1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5179 2021 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 11. 020 CCS C 62 2021-06-18发布 2022-01-01实施 二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品 制备方法 Protocol for sample preparation of cockroach-borne bacteria detection with next-generation sequencing 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5179 2021 前 言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：
2、标准化文件的结构和起草规则的规 定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关。 本文件主要起草人：陈健、邱德义、刘恭源、魏晓雅、刘德星、李婷婷、岳巧云。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5179 2021 二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品 制备方法 1范围 本文件规定了蜚蠊携带细菌性样品进行二代测序检测的样本采集、前处理、体内外携带细菌的 收集及基因组DNA的获取和扩增等操作程序。 本文件适用于利用二代测序技术对本底调查或口岸截获的蜚蠊携带未知细菌进行高通量检测鉴 定的样品制备工作。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文
3、中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489实验室生物安全通用要求 SN/T 2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员 SN/T 42782015国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程 WS/T 230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 引物标记primer marker 在常规引物5端加入的一段612个随机设计的碱基序列，用
4、于标记并区分特定样品的扩增反应。 3.2 标签引物labeled primer 由引物标记加常规引物两部分构成，每一个样品进行PCR扩增时需保证使用的一对引物中，至 少有一条与其他样品使用的引物标记不同。 3.3 高成功率PCR酶high success rate PCR polymerase 可成功扩增普通 Taq DNA聚合酶难以扩增样品的一类新型DNA聚合酶。针对含多种PCR扩增抑 制物质的粗样品，该酶具有优良的延伸性。常见的有KODFX系列等。 4要求 实验室的生物安全应符合GB 19489要求，实验室人员防护应符合SN/T 2752.4要求，实验中用水 以正式出版文本为准 2 SN/
5、T 5179 2021 应符合GB/T 6682要求，PCR 扩增检测应符合WS/T 230、SN/T 4278要求。 进行样本携带细菌的收集处理前，应先完成蜚蠊种类的鉴定。 5仪器设备及试剂耗材 5.1仪器设备 普通台式离心机（最大相对离心力大于14 000 g）、各量程可调移液器（10 L、20 L、100 L、 200 L、1 000 L）、可调式恒温浴、PCR工作站或者超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系 统、冰箱、超低温冰箱等。 5.2试剂耗材 分析纯无水乙醇、0.9% NaCl溶液、高成功率PCR酶、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、PCR反应 缓冲液、琼脂糖、DNA标准分子
6、量标、核酸染料、TAE电泳液、双蒸水（ddH 2 O）等。 离心管（10 mL、1.5 mL）、PCR管（0.2 mL）、各量程的移液器吸头（10 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L）、一次性无粉手套等。 6蜚蠊的采集、保存和运输 将每只蜚蠊标本单独分装在灭菌的采集管或者50 mL的离心管中。使用冷藏运输箱（-20 或更 低温度）转运样品。样品送达实验室后，待测样本可放置于-80 冰箱中冷冻30 min。用于转移和处 理标本的镊子和离心管等器械和耗材均需高压灭菌，不易高温、高压灭菌的用75 %乙醇擦拭灭菌。 7操作程序 7.1体表携带细菌的收集 取1只蜚蠊置于10 mL离心管
7、中，加入3 mL生理盐水，800 r/min旋涡振荡30 s，短暂离心。收集 上清液转移至新的10 mL离心管中，13 800 g离心2 min。弃上清液，留沉淀。重复以上步骤3次。将 收集的细菌沉淀物，加入500 L生理盐水悬浮后合并，4 保存备用。 收集废弃液高压灭菌后丢弃。 7.2体内携带细菌的收集 将7.1处理后的蜚蠊移入10 mL的灭菌离心管中，加入5 mL 75% 乙醇浸泡5 min，重复3次；将蜚 蠊转移至新的10 mL的灭菌离心管中，然后加入5 mL 0.9% NaCl溶液，800 r/min旋涡振荡30 s，弃上 清液，以上步骤重复3次。 将样本放置在生物安全柜中晾干15 m
8、in。用灭菌镊子将样本移入新的 10 mL离心管中，将标本研 碎成糊状。 加入3 mL生理盐水，800 r/min旋涡振荡30 s，短暂离心，将上清液转移至新的10 mL离心管中， 13 800 g 离心2 min，弃上清液，留沉淀。重复以上收集步骤3次，将收集的细菌沉淀物，加入500 L 生理盐水悬浮后合并，4 保存备用。 收集废弃液高压灭菌后丢弃。 7.3细菌基因组DNA的提取 将装有菌液的离心管13 800 g 离心2 min，转移上清液并高压灭菌处理。收集的细菌使用细菌基 因组DNA提取试剂盒（含溶菌酶消化）或使用核酸自动提取仪提取细菌基因组DNA，提取的基因组 以正式出版文本为准 3
9、 SN/T 5179 2021 DNA保存在4 冰箱作为模板DNA备用。 7.4PCR扩增 7.4.1引物 不同测序公司使用的引物标记不同。引物标记可咨询测序公司获得，也可自行设计，在测序时 需将自行设计的引物标记告知测序公司。 标签引物： 引物标记+ 5 -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3 引物标记+ 5 -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3 7.4.2PCR扩增体系 PCR扩增体系见表1。 表1PCR扩增体系（50 L） 组分名称 体积/ L 缓冲液（2） 25 dNTP（2 mmol/L） 2.5 高成功率PCR酶（1 U/ L） 1 正向引物（20 mol/L）
10、1 反向引物（20 mol/L） 1 模板DNA 3 ddH 2 O 16.5 7.4.3PCR扩增条件 94 预变性2 min；98 变性10 s，50 退火30 s，68 延伸30 s，30个循环；68 延伸 10 min；10 保温。 7.5PCR产物检测和纯化 参见SN/T 42782015中7.4和7.5规定执行操作。 7.6PCR产物浓度测定 使用DNA浓度测定仪对PCR产物浓度和质量进行检测，以DNA溶解溶液做参比，分别测定样品 溶液在260 nm、280 nm、230 nm、270 nm处的吸收值，计算A 260 /A 280 、A 260 /A 230 、A 260 /A 2
11、70 的值，同时 满足以下条件的DNA样品可视为质量高的基因组DNA：A 260 /A 280 为1.81.9，A 260 /A 230 大于2.0，A 260 / A 270 为1.11.3。 利用A 260 =1相当于50 g/mL的双链DNA计算DNA浓度，要求PCR产物的DNA总量大于等于 2 g，浓度大于等于50 ng/ L。 8PCR产物样品的寄送 根据测序公司提供的表格模板，填写DNA样品信息单，使用干冰冷冻PCR产物邮寄至测序公司 进行测序，并明确标注寄送样品为PCR产物和片段大小。送样前需与测序公司联系，若其有其他送 样要求，应符合该测序公司要求。 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.5 字数 12 千字 2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175108 定价 16.00 元 二代测序法检测蜚蠊携带细菌性样品 制备方法 行 业 标 准 SN/T 51792021 * * * SN/T 5179 2021 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7531 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
