1、ICS11.220 CCSB41 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53382021 虎物种鉴定 实时荧光PCR方法 Identification for tiger speciesReal-time PCR method 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国绍兴海关。 本文件主要起草人:吴姗、赵秀玲、张
2、明哲、虞惠贞、尹文秀、张晓峰、任明兴、孙超、张荃。 SN/T53382021 虎物种鉴定 实时荧光PCR方法 1 范围 本文件规定了虎种(Panthera tigris)的实时荧光PCR鉴定方法。 本文件适用于虎种内现存的6个亚种虎,包括东北虎(Panthera tigris altaica)、华南虎(Panthera tigris amoyensis)、孟加拉虎(Panthera tigris tigris)、印度支那虎(Panthera tigris corbetti)、马来虎 (Panthera tigris jacksoni)和苏门答腊虎(Panthera tigris sumatra
3、e)及其制品的定性鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 实时荧光PCR real-time PCR 在PCR扩增时加入带有荧光基团的特异性探针( Ta q man探针)或荧光染料,使PCR产物的积累 与荧光信号的积累完全同步,实现PCR产物的实时监测。 3.1.2 Ct值 cyc
4、le threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 b p :碱基对( base p air ) CTAB :十六烷基三甲基溴化铵( cet y ltrith y lammonium bromide ) Cyt b基因:高等生物细胞中线粒体的细胞色素b基因( c y tochrome b) DNA :脱氧核糖核酸( deox y ribonucleic acid ) dNTP :脱氧核苷酸三磷酸( deox y ribonucleoside tri p hos p hate ) EDTA :乙二胺四乙酸( et
5、h y lene diaminetetraacetic acid ) FAM : 6-羧基荧光素( 6-carbox y fluorescein ) OD :光密度值( o p tical densit y ) PCR :聚合酶链式反应( p ol y merase chain reaction ) ROX :羧基-X-罗丹明( carbox y -X-rhoa mine ) 1 SN/T53382021 Ta q酶:从水生热栖菌中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶( thermus a q uaticu ) TE : Tris-HCl 、 EDTA缓冲液 Tris :三(羟甲基)氨基甲烷 t
6、ris ( h y drox y meth y l ) aminomethane 4 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB / T 6682中一级水的规定。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 4.1 液氮。 4.2 0.5 mol / L EDTA缓冲液( p H 8.0 )。 4.3 CTAB裂解液( 2.0% ): 20 g / L CTAB , 0.1 mol / L Tris-HCl ( p H 8.0 ), 1.4 mol / L NaCl , 20 mmol / L EDTA ( p H 8.0 )。 4.4 CTAB沉淀液( 0.5% ):
7、5 g / L CTAB , 40 mmol / L NaCl 。 4.5 蛋白酶K溶液( 20 m g / mL )。 4.6 NaCl溶液( 1.2 mol / L )。 4.7 RNase A酶。 4.8 三氯甲烷。 4.9 异丙醇。 4.10 体积分数为70%的乙醇。 4.11 TE缓冲液: 10 mmol / L Tris-HCl ( p H 8.0 ), 1 mmol / L EDTA缓冲液( p H 8.0 )。 4.12 实时荧光PCR反应混合液: 10 L反应体系包括: 1 U2 U ( unit ,酶学单位)的Ta q酶、 1PCR 缓冲液、 2.5 mmol / L4.0
8、 mmol / L的M g 2+ 、 0.2 mmol / L的d ( A , C , G ) TPs 、 0.2 mmol / L 0.4 mmol / L dUTP 、 400 mmol / L ROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。如果具有等效的 商品化试剂盒,则可使用这些等效产品。 4.13 引物与探针:虎种的实时荧光PCR检测所用的引物和探针序列见表1 。 表1 引物和探针序列 名称序列目的基因名称及序列号扩增片段长度 虎5 端引物5 -CTACCCRCCCCATCCAATAT-3 虎3 端引物5 -GTAGTTTACGTCGCGGCAAA-3 虎探针5 -FAM-TCAC
9、TGGCCTCTTTCTAGCC-ECLIPSE-3 线粒体的Cyt b基因, JF357968.1 166 b p 注: 虎引物探针扩增的靶标序列见附录 A 。虎种信息见附录B 。 5 仪器设备 5.1 实时荧光PCR仪。 5.2 恒温水浴锅或干式恒温器。 5.3 离心机:最大离心力不小于16 000 g。 5.4 微量移液器: 2.5 L 、 10 L 、 20 L 、 100 L 、 200 L 、 1 000 L 。 5.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.6 p H计。 2 SN/T53382021 5.7 涡旋振荡仪。 5.8 研钵。 5.9 冷冻粉碎均质装置。 5.10 天
10、平:感量0.01 g 。 5.11 高压灭菌器。 5.12 锉刀或电钻。 6 检验步骤 6.1 制样 6.1.1 肌肉、内脏等组织:取适量(由于制备一份DNA样本至少需要200 m g的样本,考虑到制备时的 损耗和重复,可取1 g左右的样品)样品放入研钵,用液氮( 4.1 )充分研磨至糜状;或采用合适的冷冻粉 碎均质装置( 5.9 )对样品进行充分地研磨至糜状。 6.1.2 血液:可直接进行DNA提取,无需制样。 6.1.3 骨骼、牙齿(带牙髓):使用锉刀或电钻( 5.12 )等工具,将样品制备成粉末状。 6.1.4 毛发(带毛囊):采用冷冻粉碎均质装置( 5.9 )对样品进行充分地研磨至粉末
11、状。 6.2 脱钙处理 上述6.1涉及的样品,牙齿样品需进行脱钙处理,其余样品制样后可直接进入6.3.1的DNA提取 步骤。 取制备好的粉末状牙齿样品200 m g于2 mL离心管中,加入1.5 ml 0.5 mol / L EDTA缓冲液 ( p H 8.0 )( 4.2 ), 37 恒温12 h , 15 000 g离心1 min ,弃尽上清。脱钙处理后的样品可进入6.3.1的 DNA提取步骤。 6.3 样品DNA提取 6.3.1 称取约200 m g已经制备好的样品(或取200 L血样)于2 mL离心管中,加入1.0 mL 2.0% CTAB裂解液( 4.3 )和10 L蛋白酶K溶液(
12、4.5 ),振荡混匀, 65 恒温30 min ,期间每隔10 min振荡 混匀。 6.3.2 15 000 g离心10 min ,取上清至一新的离心管,加入300 L三氯甲烷( 4.8 ),涡旋振荡充分混 匀, 15 000 g离心10 min 。 6.3.3 取上清至新的离心管中,加入2倍体积0.5% CTAB沉淀液( 4.4 ),颠倒混匀,室温静置1 h , 15 000 g离心5 min ,弃尽上清。 6.3.4 加入400 L 1.2 mol / L NaCl溶液( 4.6 ),室温放置10 min ,使DNA全部溶解,加入10 L RNase A酶( 4.7 ), 37 恒温20
13、min 。 6.3.5 加入400 L三氯甲烷( 4.8 ),涡旋振荡混匀, 15 000 g离心10 min ,取上清至新的离心管,加入 0.7倍体积的异丙醇( 4.9 ),颠倒混匀,室温静置10 min , 15 000 g离心10 min 。 6.3.6 弃尽上清,加入500 L 70%乙醇,颠倒混匀, 15 000 g离心2 min ,弃上清。重复一次。 6.3.7 短暂离心,将残余上清液吸尽,将DNA晾干。加入20 L100 L TE溶液(毛发、牙齿、骨骼、 血液等加入20 L左右;肌肉、内脏等加入100 L左右),使DNA完全溶解。 DNA样品保存于20 备用。 6.3.8 毛发、
14、牙齿、骨骼、血液等组织宜采用相关试剂盒提取DNA 。 3 SN/T53382021 6.4 DNA的浓度和纯度测定 样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260 nm和280 nm处的吸光值A260和 A280 。 DNA的浓度按式( 1 )进行计算: c=AN50 ( 1 ) 式中: c DNA浓度,单位为纳克每微升( n g / L ); A 260 nm处的吸光值; N核酸稀释倍数。 当DNA浓度高于10 n g / L , A260 / A280比值在1.42.5之间时, DNA模板适宜于PCR扩增。 6.5 实时荧光PCR检测 6.5.1 实时荧光PCR反应体系 反应体系体
15、积为20 L ,其中含:实时荧光PCR反应混合液10 L , 5 端和3 端引物( 10 mol / L ) 各0.4 L ,探针( 10 mol / L ) 0.4 L ,模板DNA ( 10 n g / L100 n g / L ) 2 L ,双蒸水补足至20 L 。 6.5.2 实时荧光PCR反应参数 实时荧光PCR反应条件一般为: 95 2 min ; 95 15 s , 60 40 s , 40个循环。随仪器型号和试 剂不同可略有改变。 6.5.3 仪器检测通道的选择 设置实时荧光PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致。具体设置方法可参 照仪器使用说明书。 6.5.
16、4 试验对照的设立 每个样品应有2个平行试验,同时每次检测应设立3个对照: a ) 阳性对照:含虎成分的样品或含有PCR扩增目的片段的阳性质粒; b )阴性对照:不含虎成分的样品; c )空白对照:双蒸水。 7 质量控制 以下条件有一条不满足时,试验视为无效: a )空白对照:无FAM荧光信号检出; b )阴性对照:无FAM荧光信号检出; c )阳性对照:有FAM荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值30.0 。 8 结果判定及表述 8.1 两个平行试验的Ct值皆36.0或无Ct值,可判为阴性,表明样品中不含有虎DNA ,表述为“未 检出虎DNA ”。 8.2 两个平行试验的
17、Ct值皆36.0可判为阳性,表明样品中含有虎DNA , 表述为“检出虎 DNA ”。 4 SN/T53382021 8.3 两个平行试验,其中一个Ct值36.0 ,另一个Ct值36.0 ,应重新制样和DNA提取,再进行一 次荧光PCR检测。若得到的Ct值36.0 ,则表述为“未检出虎DNA ”;若得到的Ct值36.0 ,表述为 “检出虎DNA ”。 5 SN/T53382021 附 录 A (资料性) 虎的实时荧光PCR扩增的靶标参考序列 虎Cyt b基因PCR扩增靶标序列( GenBank序列号: JF357968.1 , 孟加拉虎(Panthera tigris tigris) CTACC
18、CGCCCCATCCAATATTTCAGCATGATGAAACTTTGGCTCCTTACTAGGGGTG TGCTTAATCTTACAAATCCTCACTGGCCTCTTTCTAGCCATACACTACACATCAGACACAA TTAACCGCTTTCTCATCAGTTACCCACATTTGCCGCGACGTAAACTACG 6 SN/T53382021 附 录 B (资料性) 虎基本信息 学名:Panthera tigris( Linnaeus , 1758 ) 同义学名:Felis tigris( Linnaeus , 1758 ) 英文名: Ti g er 分类地位:哺乳纲( Mamm
19、alia ),食肉目( Carnivora ),猫科( Felidae ),豹属(Panthera)。虎种下有九 个亚种,但目前巴厘虎(Panthera tigris balica)、爪哇虎(Panthera tigris sondaica)、里海虎(Panthera tigris virgata)已经灭绝,仅存六个亚种,包括:东北虎(Panthera tigris altaica)、华南虎(Panthera ti- gris amoyensis)、孟加拉虎(Panthera tigris tigris)、印度支那虎(Panthera tigris corbetti)、马来虎 (Panther
20、a tigris jacksoni)和苏门答腊虎(Panthera tigris sumatrae)。 外形特征:毛色浅黄或棕黄色,全身有黑色横纹,唇、颌、腹部和四肢内侧白色,前额有似“王”字的斑 纹;头圆,耳短,耳背面黑色,耳背有个白点;四肢健壮有力;尾粗长,具黑色环纹,尾端黑色。现存成年虎 亚种中,体长2.2 m3.8 m ,体重90 k g 350 k g ,不同亚种间体型差距较大。是一种大型的珍稀濒危 动物。 地理分布:分布于孟加拉国、不丹、柬埔寨、中国、印度、印度尼西亚、老挝、马来西亚、缅甸、尼泊尔、 俄罗斯、泰国、越南等。 虎被列为濒危野生动植物种国际贸易公约( CITES ) 2
21、016年附录级保护动物,同时也列入世 界自然保护联盟( IUCN ) 2015年濒危物种红色名录ver3.1 濒危( EN )。 SN/T53382021 1 2 0 2 8 3 3 5 T/ N S 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 虎物种鉴定 实时荧光PCR方法 SN / T 5338 2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号( 100023 ) 编辑部:( 010 ) 65194242-7531 网址 / book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8801230 1 / 16 印张0.75 字数18千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数 1 500 * 书号: 155175 662定价12.00元
