1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5178 2021 按蚊属分子鉴定方法 Molecular identification for genus Anopheles ICS 11.020 CCS C 62 2021-06-18 发布 2022-01-01 实施 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5178 2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国南京海关、中华
2、人民共和国福州海关、中华人民共和国北京 海关、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人：杨庆贵、何江、朱军、吴瑜凡、孙立新、张建庆、郭惠琳、黄恩炯、胡双双、 聂国嫒、袁大炜、郭天宇、陆永昌。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5178 2021 按蚊属分子鉴定方法 1范围 本文件规定了按蚊（ Anopheles Meigen,1818）成虫（包括肢体残缺不全的成虫）及蛹、幼虫、卵的。 本文件适用于按蚊属分子的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件，不注日期的引用文件
3、，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489实验室 生物安全通用要求 SN/T 1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程 SN/T 2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第 4 部分：实验室人员 SN/T 4278国境口岸医学媒介昆虫 DNA 条形码鉴定操作规程 SN/T 4629检疫性有害生物凭证标本核酸制备、保存与管理规范 WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3术语和定义 SN/T 4629 和 SN/T 4278 界定的术语和定义适用于本文件。 4原理 利用 BOLD 中规定的通用引物对线粒
4、体 DNA 中的 COI 基因的特定片段进行扩增，PCR 产物克隆 或者直接测序后，得到长度不少于 500 bp 的有效序列，跟 BOLD 系统中的数据进行比对，从而达到 物种快速准确鉴定的目的。 5引物 LCO1490 5null-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3null HCO2198 5null-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3null 6鉴定程序 6.1准备 实验室需具备的设备和试剂见附录 A，实验室生物安全应符合 GB 19489（所有部分）中的规定， 人员防护应符合 SN/T 2752.4（所有部分）中的的规定；PCR 防污染措施应按照
5、 WS/T 230 确定的执行。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5178 2021 6.2标本的处理 6.2.1取样 对所检测的标本进行唯一性标示。新鲜标本（包括卵、幼虫、蛹及成虫）及时冷冻或者毒瓶处死 后，投入大于90 %（体积分数）的酒精固定；截获的干燥标本和死标本直接投入大于90 %（体积分数） 的乙醇溶液固定。取样时，尽量减小组织块的体积，尽可能完整地保持凭证标本的形态特征，尤其是 具有重要分类意义的形态特征。 6.2.2凭证标本的制作 将采集或截获的按蚊制成标本，再将取样后的标本作为凭证标本，标本的制作和保存参照 SN/T 1876 执行。 6.3基因组 DNA 的抽提 6.3.
6、1样本的处理 取成蚊的 1 只腿、1 只蛹或 1 头幼虫或者 1 只卵，置于无 DNA 的洁净 1.5 mL 离心管中研磨至粉 末状或者糜状，根据实验室实际情况，选择试剂盒法或者酚 / 三氯甲烷法抽提 DNA。提取时应设置空 白对照。 6.3.2DNA 提取方法 6.3.2.1试剂盒法 按动物组织基因组 DNA 提取试剂盒的操作指导书进行基因组 DNA 的抽提。 6.3.2.2饱和酚 / 三氯甲烷法 细胞裂解后离心分离含核酸的水相，加入等体积的饱和酚溶液，14000 g 离心 5 min，转移上清 液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚溶液、三氯甲烷、异戊醇 (25:24:1)，14000 g
7、离心 5 min，转 移上清液至一新的离心管；加入等体积的饱和酚，14000 g 离心 5 min，转移上清液至一新的离心管； 加入 2 倍体积的无水乙醇，14000 g 离心 5 min，弃上清；加入 500 L 的 70 % 乙醇，14000 g 离心 1 min，弃上清，重复该步骤一次；室温或者 37 彻底干燥离心管，加入 50 L 经高压灭菌的 ddH 2 O溶 解 DNA ；提取的 DNA 保存在 4 备用，长期保存应 -20 以下冷冻保存。 6.4PCR 扩增 6.4.1PCR 扩增体系 根据实际情况，可以选择 50 L 体系，或者 25 L 体系。为了验证 PCR 体系有无污染，
8、应同时设 置空白对照和阴性对照。为了验证 PCR 反应是否正常，需要设置阳性对照。 50 L 体系见表 1。 表 1扩增体系 组分名称 体积 / L 缓冲液（10） 5 dNTP（2.5 mmol/L/each） 2 以正式出版文本为准 3 SN/T 5178 2021 组分名称 体积 / L 正向引物（20 mol/L） 1 反向引物（20 mol/L） 1 Taq DNA 聚合酶（5 U/ L） 0.5 模板 (50 ng/ L100 ng/ L) 3 ddH 2 O 37.5 25 L 体系各组分用量是 50 L 体系的一半。 6.4.2PCR 扩增条件 94 预变性 3 min ；94
9、 变性 30 s，50 退火 30 s，72 延伸 30 s，运行 29 个循环；72 延 伸 10 min。 6.5PCR 产物的检测 用 1TAE 缓冲液配成 1 % 的琼脂糖凝胶，检测是否有 PCR 产物及产物的质量，具体见附录 B。 6.6PCR 产物的纯化 如需要纯化，选用胶孔大的梳子，重新制胶、电泳，将目的片段连胶一起割下，按 PCR 产物纯 化试剂盒的操作指导书进行 PCR 产物的纯化。也可根据实际情况，委托测序公司进行纯化。 6.7PCR 纯化产物的测序 委托专业的测序公司进行 PCR 产物的直接测序，按照所选公司的特定要求进行送样。要求两端 测序或测通。有条件的实验室可以选择
10、克隆测序，克隆的流程见附录 C。 6.8序列的分析和比对 比对序列时，引物序列不包含在内。与 BOLD 系统（）中的数据进行比对， 比对流程见附录 D。各按蚊的 DNA 序列见附录 E。 7结果判定 BOLD 系统给出的序列相似度大于等于 99.0 % 者，直接鉴定为查询结果所显示的种类；序列相 似度小于 99.0 % 大于 98.0 % 者，需参考形态学特征进行综合判断，结论可做参考；序列相似度小于 等于 98.0 % 者，不作为结论进行种类判断。 表1 （续） 以正式出版文本为准 4 SN/T 5178 2021 附录A （规范性） 主要设备和试剂 A.1仪器和用具 普通台式离心机（相对离
11、心力大于 14 000 g）、各量程（2 L、10 L、20 L、100 L、200 L、 1 000 L）可调移液器、可调式恒温浴、PCR 工作站或者超净工作台、PCR 扩增仪、电泳仪、凝胶成 像系统、冰箱。 A.2试剂和材料 A.2.1试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。 乙醇、动物组织基因组 DNA 提取试剂盒、 Taq 酶、dNTP、PCR 产物纯化试剂盒、琼脂糖、DNA 标准分子量标、上样缓冲液、核酸染料、TAE 电泳液。 使用饱和酚 / 三氯甲烷法提取 DNA 需要饱和酚、三氯甲烷、异戊醇等试剂。 A.2.2水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。用于 PCR 的水要
12、使用高温高压灭菌的超纯水。 A.2.3耗材 1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 管、各量程的移液器 TIPS、无粉一次性手套。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5178 2021 附录B （资料性） PCR 产物检测过程 B.1制胶 用 1TAE 缓冲液配成 1 % 的琼脂糖凝胶，充分溶解后，降温至 50 左右，或者用手背碰触烧 瓶可以忍受的温度，按照核酸染料的说明加入适量的核酸染料，混匀。在制胶板上中加入梳子，倒入 适量的琼脂糖凝胶，室温凝固备用。 B.2点样 将制胶板和胶一起放入电泳槽内，带胶孔的一端位于负电极端，加入 1 倍的 TAE 电泳缓冲液 至完全浸没制胶板和胶。5 L
13、的 PCR 产物中加入 1 L 的 6 倍上样缓冲液，一个胶孔中加入 6 L的 DNA 标准分子量标，另一胶孔中加入 6 L 混入上样缓冲液的 PCR 产物。 B.3电泳 电压 5 V/cm，依据胶块的大小，时间在 20 min40 min 之间。将胶块整个移入凝胶成像仪，检 查有无目的片段，片段的大小应为 710 bp 左右，PCR 产物胶图见图 B.1。 说明：M ：DNA 标准分子量标；1 ：阳性对照；2 ：阴性对照；3 ：空白对照；49 ：目的片段 图 B.1PCR 产物胶图 以正式出版文本为准 6 SN/T 5178 2021 附录C （规范性） PCR 纯化产物的克隆测序流程 C.
14、1连接 用 T4 连接酶连接，选用 10T4 DNA 连接缓冲液：在无菌的离心管中加入 1 L 的 10T4 DNA 连接缓冲液，1 L 的 pGM-T 载体 (50 ng/ L)，1 L 的 T4 DNA 连接酶 (3 U/ L)，50 ng 纯化的目的 PCR 片段，用 ddH 2 O 补足 10 L，16 过夜连接。 C.2转化 向 10 L 的连接体系中加入 50 L 的感受态细胞，轻弹混匀，冰浴 30 min。然后将离心管置于 42 90 s，而后立即取出离心管置于冰浴中放置，期间不要摇动离心管。2 min后向离心管加入 800 L 37 预热的 LB 培养基（不含抗生素），150
15、r/min、37 振荡培养 45 min。 C.3涂布 将培养的菌液混匀，吸取 500 L 和 300 L 分别加入制备好的 LB 固体培养基 向铺好的 LB（含 有 100 g/mL 相应抗生素）固体培养基平板表面加入 5 L 的 IPTG(50 mg/mL)、20 L 的 X-gal(20 mg/ mL) 均匀涂布，避光晾干，待平板表面干燥后，倒置平板，37 培养 12 h16 h。以上过程均需在超 净工作台或者生物安全柜中进行。 C.4蓝白斑筛选及阳性克隆的验证 将 37 培养 12 h16 h 的平板上的菌落编号，使用灭菌的牙签挑取蓝色菌落周围的白色单菌落， 先接种在预先准备的对应编号
16、的 LB 固体培养基平板上以作备份，然后直接加入 PCR 反应体系（引物 同扩增引物）中振荡混匀，短暂离心后进行PCR反应。反应结束后取5 L产物，琼脂糖凝胶电泳检测， 扩增出目的片段者为阳性克隆。 C.5质粒 DNA 的提取和测序 将 PCR 检测出阳性的菌落用 LB（含有 100 g/mL 相应抗生素）培养基进行扩大培养，抽提质粒 DNA。委托专业的测序公司进行质粒 DNA 的测序，按照所选公司的特定要求进行送样。也可根据实 际情况，委托测序公司进行质粒 DNA 提取并测序。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5178 2021 附录D （资料性） BOLD 系统中种类鉴定流程 D.1进入
17、网站 登陆网址 D.1） 图 D.1 D.2点击 Identification 进入以下画面（见图 D.2） 图 D.2 以正式出版文本为准 8 SN/T 5178 2021 将序列以 Fasta 格式黏在上面的空格内，点击 Submit。 D.3得到报告 图 D.3 D.4结论 所查询的种类为乌头按蚊（ Anopheles aconitus Donitz,1902）。 以正式出版文本为准 9 SN/T 5178 2021 附录E （资料性） 常见按蚊的 DNA 鉴定参考序列 常见按蚊的 DNA 鉴定参考序列见表 E.1 表 E.1常见按蚊的 DNA 鉴定参考序列 蚊种 参考序列号 中华按蚊（
18、 Anopheles sinensis Wiedemann,1828） AB738318.1 须喙按蚊（ Anopheles barbirostris Wwlp,1884） AB436020.1 乌头按蚊（ Anopheles aconitus Donitz,1902） HQ877378.1 棋斑按蚊（ Anopheles tessellatus Theobald,1901） AB738146.1 美彩按蚊（ Anopheles splendidus Koidzumi,1920） KF406678.1 多斑按蚊（ Anopheles Maculatus Theobald,1901） KT382822.1 以正式出版文本为准 SN/T 5178 2021 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 24 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517598 定价 16.00 元 按蚊属分子鉴定方法 行 业 标 准 SN/T 51782021 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
