1、ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53892021 香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofMycosphaerellamusicolaR.LeachexJ.L.Mulder 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法 SN/T53892021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号(100023) 编辑部:(010)65194242-7531 网址 中国标准出版
2、社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本88012301/16 印张0.75 字数21千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数1500 * 书号:155175682 定价12.00元 前 言 本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国乌鲁木齐海关、中国科学院微生物研究所、广西科学院。 本文件主要起草人:张祥林、蔡磊、王翀、赵鹏、刘芳、刁永朝、李典鹏、史向向。 SN/T53892021 香蕉黄条叶斑病菌检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了香蕉黄条叶斑病菌Myc
3、osphaerellamusicolaR.LeachexJ.L.Mulder的检疫鉴定 方法。 本文件适用于香蕉属的植物及相关寄主植物的种苗、其他繁殖材料及其产品(尤其是果实)中香蕉 黄条叶斑病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 香蕉黄条叶斑病菌基本信息 中文名:香蕉黄条叶斑病菌、香蕉假尾孢菌 学名:MycosphaerellamusicolaR.LeachexJ.L.Mulder,Mycol.Pap.140:148.1976. 无性阶段:Pseudocercosporamusae(Zimm.)Deighton
4、分类地位:香蕉黄条叶斑病菌隶属于真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),座囊菌纲(Dothideo- mycetes),煤炱目(Capnodiales),球腔菌科(Mycosphaerellaceae),小球壳属(Mycosphaerella)。 5 鉴定原理和流程 5.1 鉴定原理 根据香蕉黄条叶斑病菌的危害症状(参见附录A),分离培养形态特征进行初步判断,设计特异性 PCR引物和探针,建立基于实时荧光PCR方法,对香蕉黄条叶斑病菌进行鉴定。 5.2 鉴定流程 鉴定流程见图1。 1 SN/T53892021 图1 鉴定流程 6 仪器和试剂 6.1 仪器 显微镜、解剖镜、天平、
5、研钵、烘箱、高压灭菌锅、水浴锅、摇床、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、台式离 心机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空抽干仪、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光 PCR仪、微量移液器(0.1L2.5L,1L10L,10L50L,20L200L,100L1000L)。 6.2 试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。 应至少购置如下试剂或者相应的真菌DNA提取试剂盒: 分离培养所需要的试剂为1%次氯酸钠(NaClO)、75%酒精、无菌水、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(马 铃薯葡萄糖琼脂粉37g,蒸馏水1000mL,121湿热灭菌20min备用)、硫酸链霉素、氨苄青霉素钠、 磷酸二氢
6、钾(KH2PO4)、硝酸钾(KNO3)、七水硫酸镁(MgSO47H2O)、氯化钾(KCl)、葡萄糖、蔗糖、 琼脂。 DNA提取试剂或真菌DNA提取试剂盒:CTAB提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/L EDTA,100mmol/LTrisHClpH8.0)、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNase。 荧光PCR反应所需试剂:PCR混合液(含缓冲液,氯化镁,dNTPs,Taq酶)、特异性引物探针、超 纯水。 7 检疫鉴定方法 7.1 病原菌的分离培养 症状检查:观察叶片是否出现微变色,形成细小、黄绿色病纹或暗褐色条纹病斑或有外围黄色晕环; 是否有椭圆形褐色或锈红色
7、,外缘有黑色或深褐色细线黄色晕圈的病斑;是否有灰色霉状物。 挑取发病材料病斑用流水充分冲洗后,用1%次氯酸钠和75%酒精分别浸泡1min进行表面灭菌, 然后用无菌水冲洗3次,用灭菌镊、剪在无菌水中将分离材料剪成2cm3cm大小的方块,置于灭菌滤 纸上,吸干水分后放置于倒有PDA的培养皿中。培养皿放置在25条件下光照培养箱中培养(光照和 黑暗12h交替),第3天开始观察,发现疑似菌落后纯化培养,显微观察形态特征。 2 SN/T53892021 7.2 实时荧光PCR检测 按照附录B进行检测。 7.3 致病性测定 致病性测定为选做。 将形态特征与香蕉黄条叶斑病菌相符且实时荧光PCR检测阳性的分离物
8、进行致病性测定。选用 健康的香蕉植株进行致病性测定,对香蕉叶片进行表面消毒,无菌水冲洗,进行针刺接种。用灭菌牙签 或刀片在果皮处穿刺或切开组织,用无菌打孔器在培养基上取香蕉黄条叶斑病菌菌丝块,接种在伤口 上,用湿润的脱脂棉包裹伤口,用塑料袋覆盖,25左右,相对湿度100%,黑暗条件下保湿48h,接种后 5d10d后观察接种点附近是否出现可疑病斑,观察症状并对果实发病处再做病原菌分离,若接种样 品中分离出的菌株培养性状和形态特征符合第8章中的描述,且PCR扩增结果呈阳性,可判定致病性 测定阳性。 8 形态学鉴定特征 病原菌的形态观察:香蕉黄条叶斑病菌菌落在培养基上初为白色,培养2d后菌落中央变为
9、深灰 色,菌落疏展,培养4d后菌落变为灰绿色,培养10d后成熟的菌落进一步变为灰绿色。 分生孢子梗培养2d后出现,丛生,直立或稍弯曲,瓶状,无分隔,顶端钝圆,无明显孢痕;分生孢子 单个着生,浅白色或浅褐色,光滑,直立或稍弯曲,圆筒形至倒棍棒形,顶端和基部钝圆,基部无明显孢 痕,有35个横膈膜,大小为10m80m2m6m,平均18.5m3m。 形态学鉴定特征按照附录C执行。 9 结果判定 以形态学特征和实时荧光PCR检测结果作为判定依据,进行综合判定: 若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第8章鉴定特征吻合,且实时荧光PCR检测结果为 阳性,判定为检出香蕉黄条叶斑病菌Mycosphaerel
10、lamusicola; 若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第8章鉴定特征不吻合,且实时荧光PCR检测结果 为阴性,判定为未检出香蕉黄条叶斑病菌Mycosphaerellamusicola; 若植物组织中的病原菌和分离物的形态特征与第8章鉴定特征吻合,且实时荧光PCR检测结果为 阴性,判定为未检出香蕉黄条叶斑病菌Mycosphaerellamusicola。 10 记录和样品保存 10.1 样品保存 对检出香蕉黄条叶斑病菌的样品应保存于4冰箱中,以备复核,该类样品按照实验室样品管理办 法保存期满后经高压灭菌后方可处理。 分离到的香蕉黄条叶斑病菌应接种于PDA培养基中妥善保存。 10.2 结
11、果纪录与资料保存 包括:样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等,并有实验人员的签字。荧光 PCR要有荧光结果图片。 3 SN/T53892021 附 录 A (资料性) 香蕉黄条叶斑病危害症状、发生与分布 A.1 危害症状 多在上部叶片显症。初期症状是叶片出现轻微变色,形成细小、黄绿色病纹,扩展后,形成与叶脉平 行的暗褐色条纹病斑,外围黄色晕环。以后病斑逐渐扩展成椭圆形,呈褐色或锈红色,外缘有黑色或深 褐色细线,具黄色晕圈。发生多时,病叶局部或全叶枯死。潮湿条件下,病斑表面可见大量灰色霉状物。 受害株如多数叶片染病,则不能抽穗,或抽出的果穗瘦,果肉变色;如整株失去功能叶片,抽
12、出的果穗常 腐烂、折断,整穗脱落,严重减产。香蕉黄条叶斑病菌侵染叶片的发病症状见图A.1。 图A.1 香蕉黄条叶斑病菌侵染叶片的发病症状(引自Brito2015) A.2 寄主范围 主要危害Musa(香蕉属)的植物。 A.3 地理分布 香蕉黄条叶斑病是一种全球性流行病害,分布广泛,在多个大洲均有报道。具体如下: 4 SN/T53892021 亚洲:不丹,文莱,柬埔寨,印度,印度尼西亚,老挝,马来西亚,尼泊尔,菲律宾,斯里兰卡,泰国,越 南,也门。 非洲:安哥拉,喀麦隆,佛得角,科特迪瓦,埃塞俄比亚,加蓬,加纳,几内亚,几内亚比绍,肯尼亚,马 达加斯加,马拉维,毛里求斯,莫桑比克,尼日利亚,圣多
13、美,塞拉利昂,索马里,南非,坦桑尼亚,多哥,乌 干达,刚果,赞比亚。 北美洲:墨西哥,美国。 中北美洲及南美洲:阿根廷,巴哈马,巴巴多斯,玻利维亚,巴西,哥伦比亚,哥斯达黎加,古巴,多米 尼加,厄瓜多尔,萨尔瓦多,圭亚那,格林纳达,危地马拉,海地,洪都拉斯,牙买加,尼加拉瓜,巴拿马,波 多黎各,秘鲁,苏里南,特立尼达和多巴哥,委内瑞拉等。 大洋洲:美属萨摩亚,澳大利亚,斐济,关岛,基里巴斯,新西兰,瓦努阿图等国家均有分布。 5 SN/T53892021 附 录 B (规范性) 香蕉黄条叶斑病菌实时荧光PCR检测 B.1 DNA制备 称取充分混匀的待测培养物100mg(液氮处理研磨),加入至1.
14、5mL的微量离心管中,加入65 预热的600LCTAB裂解液,振荡混匀,置于65水浴中处理30min,期间每隔10min混匀一次;取 出冷却至室温后,加入等体积的三氯甲烷/异戊醇(24:1),充分混匀,室温15000g离心15min;小心吸 取上清液(约600L)至一新的1.5mL离心管,加入2.5倍体积的预冷的无水乙醇或0.8倍体积的异丙 醇,再加入1/10体积的3mol/L乙酸钠(pH4.8),充分混匀,-20(加入无水乙醇时)或4(加入异 丙醇时)放置30min以上;4,15000g离心15min,弃去上清液;加入70%的乙醇500L,洗涤沉淀 两次,室温15000g离心5min弃上清(
15、注意不要把沉淀倒出),晾干沉淀,至乙醇挥发殆尽后,加入50L 的去离子水或TE缓冲液溶解沉淀,-20保存待用。 也可用相应市售DNA提取试剂盒提取DNA。 B.2 引物序列 选择香蕉黄条叶斑病菌肌动蛋白基因(ACT)设计特异引物及探针。 香蕉黄条叶斑病菌特异引物(ACT): 正向引物ACT-PMF:5-GAGCCCAGCATCCATTG-3 反向引物ACT-PMR:5-AGTCCTTCTGACCCATA-3 探针PMMGB:5-TATGCGACTCCGCCCTCC-3(探针5端含有FAM报告基因,3端含有不发 荧光的猝灭基因)。 B.3 扩增条件 PCR扩增反应体系为:PCR混合液(含缓冲液,
16、氯化镁,dNTPs,Taq酶)10L、引物ACT-PMF/ ACT-PMR(工作浓度为10mol/L)各1L、探针PMMGB(工作浓度为10mol/L)为1L,超纯水 8L。反应总体积为20L。将反应体系混合均匀后置于荧光PCR仪中进行反应。 以香蕉黄条叶斑病菌DNA作阳性对照、不含香蕉黄条叶斑病菌DNA作阴性对照、以无菌蒸馏水 作空白对照,每个样品设置3个重复。 反应条件为:50预热2min;9515min;然后9415s,6060s,共40个循环。 B.4 实时荧光PCR检测结果 在阴性对照、空白对照正常的情况,则有如下判定: 样品无Ct值并且无扩增曲线,判定为阴性; 样品Ct值35.0,
17、且出现典型的扩增曲线,判定为阳性; 样品Ct值在35.040.0之间时,应重新提取样品DNA进行扩增检测。Ct值仍在35.040.0 之间,且分离曲线明显的,判断该样品检出香蕉黄条叶斑病菌。 6 SN/T53892021 附 录 C (规范性) 香蕉黄条叶斑病菌形态学特征 C.1 香蕉黄条叶斑病菌形态学特征 形态学特征见图C.1。 图C.1 香蕉黄条叶斑病菌形态学特征(引自Meredith和Lawrence1970) C.2 与近缘种分生孢子大小比较 分生孢子与近缘种Pseudocercosporahakeae和Pseudocercosporalongispora相比,分生孢子具有 明显的差别
18、。见表C.1。 表C.1 与近缘种分生孢子大小比较 Mycosphaerellamusicola(10m80m)(2m6m) Pseudocercosporahakeae(50m80m)(5m9m) Pseudocercosporalongispora(82m120m)(2.5m4m) SN/T53892021 SN/T53892021 参 考 文 献 1 王国芬,黄俊生,谢艺贤,彭军,代鹏,谢玉萍.香蕉叶斑病的研究进展.2006.果树学报.23: 96-101. 2 ArzanlouM,GroenewaldJZ,FullertonRA,AbelnEC,CarlierJ,ZapaterMF,B
19、uddenhagen IW,ViljoenA,CrousPW.2008.Multiplegenegenealogiesandphenotypiccharactersdifferentiate severalnovelspeciesofMycosphaerellaandrelatedanamorphsonbanana.Persoonia-MolecularPhylog- enyandEvolutionofFungi.20:19-37. 3 ChangTC,SalvucciA,CrousPW,StergiopoulosI.2016.ComparativegenomicsoftheSigato- k
20、adiseasecomplexonbananasuggestsalinkbetweenparallelevolutionarychangesinPseudocercos- porafijiensisandPseudocercosporaeumusaeandincreasedvirulenceonthebananahost.PLoS Genetics.12:e1005904. 4 CrousPW,BraunU,HunterGC,WingfieldMJ,VerkleyGJ,ShinHD,NakashimaC,Groe- newaldJZ.PhylogeneticlineagesinPseudoce
21、rcospora.2013.StudiesinMycology.75:37-114. 5 BritoFSD.2015.DiversidadegenticadepopulaesdeMycosphaerellamusicolaecaracterizaodo efetorlysmemMycosphaerellagraminicola.Ph.Dthesis.UniversidadedeBraslia,Brazil. 6 GomesLI,DouhanGW,BibianoLB,MaffiaLA,MizubutiES.2013.Mycosphaerella musicolaidentifiedastheon
22、lypathogenoftheSigatokadiseasecomplexpresentinMinasGerais State,Brazil.PlantDisease.97:1537-43. 7 JacomeL,LepoivreP,MarinD,OrtizR,RomeroR,EscalantJV.Mycosphaerellaleafspot diseasesofbananas:presentstatusandoutlook.2002.InProceedingsoftheWorkshoponMycosphae- rellaleafspotdiseasesheldinSanJose,CostaRi
23、ca. 8 MeredithDS,LawrenceJS.1970.MorphologyoftheconidialstateofMycosphaerellamusi- colainthePacificregion.TransactionsoftheBritishMycologicalSociety.54:265-281. 9 MourichonX,CarlierJ,FourE.1997.Sigatokaleafspotdiseases.Musadiseasefactsheet8. 10 MulderJL,StoverRH.1976.Mycosphaerellaspeciescausingbananaleafspot.Transactions oftheBritishMycologicalSociety.67:77-82. 1 2 0 2 9 8 3 5 T/ N S 版权专有 侵权必究 * 书号:155175682 定价: 12.00元
