/T 4 单点校 正法 ： 取与 检材 样 品等量 的相 似基 质空 白样 品两份 ， 添加 钩吻 素甲 、
16、钩吻素 子 标 准物 质工 作 溶液 （采 用内 标法 时， 在 判定检 材样 品中 士的 宁为 阴性的 前提 下 ， 检 材样 品 和添加 样品 中分 别添 加内 标 士的宁2g ） ，作 为添 加样 品，与 检材 样品 平行 操作 ，得到 添加 样品 提取 液， 供仪器 检测 。添 加样 品中 目标物 含量 应 在 检材 样品 中目标 物含 量的 （100 50 ）% 范 围内 。 校准曲 线法 ： 取与 检材 样 品等量 的相 似基 质空 白样 品， 添加 钩吻 素甲 、 钩 吻 素子标 准物 质工 作溶 液 （采用 内标 法时 ， 在 判定 检材样 品中 士的 宁为 阴性 的前提 下，
17、 检材 样品 和添 加样品 中分 别添 加内 标士 的 宁） ， 配制成浓度在0.2 g/mL20 g/mL 范围 内的添加样品 ，与检材样品 平行操作， 得到添加样品 提取 液，供 仪器 检测 。 校准曲 线应不 少于6 个浓度 点（包 括空白 样品 ）。检 材样品 中目标 物的 含量应 在校准 曲线的 线性 范 围内。 7.2.2 仪器 检测 7.2.2.1 仪 器条 件 同 7.1.2.1 。 7.2.2.2 进样 分别吸 取检 材样 品提 取液 、 空白 样品 提取液 、 添 加 样品提 取液 ， 按7.1.2.1 仪 器条件 进样 分析。 （若 采用内 标法 ，还 应进 样内 标工作
18、 溶液 ）。 每份 检材 样品提 取液 和添 加样 品提 取液各 进样 分析23 次。 7.2.3 计算 7.2.3.1 计 算含 量 7.2.3.1.1 内标-校 准曲 线 法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物和 内标的 保留 时间 和峰 面积 ， 以添加 样品 提取 液中 目 标 物与 内 标物 的 峰面 积比 的 平均 值 为纵 坐 标、 添加 样 品提 取 液中 目 标物 的含 量 为横 坐 标进 行 线性 回 归 ，得到线 性方程 。根据检 材样品提 取液中 目标物及 内标的峰 面积值 ，按公式(1) 计 算出检 材样品中 目 标物的 含量 。 a b y
19、 = . (1) 式中 ： 检 材样 品中 目标 物的 含量； y 检 材样 品提 取液 中目 标 物与内 标物 的峰 面积 比的 平均值 ； a 线性方 程的 斜率 ； b 线 性方 程的 截距 。 7.2.3.1.2 内标-单 点校 正 法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物和 内标的 保留 时间 和峰 面积 值，按 公式 （2 ）计 算 检材样 品中 目标 物的 含量 。 Ai A Ai A = . (2) 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； A检 材样品 提取 液 中目标 物的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液 中目 标物 的峰 面
20、积 的平 均值 ； GA/T 5 Ai 检材 样品 提取 液 中内 标物 的峰 面积 的平 均值 ； Ai添 加样 品 提 取液 中内 标物的 峰面 积的平 均值 ； 添 加样 品中 目标 物的 含量。 7.2.3.1.3 外标-校 准曲 线 法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保留时 间和 峰面 积值 ， 以 添 加样品 提取 液中 目标 物 的 峰面 积 的平 均 值为 纵坐 标 、 添 加 样品 提 取液 中 目 标 物的 含 量为 横 坐标 进行 线 性回 归 ，得 到 线性 方 程。根 据检 材样 品提 取液 中目标 物的 峰面 积值 ，按 公式 （3
21、） 计算 出检 材样 品 中目标 物的 含量 。 a b y = . (3) 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量; y 检 材样 品提 取液 中目 标 物的峰 面积 的平 均值 ； a 线 性方 程的 斜率 ； b 线 性方 程的 截距 。 7.2.3.1.4 外标-单 点校 正 法 记录检 材样 品提 取液 和添 加样品 提取 液中 目标 物的 保留时 间和 峰面 积值 ，按 公式（4） 计算 检材 样 品中目 标物 的含量 。 A A = . (4) 式中： 检 材样 品中 目标 物的 含量； A检 材样品 提取 液 中目标 物的 峰面 积 的 平均 值 ； A 添加 样品 提取 液
22、 中目 标物 的峰 面积 的平 均值 ； 添加 样品 中目 标物的 含量 。 7.2.3.2 计 算相 对相 差 记录 7.2.3.1 中 计算 得到 的 检材样 品中 目标 物的 含量 ， 按公 式 （5） 计算 相对 相 差： % RD 100 2 1 = . (5) 式中： RD相 对相 差， 用百 分比 （% ） 表示 ； 1 、 2 两份 检材 样品 中 目标物 的含 量； X 两份 检材 样品 中目 标物 含量的 平均 值。 8 结果 评价 8.1 定性 结果 评价 8.1.1 阳 性结 果评 价 在相同 条件 下进 行样 品测 定时， 检材 样品 中目 标物 的色谱 峰保 留时
23、间 与 标准 物质工 作溶 液一 致 （ 相 对误差在 1% 之内 ） ，且在 扣除背景后的检材样 品质 谱图中，目标物质谱 特征 离子与标准物质工作 溶液 一致 ， 特 征离 子丰 度比 与 浓度接 近的 标准 物质 工作 溶液相 比 ， 相 对偏 差不 超 过表 1 规定 的范 围 ， 空 白 样 GA/T 6 品无干 扰， 则可 判断 检材 样品中 检出 目标 物。 表 1 特征 离子 丰度 比的 最大允 许相对 偏 差范 围 特征离子丰度比 50% 20% 50% 10% 20% 10% 最大允许偏差范围 10% 15% 20% 50% 8.1.2 阴 性结 果评 价 检材样 品未 出
24、现 与目 标物 标准物 质工 作溶 液一 致的 色谱峰 ， 且 添加 样品 中出 现 与目标 物标 准物 质工 作溶液 一致 的色 谱峰 ，空 白样品 无干 扰， 则可 判断 检材样 品中 未检 出目 标物 。 8.2 定量 结果 评价 检材样 品中 目标 物含 量的RD20% ， 定 量数 据可 靠 ， 其含量 按两 份检 材的 平均 值计算 。 检 材样 品中 目标物 含量 的RD 20% ， 定量数 据不 可靠 ，应按7.2 重新提 取检 验。 相关 资 料、 实验 数据 及谱 图参见 附录A 和B 。 GA/T 7 附录 A （资料 性 ） 钩吻生 物碱 的 相 关信 息 钩吻素 甲、
25、 钩吻 素子 的相 关信息 参见 表A.1 。 表A.1 钩吻 素甲 、钩 吻素 子的相 关信 息 编号 中文名称 CAS 编号 英文名称 分子式 1 钩吻素甲 509-15-9 gelsemine C20H22N2O2 2 钩吻素子 1358-76-5 koumine C20H22N2O GA/T 8 附录 B （资料 性 ） 钩吻素 甲、 钩吻 素子 和士 的宁 的 相关 谱图 B.1 钩吻 素甲 、钩 吻素 子 和士的 宁的 相关 谱图 钩吻素 甲、 钩吻 素子 和士 的宁的 相关 谱图 见 图 B.1 图 B.4 。 说明： 1 钩 吻素 甲（17.82min）； 2 钩 吻素 子（1
26、6.66min）； 3 士 的宁 （22.28min）。 图 B.1 钩 吻素 甲、 钩吻 素 子和士 的宁的 GC-MS 总离 子流图 图 B.2 钩 吻素 甲的 GC-MS 质谱 图 GA/T 9 图 B.3 钩 吻素 子的 GC-MS 质谱 图 图 B.4 士 的宁 的 GC-MS 质谱图 B.2 方法 检出 限和 定量 限 生物检 材中 钩吻 素甲 、钩 吻素子 的检 出限 、定 量限 见表 B.1 。 表B.1 生 物 检材中 钩吻 素甲 、钩 吻素 子的检 出限 、定 量限 单位为纳克每克或纳克每毫升 基质 化合物名称 检出限 定量限 SCAN 模式 SIM 模式 SCAN 模式 SIM 模式 尿液 钩吻素甲 50 25 200 100 钩吻素子 50 25 200 100 血液 钩吻素甲 50 50 200 100 钩吻素子 75 50 200 100 肝脏 钩吻素甲 500 300 2000 1000 钩吻素子 800 500 2000 2000 _
