1、ICS11.020 CCSC62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53822021 金毛狗鉴定方法 Identification of Cibotium barometz(L.) J. Sm. 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中华人民共和国福州海关、中华人民共和国厦门海关。 本文件主要起草人:李敏、虞赟、陈智明、于文涛、沈建国、林春滢、过赋文、林阳武。 SN/
2、T53822021 金毛狗鉴定方法 1 范围 本文件规定了金毛狗的鉴定方法。 本文件适用于金毛狗的鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 二回羽状复叶 bipinnate leaf 总叶柄两侧有羽状排列的分枝,其上着生羽状排列的小叶。 3.1.2 羽片 pinna(pl.pinnae) 羽状复叶的一回分裂羽叶或小叶。 3.1.3 小羽片 pinnule 二回或二回以上羽状复叶的末级羽片。 3.1.4 小羽轴 pinnule rachis 蕨类植物中分枝到小羽片的轴。 3.1.5 叶轴 rach
3、is 复叶的主轴。 3.1.6 羽轴 pinna rachis 蕨类植物中分枝到羽片的轴。 3.1.7 孢子 spore 蕨类植物产生的一种有繁殖作用的器官,离开母体后就能形成新的植株。 3.1.8 孢子囊群 sorus(pl.sori) 蕨类植物叶片表面的一群孢子囊。 1 SN/T53822021 3.1.9 孢子囊 sporangium(pl.sporangia) 产生孢子的囊状结构。 3.1.10 囊群盖 indusium (pl.indusia) 保护孢子囊群的膜状物。 3.1.11 孢子周壁 perispore 围绕孢子的膜。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB :
4、cet y ltrith y lammonium bromide ,十六烷基三甲基溴化铵。 DNA : deox y ribonucleic acid ,脱氧核糖核酸。 dNTP : deox y ribonucleoside tri p hos p hate ,脱氧核苷酸三磷酸。 Ta q酶:栖热水生菌DNA聚合酶。 OD : o p tical densit y ,光密度值。 b p : base p air ,碱基对。 4 基本信息 学名:Cibotium barometz( L. ) J.Sm. 。 异名:Aspidium barometz( L. ) Willd. ;Balantiu
5、m glaucescens ( Kunze ) Link ;Cibotium assami- cum Hook. ;Polypodium barometz L. ;Cibotium djambianum Hassk. ;Cibotium glaucescens Kunze ; Dicksonia barometz ( L. ) Link ;Nephrodium baromez( L. ) Sweet 。 英文名: Golden chicken fern ; Wooll y fern ; Sc y thian lamb 。 金毛狗,又称金毛狗蕨,隶属于金毛狗蕨科 Cibotiaceae ,金毛狗
6、蕨属 Cibotium Kaulf. 。 我国分布有2种金毛狗蕨属植物:金毛狗和菲律宾金毛狗蕨 Cibotium cumiingii Kunze (异名Ci- botium barometz var.Cumingii( Kunze ) C.Chr. ;Cibotium crassinerve Rosenst. ;Cibotium taiwanense C.M. Kuo )。 金毛狗的其他信息参见附录A 。 5 方法原理 金毛狗植株或根状茎可通过旅客携带、邮包夹带及货物掺杂等方式进出境。通过肉眼和利用放大 镜、体视显微镜、扫描电子显微镜观察,根据本文件描述的金毛狗植株形态鉴定特征,按系统分类学方
7、法 进行判定。对于植株形态特征不明显的,可结合本文件描述的分子生物学方法进行辅助判定。 6 仪器器具和主要试剂 6.1 仪器 体视显微镜、扫描电子显微镜、 PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、 纯水仪、生物安全柜、冰箱、超低温冰箱、高压灭菌锅、可调移液器、可调移液器枪头。 2 SN/T53822021 6.2 器具 放大镜、解剖刀、解剖针、镊子、培养皿、白瓷盘、样品袋、标本夹、标签、记录纸、标本瓶、标本盒、电子 天平、研钵、离心管、 PCR管。 6.3 主要试剂 防虫剂、干燥剂、液氮、超纯水、植物基因组提取试剂盒、 CTAB法提取试剂、脱氧核糖核苷三磷酸 ( dNT
8、Ps )、 Ta q聚合酶、 10PCR缓冲液、 DNA Marker 、琼脂糖、核酸凝胶染料。 7 形态鉴定特征 7.1 金毛狗蕨属 根状茎,卧生或直立;根状茎和叶柄基部密被长茸毛;二回至三回羽状复叶,长2 m3 m ;囊群盖坚 硬,两瓣;孢子四面体形,具肋条状隆起的纹饰和赤道环。 7.2 金毛狗形态特征 7.2.1 整体形态 多年生树形蕨类植物。植株高达3 m 。金毛狗植株形态特征参见附录B中的图B.1 、图B.2 、 图B.3 、图B.4 、图B.5 。 7.2.2 茎 根状茎,卧生,粗大,直径4 cm8 cm ;基部被垫状金黄色茸毛,形状如狗头。金毛狗根状茎形态特 征参见附录B中的图B
9、.1 、图B.3 。 7.2.3 叶 叶着生于根状茎顶端,簇生成冠状;叶柄长100 cm120 cm ,绿色,后变成紫色;叶柄基部粗壮,直 径可达2 cm ,且其基部被长1 cm2.4 cm的黄色柔毛;显微观察叶柄基部,横切面维管束呈“如意云 头”形状;叶近革质,具光泽,叶面深绿色,叶背灰绿色,广卵状三角形,长100 cm300 cm ,宽80 cm 180 cm ,为二回羽状复叶;羽片多数,互生,具柄,柄长3 cm4 cm ;中下部羽片长40 cm80 cm ,宽15 cm30 cm ;小羽片披针形,顶端渐尖,具短柄,柄长2 mm3 mm ,羽状深裂几达小羽轴;两侧裂片镰刀 形,长10 mm
10、14 mm ,宽3 mm4 mm ,顶端急尖,向上斜出,边缘有浅锯齿;裂片中脉两面凸出,侧脉 两面隆起斜出,可育裂片侧脉单一或二叉,不育裂片侧脉二叉;叶柄、叶轴、羽轴、小羽轴、叶脉疏生短褐 柔毛。金毛狗叶片形态特征参见附录B中的图B.1 、图B.2 、图B.4 。 7.2.4 孢子囊群 孢子囊群1对5对,着生于羽片背面的裂片侧脉顶端,囊群长115 m165 m ,宽70 m 110 m ,囊群盖坚硬,矩圆形,棕褐色,两瓣,内瓣较外瓣小,成熟时裂开如蚌壳,露出孢子囊和隔丝。金 毛狗孢子囊群形态特征参见附录B中的图B.5 。 7.2.5 孢子 孢子淡黄色,四面体形,辐射对称,无孢子周壁;近极面外观
11、为三角形,具裂缝,缝长为孢子半径的 2 / 3 ,缝的外侧具3条呈钝角状的宽厚隆起;远极面外观亦为三角形,具明显的肋条状隆起的纹饰,肋条 3 SN/T53822021 粗细不匀,数目不定,排列和连接方式不固定;赤道面外观近半圆形,具明显的肋条状纹饰,赤道环为 1条弯曲长肋条。金毛狗孢子形态特征参见附录C中的图C.1 。 7.3 金毛狗与近似种间的区别 金毛狗与菲律宾金毛狗蕨形态特征区别表现在:小羽片、裂片、孢子囊群、孢子等方面(表1 )。金毛 狗与菲律宾金毛狗蕨形态特征比较图参见附录C 。菲律宾金毛狗蕨形态特征参见附录D 。 表1 金毛狗与菲律宾金毛狗蕨形态特征区别比较 形态金毛狗菲律宾金毛狗
12、蕨 小羽片羽片两侧均存在小羽片羽片基部下侧的小羽片缺失 裂片镰刀形披针形 孢子囊群1对5对1对3对 孢子具赤道环无赤道环 8 分子生物学鉴定方法 当植株形态特征不明显时,可采用分子生物学鉴定方法进行辅助判定。金毛狗分子生物学鉴定方 法参见附录E 。 9 结果判定 植株形态特征是鉴定金毛狗的主要判定依据,金毛狗DNA条形码可作为辅助判定依据。与 第7章描述金毛狗植株形态鉴定特征相吻合的可判定为金毛狗;样品psbA-trnH基因序列经GenBank 数据库比对分析,查看序列相似性最高( Max ident or Similarit y )的物种,当序列相似性最高的物种为 C.barometz,且序
13、列相似性99%时,可作为金毛狗辅助判定依据。 10 样品与记录保存 妥善保存样品及相关记录,包括样品名称、编号、来源、检验日期、方法、结果等图文资料,并要有经 手人员、检验人员和审核人员签字。妥善保存6个月以上,以备复验、谈判和仲裁。 4 SN/T53822021 附 录 A (资料性) 金毛狗的相关信息 A.1 地理分布 金毛狗分布于亚洲的热带和亚热带地区,包括印度、缅甸、泰国、老挝、马来西亚、柬埔寨、菲律宾、印 度尼西亚、日本、越南和中国(广东、广西、云南、海南、台湾、福建、四川、重庆、湖南、贵州、西藏、浙江、江 西等省)。 A.2 基本生物学特性 金毛狗适宜在明亮的散射光线和温暖湿润的环
14、境条件下生长,适宜温度为10 26 ,适宜湿度 为60%80% 。喜酸性土壤,在红壤、黄壤上也可生长,分布于海拔250 m960 m以下的溪沟、河谷两 侧、灌木草坡、疏林地或林地。 A.3 保护地位 我国国家林业局和农业部1999年发布的国家重点保护野生植物名录(第一批)中,将金毛狗列为 级重点保护野生植物。濒危野生动植物种国际贸易公约( Convention on International Trade in Endan g ered S p ecies of Wild Fauna and Flora , CITES )将金毛狗列为CITES附录内限制贸易的物种。 5 SN/T5382202
15、1 附 录 B (资料性) 金毛狗形态特征图 标引序号说明: A 植株基部及幼叶; B 根状茎; C 羽片; D 小羽片; E 不育裂片; F 具孢子囊群的可育裂片; G 孢子囊群。 注: 引自王培善和王筱英, 2001 。 图B.1 金毛狗植株形态特征 6 SN/T53822021 图B.2 金毛狗植株形态特征 a) 带幼叶的根状茎侧面观b) 根状茎顶面观 图B.3 金毛狗根状茎形态特征 7 SN/T53822021 a) 叶柄基部b) 叶柄横切面 图B.4 金毛狗叶形态特征 a) 未成熟孢子囊群b) 成熟孢子囊群 c) 未成熟孢子囊群(体视显微镜拍摄)d) 成熟孢子囊群(体视显微镜拍摄)
16、图B.5 金毛狗孢子囊群形态特征 8 SN/T53822021 附 录 C (资料性) 金毛狗与菲律宾金毛狗蕨形态特征比较图 a) 金毛狗孢子近极面b) 菲律宾金毛狗蕨孢子近极面 c) 金毛狗孢子远极面d) 菲律宾金毛狗蕨孢子远极面 e) 金毛狗孢子赤道面(箭头标示赤道环)f) 菲律宾金毛狗蕨孢子赤道面 图C.1 金毛狗与菲律宾金毛狗蕨孢子形态特征比较图(扫描电子显微镜拍摄) 9 SN/T53822021 a) 箭头标示金毛狗羽片两侧均存在小羽片b) 箭头标示菲律宾金毛狗蕨羽片基部下侧的小羽片缺失 c) 金毛狗镰刀形裂片d) 菲律宾金毛狗蕨披针形裂片 注: b )和d )引自张宪春, 2012
17、 。 图C.2 金毛狗与菲律宾金毛狗蕨叶形态特征比较图 01 SN/T53822021 附 录 D (资料性) 菲律宾金毛狗蕨形态特征图 标引序号说明: A 叶柄基部; B 近基部羽片; C 叶柄基部茸毛; D 叶柄横切面; E 具孢子囊群的可育裂片。 注: 引自李惠林等, 1975 。 图D.1 菲律宾金毛狗蕨形态特征 11 SN/T53822021 附 录 E (资料性) 金毛狗分子生物学鉴定方法 E.1 样品处理 将需要提取DNA的植物材料(新鲜植物组织100 m g ,干燥组织10 m g ),放入离心管中,在超低温 冰箱放置8 h24 h 或液氮处理后研磨。 E.2 DNA提取 E.
18、2.1 总则 采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA 。 PCR级DNA溶液的OD260 / OD280比值应为 1.71.9 。也可采用商品化的植物基因组提取试剂盒提取植物基因组总DNA ,提取方法参照所采用试 剂盒说明书。 E.2.2 试剂 CTAB提取液: CTAB 20 g / L ,氯化钠1.4 mol / L , Tris 0.1 mol / L ( p H 8.0 ), EDTA 0.02 mol / L ( p H8.0 ),高压灭菌备用。 三氯甲烷:异戊醇的体积分数为241 。 50TAE缓冲液: 242 g Tris , 57.1 mL冰乙酸, 100 mL 0.5 m
19、ol / L EDTA ( p H8.0 ),充分溶解混匀 后,加水定容至1 L ,高压灭菌备用。 10加样缓冲液: 0.25%溴酚蓝, 40%蔗糖。 E.2.3 提取步骤 在2 ml离心管加入新鲜植物组织0.1 g或干燥植物粉末0.03 g ,加入已预热至 65 的600 L CTAB提取液,充分振荡混匀; 65 水浴30 min ,不时颠倒混匀; 10 000 r / min离心5 min ,取上清,等体 积氯仿异戊醇(三氯甲烷:异戊醇=241 )抽提一次;取上清,再加入等体积异丙醇, 4 沉淀10 min以 上,然后12 000 r / min离心10 min ,弃上清; 70%乙醇洗涤
20、12次,晾干后,加入20 L TE缓冲液溶解 沉淀,保存于-20 冰箱冷冻备用。 E.3 PCR扩增 E.3.1 引物序列 采用psbA-trnH基因的通用引物psbAF及trnHR进行psbA-trnH基因扩增。 Forward psbAF : GTTATGCATGAACGTAATGCTC Reverse trnHR : CGCGCATGGTGGATTCACAATCC E.3.2 PCR反应体系 本方法中, PCR反应体系的总体积为25 L ,反应体系见表E.1 。可以在不改变试剂浓度的情况 下,适当扩大反应体系。 21 SN/T53822021 表E.1 PCR反应体系 成分储备液浓度25
21、 L反应体系加样体积( L ) dNTP 混合物(各 10 mmol / mL ) 2.5 mmol / L 2.0 10PCR缓冲液(含M g 2+ ) 2.5 正向引物10 p mol / L 1.0 反向引物10 p mol / L 1.0 Ta q酶5 U / L 0.3 DNA模板0.3 u g / L 6 u g / L 1.0 ddH 2 O 补至25 L 同时要设置阳性对照,空白对照(以ddH 2 O代替DNA样品),每个样品重复2次。可用商品化的 PCR Premix 。 E.3.3 PCR反应程序 94 3 min ; 94 30 s , 56 30 s , 72 45 s
22、 , 35个循环; 72 7 min 。 E.4 电泳 取5 L PCR产物进行琼脂糖凝胶( 1.5 % )电泳,凝胶成像系统观察、拍照。 E.5 测序与序列处理 对上述psbA-trnH通用引物扩增获得的528b p的片段进行测序。测序结果利用序列拼接软件进 行拼接编辑,并在GenBank数据库进行序列比对分析。 E.6 DNA条形码参考序列 金毛狗psbA-trnH基因参考序列GenBank 登录号: MN629913 。 31 SN/T53822021 参 考 文 献 1 李惠林,刘棠瑞,黄增泉,等.台湾植物志编缉委员会(第一卷) M .台北: 现代关系出版社, 1975 , 1 : 1
23、32. 2 王培善,王筱英.贵州蕨类植物志 M .贵阳: 贵州科技出版社, 2001 : 49. 3 张宪春.中国石松类和蕨类植物 M .北京: 北京大学出版社.2012.160-161. 4 Becker R.The Identification of Hawaiian Tree Ferns of the Genus Cibotium J .American Fern Journal , 1984 , 74 ( 4 ): 97-100. 5 Gaston y GJ.S p ore mor p holo gy in the Dicksoniaceae.The g enus Cibotium J
24、 .Can.J. Bot. , 1982 , 60 : 955-972. 6 Pra p tosuwir y o TN.Assessin g the conservation status of tree fern Cibotium arachnoideum ( C.Chr. ) Holttum J .Biodive Rs Itas , 2020 , 21 ( 4 ): 1379-1384. 7 San g T , Crawford DJ , Stuess y TF.Chloro p last DNA p h y lo g en y , reticulate evolution and bio
25、- g eo g ra p h y of Paeonia( Paeoniaceae ) J .American Journal of Botan y .1997 , 84 , 1120-1136. 8 Smith AR , Pr y er KM , Schuett p elz E. ,et al.Aclassification for extant ferns J .Taxon , 2006 , 55 ( 3 ): 705-731. 9 Zhan g XC , Nishida H.Flora of China Editorial Committee ( Eds ) .Flora of Chin
26、a ( En g lish ed. ) .Cibotiaceae.Vol.2 M .Science Press , Bei j in g / Missouri Botanical Garden Press , St.Louis.2013 : 132-133 、 165-167. 41 SN/T53822021 1 2 0 2 2 8 3 5 T/ N S 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 金毛狗鉴定方法 SN / T 5382 2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号( 100023 ) 编辑部:( 010 ) 65194242-7531 网址 / book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8801230 1 / 16 印张1.25 字数33千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数 1 500 * 书号: 155175 664 定价20.00元
