1、ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53912021 苹果溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Leucostoma cincta ( Fr.:Fr.) Hohn 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国青岛海关、中国科学院微生物研究所、 中国检验
2、检疫科学研究院。 本文件主要起草人:段维军、王英超、郭立新、蔡磊、刘芳、赵鹏、张慧丽、李雪莲、陈先锋、张永江。 SN/T53912021 苹果溃疡病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了植物检疫中苹果溃疡病菌Leucostoma cincta( Fr. : Fr. ) Hohn. 的检疫鉴定方法。 本文件适用于进境苹果及相关植物产品携带的苹果溃疡病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 基本信息 中文名:苹果溃疡病菌。 学名:Leucostoma cincta( Fr. : Fr. ) Hohn. 。 分类地位:苹果
3、溃疡病菌属真菌界Fun g i 、子囊菌门Ascom y cota 、粪壳菌纲Sordariom y cetes 、间座 壳菌目Dia p orthales 、黑腐皮壳菌科Valsaceae 、白座壳属Leucostoma。 近似种:核果黑腐皮壳菌Leucostoma persoonii( Nitschke ) Hhn等。 5 鉴定原理 根据苹果溃疡病菌在寄主上的症状特点、培养及形态特征(参见附录A )、 ITS序列特征作为鉴定 依据。 6 检测流程 检测流程见图1 。 1 SN/T53912021 图1 检测流程 7 仪器和用具 7.1 仪器 显微镜、光照生物培养箱、高压灭菌器、超净工作台、
4、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微 量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器( 0.5 L 、 2.5 L 、 10 L 、 20 L 、 200 L 、 1 000 L )、常规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、 DNA提取仪。 7.2 用具 滤纸、手持放大镜、培养皿、烧杯、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯。 8 试剂和培养基 8.1 试剂 购置如下试剂或者相应的试剂盒:乙二胺四乙酸钠盐( Na 2 EDTA 2H 2 O )、氢氧化钠( NaOH )、 Tris碱、浓盐酸( HCl )、溴化十六烷基三甲铵( CTAB )、氯化钠( NaCl )
5、、聚乙烯吡咯烷酮( PVP )、冰醋酸 ( CH 3 COOH )、蒸馏水、三氯甲烷( CHCl 3 )、异戊醇( C 5 H 12 O )、 70%乙醇( C 2 H 6 O )、次氯酸钠( NaClO )、 2%氢氧化钾( KOH )。 PCR和电泳检测所需试剂: 10PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸( dNTPs )、Taq聚合酶、引物 (参见附录B )、超纯水、 DL2 000 Marker 、琼脂糖、 GelRed核酸凝胶染料。 8.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基( PDA ):马铃薯200 g ,葡萄糖20 g ,琼脂20 g ,水1 000 mL 。 9 鉴定方法 9.1 症
6、状检查 观察有无苹果溃疡病菌的可疑症状(参见附录A ),如流胶、溃疡、枝枯等。如发现可疑症状,取受害 部位进行分离培养。 2 SN/T53912021 9.2 分离培养 将坏死和健康交界处发病枝干剪成1 mm 2 2 mm 2的小块,浸没在0.5%次氯酸钠溶液中消毒 90 s后,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干水分后放置在PDA培养基上,将平皿放置在18 20 培养 箱中培养。 分离纯化获得疑似菌株后,对菌株进行每天16 h荧光(波长330 nm400 nm )照射8 h黑暗处理 培养, 5 d后每天观察记录菌落特征,并在显微镜下观察分生孢子等形态特征。 9.3 直接观察 挑取发病枝条等部位,将病
7、健交界处组织切成薄片后用2%氢氧化钾液体煮沸2 min3 min ,制片 在显微镜下观察子囊壳或分生孢子座等微观形态特征。 9.4 菌丝体DNA制备 采用基因组提取试剂盒制备DNA ,或采用改良的CTA B提取法(参见附录B )。 9.5 序列扩增测序 利用通用引物对ITS片段进行扩增测序(按照附录C ),测定序列后,将序列在GenBank数据库进 行比对,与GenBank数据库中苹果溃疡病菌ITS片段序列相似性进行比对分析。 9.6 致病性测定 选取纯培养菌落,用打孔器打菌饼,备用;选取健康苹果枝条,用灭菌手术刀在枝干表面刮皮制造 5 mm2 mm左右大小的伤口,将打取菌饼菌丝面向下贴置在枝
8、干上,用灭菌水浸湿脱脂棉敷于其上, 以无菌菌饼为对照,将接种枝干套置塑料袋进行48 h保湿后,放置在25 温室条件下培养,接种后每 天观察一次发病情况。 致病性测定仅在首次检出时进行,常规检出可不进行致病性测定。 10 形态学鉴定特征 10.1 菌落特征 苹果溃疡病菌在PDA培养基上生长菌落边缘不规则,培养初期菌落白色,培养1周2周后,菌落 颜色由白色转为浅黄色或橄榄色,底部颜色不均匀。近似种核果黑腐皮壳菌Leucostoma persoonii在 PDA培养基上培养1周2周后,菌落颜色通常由白色变为褐色或黑色。 10.2 形态学特征 分生孢子座可在培养基上产生,黑色,很少单独存在,直径( 1
9、3 ) mm 。分生孢子形态简单,透明, 肾形至椭圆形,大小( 1 m2 m ) ( 5 m7 m )。 子囊壳难以培养获得,直径( 200 m350 m ),子囊棍棒状,大小( 7 m12 m ) ( 14 m 70 m ),内含8个子囊孢子,大小( 2 m3 m ) ( 14 m22 m )。 10.3 致病性测定 接种的枝干产生9.1中描述的症状。 3 SN/T53912021 11 结果判定 疑似分离物的菌落和形态特征与10.1和10.2相符,且ITS序列与GenBank中苹果溃疡病菌ITS 序列相似性大于99% ,判定为检出苹果溃疡病菌Leucostoma cincta( Fr. :
10、 Fr. ) Hohn 。 否则判定未检出苹果溃疡病菌。 实验室首次检出时需进行致病性测定工作。 12 菌种保藏 将菌株转接在PDA斜面上培养,待菌丝体长满斜面后,置于4 下保存,并定期( 180 d )转管,标注 分离物来源、寄主、分离时间、鉴定人。 13 检验资料的保存 妥善保存检验报告包括症状、病菌、形态特征宏观以及微观图像等图文资料,以备复验、谈判和仲 裁。检验报告必须注明检验日期、方法、结果等,并有检验人签名。 4 SN/T53912021 附 录 A (资料性) 苹果溃疡病菌的相关信息 A.1 地理分布 欧洲:意大利、瑞士、德国、俄罗斯。 亚洲:日本、伊朗。 北美洲:加拿大、美国。
11、 A.2 主要寄主 苹果Malus pumila、甜樱桃Prunus avium、桃Amygdalus persica、李子Prunus salicina、杏Ar- meniaca vulgaris等木本植物。 A.3 症状特点 病菌侵染幼嫩枝干时,会在幼嫩枝干处造成部分组织下陷,形成或明或暗的同心轮纹。在苹果树病 枝基部形成大的卵圆形至椭圆形的病斑,逐渐扩大,直至把主干完全环绕一周,可导致侧枝、主干乃至整 棵树的死亡。树皮潮湿时,易看到活跃病斑边缘皮色不同,变黑或脱色,枝条凹陷或破裂(见图A.1 )。 a) 幼嫩枝干症状 b) 成熟枝干症状 注: 图片引自Bi gg s , A.R. and
12、 G.G. Grove. 2005 。 图A.1 苹果溃疡病菌症状示意图 甜樱桃受到侵染后,表现为树枝枝叶枯萎,树皮内部溃疡,形成胶状物。通过树皮裂缝和皮孔流胶, 生长势衰弱。溃疡多产生于剪枝伤口,由于剪枝伤口一般位于树型的关键部位,因此剪枝处的侵染非常 严重。 A.4 形态特征 苹果溃疡病菌与相近种L.persoonii在形态上很难区分,然而在PDA培养基上能够通过菌落颜色 进行区分。 L.persoonii在PDA培养基上菌落颜色由白色变为褐色或黑色。同时, L.persoonii的分生 孢子座较小,直径小于1 mm ,成熟时候具有烧杯状暗色触毛。见图A.2 、图A.3 。 5 SN/T5
13、3912021 a) 正面 b) 反面 注: 以上图中菌株来自ATCC 64877Leucostoma cincta,段维军摄。 图A.2 苹果溃疡病菌在PDA培养基上(7 d)菌落形态示意图 a) 分生孢子梗 b) 分生孢子 注: 以上图中菌株来自ATCC 64877Leucostoma cincta,段维军摄。 图A.3 苹果溃疡病菌分生孢子梗和分生孢子Bar=10 m A.5 传播途径 病菌主要是通过繁殖材料和病株残枝等进行传播,从伤口侵染寄主,病菌在病残体中可存活数年。 6 SN/T53912021 附 录 B (资料性) DNA提取方法 B.1 DNA提取方法 B.1.1 取适量菌丝
14、体( 500 m g )和灭菌的玻璃珠放在2 mL离心管中,加入500 L 2CTAB ( 60 ), 置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁,水浴保温30 min60 min ,偶尔振荡混匀。 B.1.2 加入500 L ( 11 ,等体积)三氯甲烷/异戊醇( 241 ),混合均匀后( 3 min ), 12 000 r / min ,离心 15 min 。 B.1.3 提取上清液,加入250 L ( 11 ,等体积)三氯甲烷/异戊醇( 241 ), 12 000 r / min ,离心15 min ; 重复此步骤一次。 B.1.4 提取上清液,加入等体积异丙醇,混匀,沉淀30 min 。 B.1.
15、5 出现沉淀后, 12 000 r / min离心10 min 。 B.1.6 弃去液相,加入400 L70%乙醇,振荡洗涤,再12 000 r / min离心5 min ;重复此步骤一次。 B.1.7 弃去液相,超净工作台中干燥DNA ,约20 min 。 B.1.8 加入50 L或100 L双蒸水(视情况而定)溶解DNA样品,将样品于-20 保存备用。 B.2 DNA纯度与浓度的测定 用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度,分别取得260 nm和280 nm处的吸收值,计算核 酸的纯度和浓度,计算公式如下: DNA纯度=OD 260 / OD 280 DNA浓度=50OD 260 g
16、/ mL PCR级DNA溶液的OD 260 / OD 280比值应为1.71.9 。 7 SN/T53912021 附 录 C (规范性) ITS片段PCR扩增方法 C.1 引物序列 引物序列详见表C.1 。 表C.1 扩增引物 目标基因引物序列扩增片段 ITS ITS1 : 5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS4 : 5 -TCCTCCGCTTATTGATATGC 616 b p左右 C.2 PCR反应体系及参数 C.2.1 PCR反应体系 PCR反应体系详见表C.2 。 表C.2 PCR反应体系(以25 L为例) 成分体积/ L dNTP 混合物(各 10 mmol / m
17、L ) 0.3 10PCR缓冲液(含M g 2+ ) 2.5 ITS1 ( 10 mol / L ) 1.0 ITS4 ( 10 mol / L ) 1.0 Ta q DNA聚合酶( 5 U / L ) 0.2 DNA模板1.0 ddH 2 O 19.0 C.2.2 PCR反应程序 PCR反应程序详见表C.3 。 8 SN/T53912021 表C.3 PCR反应程序(适用基因ITS) 步骤反应温度/ 时间循环数 预变性94 5 min 变性94 30 s 退火52 30 s 延伸72 1 min 35 延伸72 10 min C.2.3 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 阴性对照:以健康苹
18、果枝条DNA为阴性对照。 阳性对照:以苹果溃疡病菌总DNA为阳性对照。 空白对照:以灭菌去离子水代替DNA模板。 C.3 测序 将上述PCR产物进行序列测定,与GenBank中已知序列进行比对。 9 SN/T53912021 参 考 文 献 1 Bertrand , P. F. and H. En g lish. 1976. Release and dis p ersal of conidia and ascos p ores of Valsa leucostoma. Ph y to p atholo gy 66 : 987-991. 2 Bi gg s , A. R. 1989. Inte
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