1、ICS65.020.01 CCSB16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T53872021 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Lettuce mosaic virus 2021-06-18发布2022-01-01实施 中华人民共和国海关总署发布 1 2 0 2 7 8 3 5 T/ N S 中华人民共和国出入境检验检疫 行 业 标 准 莴苣花叶病毒检疫鉴定方法 SN / T 5387 2021 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号( 100023 ) 编辑部:( 010 ) 65194242-750
2、9 网址 / book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本8801230 1 / 16 印张1 字数25千字 2021年7月第一版 2021年7月第一次印刷 印数 1 500 * 书号: 155175 679 定价16.00元 前 言 本文件按照GB / T 1.1 2020 标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位:中国检验检疫科学研究院、兰州海关技术中心、中华人民共和国吴江海关、福建省 农业科学院果树研究所。 本文件主要起草人:张永江、文朝慧、黄洁芳、谢丽雪、向均。 SN/T53872021 莴苣花
3、叶病毒检疫鉴定方法 1 范围 本文件规定了莴苣花叶病毒的检疫鉴定方法。 本文件适用于莴苣种子、莴苣、豌豆、鹰嘴豆等寄主植株上莴苣花叶病毒的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件。 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN / T 2122 进出境植物及植物 产品检疫抽样 SN / T 3457 植物病毒分子生物学检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 反转录重组酶聚合酶扩增
4、reverse transcription recombinase polymerase amplification;RT-RPA 一项等温扩增技术。 RPA是在单链DNA结合蛋白( sin g le-stranded DNA bindin g p rotein , SSB ) 的作用下,使模板DNA解链,并在DNA聚合酶的作用下,引物与模板正确配对形成复合体,然后DNA 聚合酶延伸引物生成新的DNA互补链,实现对DNA的特定区域进行指数扩增。 RT-RPA 以样品 RNA为模板,先反转录成cDNA ,然后再以cDNA为模板,进行RPA扩增。 4 莴苣花叶病毒基本信息 学名:Lettuce m
5、osaic virus 缩写: LMV 分类地位:马铃薯Y病毒科( Pot y viridae ),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。 传播途径:汁液易于传毒;莴苣、昆诺阿藜种子传毒率3% 13% ;可通过蚜虫传播侵染豌豆,但豌 豆种子不传毒。 莴苣花叶病毒的其他信息参见附录A 。 5 方法原理 LMV的免疫原性和基因组特征是该病毒鉴定的依据。依据LMV与抗体间的特异性反应,对样品 进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定( DAS-ELISA )和免疫试纸条检测;依据LMV的基因组特征建立 RT-PCR和反转录重组酶聚合酶扩增技术( RT-RPA )检测方法;通过这些方法的有效组合,判断样品是 1
6、 SN/T53872021 否带有LMV 。 6 仪器设备、用具及试剂 6.1 仪器设备 电子天平( 1 / 1 000 g )、小型离心机、恒温水浴锅、酶标仪、台式冷冻机、 PCR仪、电泳仪、凝胶成像系 统、金属浴、制冰机、常规冰箱、超低温冰箱、涡旋振荡器等。 6.2 用具 可调移液器( 0.1 L2.5 L , 2 L20 L , 10 L100 L , 20 L200 L , 100 L1 000 L ) 和可调移液器头( 10 L , 20 L , 100 L , 200 L , 1 000 L ),研钵,微型磨杵。 6.3 试剂 试验用水应符合GB / T 6682的要求。 双抗体夹
7、心酶联免疫吸附测定试剂符合附录B要求, RT-PCR试剂符合附录D要求, RT-RPA符 合附录E要求。 7 样品制备 7.1 莴苣种子 莴苣种子用5倍10倍体积( mL )抽提缓冲液研磨后, 3 000g离心取上清,进行DAS-ELISA和免 疫试纸条检测,种子取样量按照SN / T 2122进行;另取350 L上清液提取核酸或用种子直接提取核酸 后进行RT-PCR和RT-RPA检测。 7.2 植物样品 有症状植株(叶片花叶、植株矮化),每株单独编号并采集症状部位制样;无症状植株, 5株为一组编 号并混合制样,按照SN / T 3457进行。按1 g样品加入5 mL10 mL抽提缓冲液进行研
8、磨, 3 000g离 心取上清,进行DAS-ELISA和免疫试纸条检测;或提取核酸后进行RT-PCR和RT-RPA检测。 8 检疫鉴定方法 8.1 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) 把制备的样品上清液加入已包被LMV抗体的酶联板中,进行DAS-ELISA检测。每个样品平行 加到两个孔中。健康的植物组织作为阴性对照,感染LMV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲液 作为空白对照;其中阴性对照的植物种类和材料(如叶片)应尽量与检测样品相一致。 具体操作按照附录B执行。 8.2 免疫层析试纸条检测 免疫层析试纸条检测的对照设置见8.1 ,具体操作按照附录C执行。 8.3 RT-PCR
9、检测 RT-PCR检测阴性和阳性对照设置见8.1 ,灭菌双蒸水( ddH 2 O )作为空白对照。分别提取样品和 2 SN/T53872021 对照总RNA ,反转录合成cDNA后进行PCR检测,具体操作按照附录D执行。如采用商品化一步法 试剂盒,则按照试剂盒说明进行。 8.4 RT-RPA检测 RT-RPA检测阴性和阳性对照设置见8.1 ,灭菌双蒸水( ddH 2 O )作为空白对照。分别提取样品和 对照总RNA ,进行RT-RPA检测,具体操作按照附录E执行。如采用商品化试剂盒,则按照试剂盒说 明进行。 9 结果判定 样品经DAS-ELISA 、试纸条、 RT-PCR或RT-RPA中任一方
10、法的检测,结果为阴性,判定样品不带 有莴苣花叶病毒。 样品经DAS-ELISA或试纸条检测结果为阳性,还需用RT-PCR或RT-RPA进行检测。分子生物 学检测结果为阴性,判定待检样品不带有莴苣花叶病毒;分子生物学检测结果为阳性,则判定样品带有 莴苣花叶病毒。 10 结果记录与样品保存 10.1 结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。 DAS-ELISA检测应有酶 联反应数值;免疫层析试纸条检测应有试纸条检测图片; RT-PCR和RT-RPA检测应有电泳图片。 10.2 样品保存 阳性样品直接放于-80 冰箱或冷冻干燥后放于-80 冰箱保存1年,保存的样品
11、要做好标记和 登记工作,以备复验、谈判和仲裁。保存期满后,需经灭活处理。 3 SN/T53872021 附 录 A (资料性) 莴苣花叶病毒其他信息 A.1 寄主范围 自然寄主包括莴苣(Lactuca sativa)、豌豆(Pisum sativum)、苣荬菜(Sonchus brachyotus)、鹰嘴豆 (Cicer arietinum)、野芥(Sinapis arvensis)、菠菜(Spinacia oleracea)、红花(Carthamus tinctorius)、蓝 眼菊属(Osteospermum s pp . )、勋章菊属(Gazania s pp . )、柴胡(Bupleu
12、rum falcatum)和耳叶金鸡菊 (Coreopsis auriculata)等。 接种寄主包括莴苣、豌豆、鹰嘴豆、苋色藜(Chenopodium amaranticolor)、昆诺阿藜(Chenopodium quinoa)、千日红(Gomphrena globosa)、红花(Carthamus tinctorius)等。 莴苣、昆诺阿藜种子传毒率为3%13% 。 A.2 地理分布 亚洲:阿富汗、中国、印度、伊朗、伊拉克、以色列、日本、约旦、黎巴嫩、马来西亚、叙利亚、土耳其、 也门。 非洲:埃及、加纳、肯尼亚、马拉维、毛里求斯、摩洛哥、塞拉利昂、南非、坦桑尼亚、突尼斯、赞比亚、津 巴布
13、韦。 欧洲:奥地利、比利时、克罗地亚、丹麦、芬兰、法国、德国、希腊、匈牙利、爱尔兰、意大利、荷兰、挪威、 波兰、葡萄牙、罗马尼亚、斯洛文尼亚、西班牙、瑞典、瑞士、英国。 美洲:加拿大、墨西哥、美国、牙买加、阿根廷、巴西、智利、厄瓜多尔、乌拉圭。 大洋洲:澳大利亚、新西兰。 A.3 危害症状 莴苣:受侵染的莴苣症状多变,但通常表现为花叶、明脉和黄斑驳。常有叶脉坏死并呈古铜色。病 株不能包心,里面的叶片持续短小,呈丛簇状,植株严重矮缩。见图A.1 、 A.2 。 豌豆:花叶。 鹰嘴豆:叶黄化。 苋色藜:接种8 d10 d后,出现淡绿或褪绿色的局部斑,往往边缘呈淡红色,特别在冬季呈系统黄 脉斑点,或
14、嫩叶上有黄色网纹。 昆诺阿藜:比苋色藜敏感,产生更多的局部病斑,但无淡红色边缘,后来随着顶叶的扭曲和矮化显现 系统的黄色网脉症状。 千日红:接种4 d7 d产生灰白色局部坏死斑点,扩大成红边的病斑,无系统侵染。 本氏烟:系统花叶。 红花:系统花叶。 4 SN/T53872021 图A.1 LMV在莴苣(左)和本氏烟(右)上引起的系统性轻花叶症状 (图A.1 引自Lim S , et al. ) 图A.2 LMV 在莴苣叶片(左)和茎秆(右)上引起花叶症状 (图A.2 引自Sharma P , et al. ) A.4 基因组 病毒粒体线状,大小约75013 nm 。基因组核酸为正单链RNA ,
15、组分单一,约有10 000个核苷酸 组成。目前GenBank已登录有LMV全基因组序列,不同分离物的外壳蛋白的C-端极其保守,可用于 设计特异性引物进行检测。见图A.3 。 图A.3 病毒粒体(36 000) (图A.3引自周雪平,等) 5 SN/T53872021 附 录 B (规范性) 双抗体夹心酶联免疫吸附测定(DAS-ELISA) B.1 试剂 B.1.1 包被抗体 特异性的莴苣花叶病毒抗体,抗体效价应高于1 / 128 000 。 B.1.2 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的莴苣花叶病毒抗体。 B.1.3 底物 对硝基苯磷酸二钠(pNPP )。 B.1.4 1PBST缓冲液(pH7.4)
16、 氯化钠( NaCl ) 8.0 g 磷酸二氢钾( KH 2 PO 4 ) 0.2 g 磷酸氢二钠( Na 2 HPO 4 ) 1.15 g 氯化钾( KCl ) 0.2 g 吐温-20 ( Tween-20 ) 0.5 mL 叠氮钠( NaN 3 ) 0.2 g 溶于900 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 000 mL , 4 储存。 B.1.5 样品抽提缓冲液(pH7.4) 亚硫酸钠( Na 2 SO 3 ) 1.3 g 聚乙烯基吡咯烷酮( PVP , MW24 00040 000 ) 20.0 g 溶于900 mL的1PBST 中,并定容至1 000 mL , 4 储存。 B.1.6 包被
17、缓冲液(pH9.6) 碳酸钠( Na 2 CO 3 ) 1.59 g 碳酸氢钠( NaHCO 3 ) 2.93 g 叠氮钠( NaN 3 ) 0.2 g 溶于900 mL灭菌双蒸水中,并定容至1 000 mL , 4 储存。 B.1.7 酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4) 牛血清白蛋白( BSA ) 2.0 g 聚乙烯基吡咯烷酮( PVP , MW24 00040 000 ) 20.0 g 溶于1 000 mL 1PBST 缓冲液中, 4 储存 B.1.8 底物缓冲液(pH9.8) 二乙醇胺97 mL 6 SN/T53872021 氯化镁( M g Cl 2 ) 0.1 g 叠氮钠( NaN 3
18、 ) 0.2 g 溶于800 mL灭菌双蒸水,用浓盐酸( HCl )调p H至9.8 ,定容至1 000 mL , 4 储存。 B.2 实验步骤 B.2.1 包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100 L 。酶联板加盖或用保鲜膜 包好, 37 孵育2 h 。清空孔中溶液,用1PBST 加满各孔, 3 min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍干。 再重复2次上述洗板过程。 B.2.2 样品制备与加样 待测样品按第7章样品制备步骤制备。阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行。按 100 L /孔分别加入制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照;酶联板加盖或用保鲜膜包好, 4
19、 孵育过 夜。酶联板用自来水彻底冲洗,再用1PBST 洗涤3次,每次3 min 。 B.2.3 加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加入到酶联板中, 100 L /孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好, 37 孵育4 h 。酶联板用自来水彻底冲洗,再用1PBST 洗涤3次,每次3 min 。 B.2.4 加底物 将底物p NPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1 m g / mL (现配现用), 100 L /孔加入到酶联板中, 室温避光孵育。 B.2.5 读数 在不同的时间内如30 min 、 60 min 、 90 min 、 120 min或更长时间,用酶联仪在405
20、nm处读OD值。 B.3 结果判定 B.3.1 质量控制要求 对照孔的OD 405值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内,即:缓冲液孔和阴性 对照孔的OD 405值0.15 ,当阴性对照孔的OD 405值5 ;同一样品的重复性基本一致,数值差别2 , 判为阳性;样品OD 405值/阴性对照OD 405值接近阈值,判为可疑样品,需重做一次或用其他方法验证; 样品OD 405值/阴性对照OD 405值2 ,判为阴性。 若不满足B.3.1的质量控制要求,则不能进行结果判断。 7 SN/T53872021 附 录 C (规范性) 免疫层析试纸条检测 C.1 试剂 样品抽提缓冲液配制方法
21、按照B.1.5执行。 C.2 试纸条保存 试纸条应在2 8 冰箱内密封干燥保存。 C.3 检测步骤 C.3.1 样品准备 待测样品按第7章样品制备步骤制备(未离心的样品中存在大颗粒物质,影响液流上行,容易导致 检测效果不佳)。每一样品取约250 L至1.5 mL的离心管中,以能走完试纸条为宜。 C.3.2 样品检测 检测前将试纸条恢复至室温。 将试纸条T线一端垂直插入到样品液中,样品液高度不要超过试纸条上的MAX线。测试观察的 时间以3 min6 min为宜。对于病毒浓度低的样品时间可适当延长。 C.4 结果判定 质控C线显红色,测试T线显红色,检测结果为阳性。 质控C线显红色,测试T线未显色
22、,检测结果为阴性。 质控C 线和测试T 线均未显色,说明试纸条失效,检测结果无效。 C.5 试纸条是否有效的判断方法 用阳性对照进行测试,测试T 线显红色,质控C 线显红色,说明整个系统工作正常。 用阳性对照进行测试,测试T 线显红色,质控C 线未显色,说明羊抗兔失效。 用阳性对照进行测试,测试T 线未显色,质控C 线显红色,说明测试T 线的特异性抗体失效。 用阳性对照进行测试,若测试T 线未显色,质控C 线也未显色,说明整个测试纸条失效。 8 SN/T53872021 附 录 D (规范性) RT-PCR 检测 D.1 试剂 D.1.1 核酸提取试剂 Trizol或合格的RNA提取试剂盒。
23、D.1.2 电泳缓冲液TAE(50) 三羟甲基氨基甲烷( Tris ) 242 g 冰乙酸( C 2 H 4 O 2 ) 57.1 mL 乙二胺四乙酸二钠( Na2EDTA 2H 2 O ) 37.2 g 灭菌双蒸水定容至1 000 mL ,用时稀释至1TAE 。 D.2 检测步骤 D.2.1 核酸提取 称取0.1 g样品加液氮研磨成粉末状,迅速将其移入灭菌的1.5 mL离心管中,或将6.2制备的上 清液350 L移入1.5 mL离心管中;加入1 mL的TrizoL试剂,剧烈振荡3 min ; 4 12 000 g离心 10 min ;将上清液移入一新离心管中,加入0.5 mL三氯甲烷,猛烈振
24、荡15 s ; 4 12 000 g离心15 min ;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加入等体积异丙醇,混匀;室温静置10 min ; 4 12 000 g 离心10 min ,弃上清;加入1 mL 75%的冷乙醇洗涤沉淀; 4 10 000 g离心10 min ,弃乙醇;沉淀于室 温下充分干燥后溶于30 L DEPC-H 2 O中, -20 保存备用。 注: 此处以0.1 g样品为例进行核酸提取,实际检测时如样品量有变化,加入的试剂可按比例调整;或者按照商品化 RNA 提取试剂盒进行操作。 D.2.2 引物序列 根据已报道的LMV基因序列,自行设计引物,序列如下: 正向引物LMV-F :
25、 5 -CATCAACGCAGGGCTACATGGTAAACACA-3 ;反向引物LMV-R : 5 - TCCCGTTTTCTATACACCAAACCATCAATC-3 。 扩增片断长度约272 b p 。 D.2.3 反转录 反应体系: 20 L ;在0.2 mL PCR管中加入总RNA 1 L , dNTPs ( 10 mmol / L ) 1 L , DEPC-H 2 O 10 L ,反向引物LMV-R ( 20 mol / L ) 2 L , 70保温5 min ;冰上放置5 min ;再加入5反转录缓冲液 4 L , RNasin ( 40 U / L ) 1 L , M-MLV
26、( 200 U / L ) 1 L , 42保温1 h ,得到cDNA后用作PCR的 模板。 设置阳性对照、阴性对照及空白对照。 D.2.4 PCR扩增 PCR扩增体系见表D.1 ,共计20 L ;设置阳性对照、阴性对照及空白对照。 9 SN/T53872021 表D.1 PCR扩增体系 名称浓度加样量/ L 10PCR buffer (含M g 2+ ) 2 dNTPs 10 mmol / L 0.6 正向引物LMV-F 20 mol / L 0.5 反向引物LMV-R 20 mol / L 0.5 Taq DNA聚合酶2 U / L 1 模板 2 DEPC-H 2 O 13.4 反应程序:
27、 95 5 min ; 95 45 s , 58 45 s , 72 30 s , 35个循环; 72 10 min 。 注: 如采用商品化一步法RT-PCR试剂盒,可按照说明书进行操作,将步骤D.2.3和D.2.4合并进行。 D.2.5 琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNA Marker作为分 子量标记,进行电泳。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄 记录。 D.3 结果判定 如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期272 b p的条带,样品未出现预期大小的 条带,则可判定样品为LMV阴性。 如
28、果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期272 b p的条带,样品出现相同大小的条 带,则可判定样品为LMV阳性。 01 SN/T53872021 附 录 E (规范性) RT-RPA 检测 E.1 试剂 RT-RPA扩增试剂盒。其他试剂按照D.1执行。 E.2 检测步骤 E.2.1 核酸提取 按照D.2.1执行。 E.2.2 引物序列 按照D.2.2执行。 E.2.3 RT-RPA扩增 向含有酶的反应管中分别加入2反应缓冲液29.5 L ,正向引物LMV-F及反向引物LMV-R (均 为20 mol / L )各1 L ,醋酸镁( 280 mmol / L ) 2.5 L , DEP
29、C-H2O 14 L , RNA模板2 L ;轻轻吸打混 匀,放置于40 金属浴中反应40 min 。 E.2.4 产物检测 反应结束后向上述RT-RPA扩增产物中加入50 L苯酚/三氯甲烷( 1 : 1 )溶液,充分混匀后 12 000 r p m离心2 min ,取5 L上清液按比例与电泳上样缓冲液混匀,用DNA Marker作为分子量标 记,进行电泳1.5%的琼脂糖凝胶。电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条 带,并拍摄记录。 E.3 结果判定 如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期272 b p的条带,样品未出现预期大小的 条带,则可判定样品为LMV阴性
30、。 如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对照出现预期272 b p的条带,样品出现相同大小的条 带,则可判定样品为LMV阳性。 11 SN/T53872021 参 考 文 献 1 NewhallAG.SeedtransmissionofLettucemosaic.Ph y to p atholo gy , 1923 , 13 ( 2 ): 104-106. 2 DinantS , LotH.Lettucemosaicvirus.PlantPatholo gy , 1992 , 41 ( 5 ): 528-542. 3 Revers F , Lot H , Souche S , et al.
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