1、ICS65.020.01 CCS B163 中华人民共和国检验检疫行业标准 SN/T53922021 苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Neofabraea malicorticis,Neofabraea perennans, Neofabraea vagabunda,Neofabraea kienholzii 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及
2、专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国广州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国黄埔海关、 中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人:王卫芳、易建平、魏霜、林慧娇、吕文刚、吴品珊。 SN/T53922021 苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定方法。 本文件适用于进境苹果和梨等寄主果实、植株中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件比不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不
3、注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 SN / T 2455 进出境水果检验检疫规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 苹果牛眼果腐病菌的基本信息 4.1 病菌种类 4.1.1 腐皮明孢盘菌 学名:Neofabraea malicorticis( Cordle y ) H.S. Jacks. ( 1913 );异名:Pezicula malicorticis( H.S. Jacks. ) Nannf. ( 1932 )(苹果树炭疽病菌);无性型:Cryptosporiopsis curvispora( Peck ) Gremmen ( 1959
4、)。 4.1.2 多年生明孢盘菌 学名:Neofabraea perennans Kienholz( 1939 );无性型:Cryptosporiopsis perennans( Zeller 异名:Neofabraea alba( E.J. Guthrie ) Verkle y ( 1999 );无性型:Phlyctema vagabunda Desm. ( 1847 )。 4.1.4 金氏明孢盘菌 学名:Neofabraea kienholzii( Seifert , S p otts无 性型:Cryptosporiopsis kienholzii Seifert , S p otts 分
5、生孢子有大小2 种类型。大分生孢子无色透明,单细胞,培养时偶有 2胞3胞,长椭圆形,一 端稍小,成熟后有数个细小油球,有时中部有一明显的大油球,N. malicorticis的大分生孢子较弯曲呈 镰刀状至U形,而N. perennans,N. vagabunda和N. kienholzii的分生孢子多数直或稍弯;小分生 孢子无色透明,单细胞,长椭圆形,分生孢子两端各有一个较大的油球种间分子孢子形态差异参见图 B.2b ) h ),附录E 。 9.3 有性型形态 有性型非常少见,故该项为参考特征。在发病的枝梢枝干等自然基质上形成,一般在旧分生孢子盘 的子座中产生。子囊盘0.5 mm1 mm ,直
6、接附着于分生孢子座基部,颜色为灰色到肉色,无柄(偶有 短柄);子囊棒状、无盖、基部肉茎很短。子囊孢子8个,无色透明,壁薄,单细胞,椭圆形。随着孢子老 熟,子囊孢子变为1隔5隔,子囊孢子壁逐渐增厚,颜色变为淡褐色。除N. kienholzii外,N. mal- icorticis,N. perennans,N. vagabunda均已发现有性型种间子囊和子囊孢子形态差异参见 图B.2i ) j ),附录E 。 9.4 致病性测定 该项为首次截获时采用。接种果实产生与苹果牛眼果腐病一致的症状,接种 5 d后,在供试的苹果和 鸭梨的接种部位均出现较小的浅褐色病斑,果肉组织软化变褐腐烂;接种后10 d
7、 ,果肉组织腐烂面积扩大, 在腐烂组织表面可见少量乳白色胶质状分生孢子盘接种后发病的症状参见图B.2d ) e )。从发病果实 再次分离到的菌株与供试菌株的培养特性及形态特征一致。 4 SN/T53922021 9.5 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测阈值确定、质控标准及与结果分析按照D.6执行。 10 结果判定 如果病部有明显的病状和病征,经直接检验,病菌的形态特征与鉴定指标9.2或9.29.3吻合;或 如果病部有病状但无病征,经保湿培养和/或分离培养所产生的病菌培养性状及形态特征与鉴定指标 9.19.2或9.19.3吻合,判定为苹果牛眼果腐病菌;结合实时荧光PCR检测结果,判定苹果牛
8、眼果 腐病菌的具体种类为Neofabraea malicorticis,N. perennans,N. vagabunda和N. kienholzii的其 中之一(判断指标按照D.6执行)。 11 菌种保藏 病菌分离物要标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人,在含20%甘油的冻存管中于-80保存,或 将菌株转接在PDA斜面上培养,置于4 下保存,并定期转管。保存期满后,需经灭菌处理。 12 资料保存 妥善保存检验资料,以备复验、谈判和仲裁。检验报告应注明检验日期、方法、结果等,并有检验人 签名。检验图片包括症状、病菌培养性状和形态特征图片及实时荧光PCR扩增曲线图等。 5 SN/T5392202
9、1 附 录 A (资料性) 苹果牛眼果腐病菌的寄主范围、地理分布、侵染传播、症状特点 A.1 寄主范围 A.1.1 Neofabraea malicorticis和Neofabraea perennans 苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、榅桲(Cydonia oblonga)、桃(Prunus persica)、杏(P. armeniaca)、 日本木瓜(Chaenomeles japonica)、山楂(Crataegus s pp . )、花楸(Sorbus s pp . )、唐棣(Amelanchier s pp . )、玫瑰(Rosa s pp . )等蔷薇科植物。 A.1.2
10、 Neofabraea vagabunda 苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、油橄榄(Olea europaea)、白蜡树属(Fraxinus)、卫矛属(Euony- mus)、悬钩子属(Rubus)、接骨木属(Sambucus)、乌头属(Aconitum)、飞蓬属(Erigeron)以及绒毛草 (Holcus lanatus)。 A.1.3 Neofabraea Kienholzii 苹果属(Malus)、梨(Pyrus communis)。 A.2 地理分布 A.2.1 Neofabraea malicorticis 北美西部、欧洲(丹麦,荷兰,葡萄牙等)、新西兰。 A.2.2 N
11、eofabraea perennans 北美西部、欧洲(荷兰、德国、英国、丹麦和捷克等)、澳洲。 A.2.3 Neofabraea vagabunda 欧洲大陆(英国、塞尔维亚、波兰、瑞士、丹麦、捷克、瑞典、挪威、德国、意大利、立陶宛、法国)、澳洲、 新西兰、智利、南非、北美东部。 A.2.4 Neofabraea kienholzii 葡萄牙、加拿大、美国俄勒冈州南部、华盛顿州中北部和澳大利亚。 A.3 侵染传播 苹果牛眼果腐病菌为害果实、枝条和树干,导致果实腐烂,造成树皮溃疡、枝条枯死,甚至幼树死亡。 苹果、梨采收后,病菌在果实中潜伏,一般在水果低温冷藏3个月4个月发病,发病较重的年份,在
12、北 美苹果和梨产区的采后果实腐烂率40% 。果园中,病菌主要通过雨水和灌溉水的泼溅传播,远距离传 播则通过水果贸易和种苗移植。 6 SN/T53922021 A.4 症状特点 A.4.1 果实症状 Neofabraea malicorticis,N. perennans,N. vagabunda和N. kienholzii在果实上为害症状基 本相似,可发生在果梗凹部、果萼凹部和果实表面。病斑圆形,扁平至轻微下陷,中央部位色浅,呈浅褐 色、黄褐色至棕褐色,边缘明显呈棕黑色,形似牛眼状,直径1 cm2.5 cm ,甚至更大。病斑表面可见稀 疏的白色菌丝体、奶油色胶质状分生孢子盘。病斑组织腐烂,较坚
13、硬,与健康组织相连。 A.4.2 枝条症状 苹果树、梨树的幼枝、大枝,甚至幼树的主干被侵染后,初期呈现浅红褐色、紫红色的小圆点,逐渐发 展形成橘红色或橘褐色椭圆形凹陷病斑,形成小溃疡,后期病、健康组织之间出现裂纹。夏季在裂纹处 呈现大量裂开的、奶油色的分生孢子盘。溃疡病斑最终裂开甚至脱落,露出木质部或纵向韧皮纤维,呈 现“提琴弦”状的外观。多个病斑愈合常导致树干环割致使幼树、枝条死亡。病菌可在树皮死组织中存 活2年3年并产生大量的分生孢子,而有性型较少见。N. perennans侵染形成多年生溃疡,发病特 征是环绕伤口形成重叠的同心环状愈伤组织,称为苹果树多年生溃疡病,而N. malicort
14、icis在树皮上 形成的溃疡没有愈伤组织的同心圆,称为苹果树炭疽病。N. vagabunda在苹果和梨造成叶片炭疽和 细枝溃疡症状,在白蜡树树皮上导致硬币状溃疡病斑。N. kienholzii对枝条的为害尚不清楚,但人工 接种时可使枝条发生溃疡。 7 SN/T53922021 附 录 B (资料性) 苹果牛眼果腐病菌的为害症状、形态特征及培养性状图 见图B.1图B.2 。 a) 苹果牛眼果腐病病果1 b) 苹果牛眼果腐病病果2 c) 苹果牛眼果腐病病果3 d) 富士苹果接种Neofabraea perennans 10 d 后的症状(左:发病果,右:对照果) e) 鸭梨接种Neofabraea
15、 perennans 10 d 后的症状(左:发病果,右:对照果) f) N. malicorticis 引起的枝条症状 初期症状 g) N. malicorticis 引起的枝条症状 树皮组织坏死 h) N. malicorticis 引起的枝条症状 溃疡部位的“提琴弦”状外观 i) N.perennans 引起的枝条症状 树皮坏死 j) N.perennans 引起的枝条症状 溃疡 注: 图片 a ) e ),引自王卫芳等, 2016 ;图f ) j ),引自Jones , A.L. and H.S. Aldwinkle , 1990 。 B.1 苹果牛眼果腐病菌所致的症状图 8 SN/T
16、53922021 a) Neofabraea perennans 菌落、分子孢子盘 b) Neofabraea perennans 分生孢子梗 c) Neofabraea perennans 产孢细胞 d) N. perennans 大、小分生孢子 e) N. kienholzii 大、小分生孢子 f) N. vagabunda 大、小分生孢子 g) N. malicorticis 大分生孢子手绘图 h) N. perennans 大分生孢子手绘图 i) N. perennans 子囊孢子 j) N. perennans 子囊 注: 图 a ) e )引自王卫芳, 2016 ;图f )引自罗家
17、风, 2012 ;图g ) h )引自J.R.Kienholz , 1939 ;图i ) j )引自G. J. M . Verkle y , 1999 。标尺:图b ): 20 m , 图 c ) f )及i ): 10 m ,图片j ): 25 m 。 B.2 苹果牛眼果腐菌形态特征图 9 SN/T53922021 附 录 C (规范性) DNA制备 C.1 样品前处理 分离物转接到PDA平板上,于20 黑暗下培养7 d ,从菌落上刮取菌丝体;或从可疑病果、苗木、枝 条枝干切取发病的组织块,液氮研磨成粉末后装入1.5 mL离心管中备用。 C.2 CTAB法提取DNA 称取100 m g经研磨
18、的粉末样品,加入570 L2% CTAB DNA提取液, 30 L10% SDS 溶液, 65 水浴30 min ,加入600 L酚三氯甲烷液(酚三氯甲烷异戊醇为25241 )抽提2次, 11 000 g常 温离心5 min ,取上清,加入1 / 10体积3 mol / L醋酸钠溶液和2倍体积无水乙醇或加入等体积的异丙 醇混匀, 11 000 g 4 离心10 min ,弃上清,沿离心管壁加入1 mL70%乙醇清洗DNA沉淀, 11 000 g 4 离心5 min ,弃上清,加入40 LTris-EDTA缓冲液溶解,作为扩增模板待检。 C.3 试剂盒提取DNA 选用适合真菌基因组DNA提取的商
19、业化试剂盒,按照试剂盒说明书操作提取DNA 。 01 SN/T53922021 附 录 D (规范性) 实时荧光PCR检测 D.1 引物和探针 引物和探针见表D.1 。 表D.1 引物和探针序列及其检测目标 引物/探针序列( 5 -3 )检测目标 Neo F ccctc gg t gggg caaa g Neo R ccaactc gg c gg cttcc N. malicorticis N. perennans N. vagabunda N. kienholzii MAL-P FAM-aacattaacattttcatcatcatt-MGBN. malicorticis PER-P CY5
20、-c g c g tatc g caacatcatcattttcatcat-BHQ2N. perennans ALB-P NED-aa g at g ttcaacccctccctc g c g ta-BHQ1N. vagabunda KIE-P HEX-t g accactt g at g atctc-MGBN. kienholzii 注: N.=Neofabraea D.2 加样 制备实时荧光PCR反应液,反应体系为20 L (见表D.2 )。每个反应体系设立阳性对照、阴性和空 白对照,阳性对照模板为拟检测目标相对应种(N. malicorticis,N. perennans,N. vaga
21、bunda和N. kienholzii)阳性菌株的DNA ,阴性对照为不含苹果牛眼病菌的DNA ,空白对照为无DNA酶的双蒸水。 如果采用单重探针检测,在反应液中加入拟检测目标相对应种的探针。如果采用4种探针混合检测,则 在在反应液中同时加入4种探针。 表D.2 实时荧光PCR反应体系(20 L) 反应成分 体积/ L 单一探针混合探针 2Thunderbird Probe q PCR Mix a 10 10 10 mol / L上游引物1 1 10 mol / L上游引物1 1 5 mol / L探针1 1 待检样品DNA ( 10 n g 100 n g ) 1每种探针各1 无菌水6 L
22、2 L a给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的强制使用。如果其他同类产品具有相同的效 果,也可选择使用等效产品。 11 SN/T53922021 D.3 扩增反应程序 设置扩增反应程序为: 95 预变性10 min ; 95 15 s , 60 1 min , 40个循环。读取Ct值。以Ct 35作为阳性标准阈值。 D.4 阈值确定 以荧光PCR反应的前3个15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,以本底信号标准差的10倍 作为荧光阈值,以样品扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所产生的循环数为循环阈值( Ct值)。应根 据实际情况调整基线范围,以基线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的
23、最高点为准。 D.5 质控标准 阴性对照及空白对照应无扩增曲线。 阳性对照的Ct值应1728以内,并有明显的扩增曲线。 D.6 结果判定 在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下,则: a ) FAM通道荧光信号的增加呈典型的S形扩增曲线,且Ct值35 ,判定苹果牛眼果腐病菌种类 为N. malicorticis(腐皮明孢盘菌)荧光PCR阳性;检测Ct值3640 ,再次测试,如Ct值仍 为3640 ,判定检测结果为N. malicorticis阴性。 b ) CY5通道荧光信号的增加呈典型的S形扩增曲线,且Ct值35 ,判定苹果牛眼果腐病菌种类 为N. perennans(多年生明孢盘
24、菌)荧光PCR阳性;检测Ct值3640 ,再次测试,如Ct值仍 为3640 ,判定检测结果N. perennans阴性。 c ) NED通道荧光信号的增加呈典型的S形扩增曲线,且Ct值35 ,判定苹果牛眼果腐病菌种类 为N. vagabunda(白明孢盘菌)荧光PCR阳性;检测Ct值3640 ,再次测试,如Ct值仍为36 40 ,判定检测结果N. vagabunda阴性。 d ) HEX通道荧光信号的增加呈典型的S形扩增曲线,且Ct值35 ,判定苹果牛眼果腐病菌种类 为N. kienholzii(金氏明孢盘菌)荧光PCR阳性;检测Ct值3640 ,再次测试,如Ct值仍为 3640 ,判定检测结
25、果N. kienholzii阴性。 21 SN/T53922021 附 录 E (资料性) 苹果牛眼果腐病菌种间的形态差异 形态比较见表E.1 。 表E.1 苹果牛眼果腐病菌种间的形态比较 单位为微米 中文名腐皮明孢盘菌多年生明孢盘菌白明孢盘菌金氏明孢盘菌 有性型N.malicorticisN. perennansN. vagabundaN. kienholzii 无性型C. curvisporaC. perennansPhlyctema vagabundaC.kienholzii 大分生孢子 镰刀形至U形, 较弯曲 ( 1535 ) ( 36 ) a 长椭圆形, 多数直或稍弯曲 ( 1225
26、 ) ( 36 ) a 长椭圆形,较瘦长, 直至略弯 ( 1730 ) ( 2.53.5 ) a 长椭圆形,多数直, 个别稍弯曲 ( 1217.5 ) ( 2.53.5 ) b 小分生孢子 长椭圆形 5-8 ( -13 ) 1-1.5 a 长椭圆形 ( 610 ) ( 1.53 ) a 长椭圆形 ( 1518 ) ( 0.51 ) a 长椭圆形 ( 2.56.5 ) ( 1.52.5 ) b 子囊( 75150 ) ( 1020 ) a ( 86170 ) ( 814 ) a ( 125150 ) ( 1324 ) a尚未发现b 子囊孢子( 12.526 ) ( 59 ) a ( 11.522
27、.5 ) ( 48.5 ) a ( 2030 ) ( 710 ) a尚未发现b a Verkle y , 1999 ; b S p ottset al., 2009 ;N.=Neofabraea,C.=Cryptosporiopsis。 31 SN/T53922021 1 2 0 2 2 9 3 5 T/ N S 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 苹果牛眼果腐病菌检疫鉴定方法 SN / T 5392 2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号( 100023 ) 编辑部:( 010 ) 65194242-7531 网址 / book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8801230 1 / 16 印张1.25 字数32千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数 1 500 * 书号: 155175 677 定价20.00元
