1、ICS 11.220CCSB 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1064.22021绿 孔 雀 检 疫 技 术 第 2部 分 ： 禽 流 感 病 毒实 验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantinetechniquefor Pavo muticusPart2:TechnicalspecificationsforlaboratoryexaminationofAvian Influenza Virus 2021- 09-30发 布 2021-10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/T 1064.22021 I 目 次前 言 .III引 言 .
2、1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .25 总 则 .26 禽 流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型 .2 7 仪 器 设 备 和 试 剂 .37.1 实 验 室 器 材 .37.2 试 剂 .38 样 品 .38.1 采 样 要 求 与 原 则 .38.2 采 样 类 型 和 采 样 方 法 .38.3 样 品 储 运 .49 试 验 步 骤 .49.1 样 品 制 备 .49.2 鸡 胚 接 种 .49.3 MDCK细 胞 培 养 .4 9.4 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验 和 血 凝 抑 制 （
3、HI） 试 验 .59.5 逆 转 录 -聚 合 酶 链 式 反 应 （ RT-PCR） 扩 增 检 测 .59.6 H蛋 白 序 列 分 析 .710 试 验 数 据 处 理 .710.1 HA试 验 结 果 判 定 .710.2 HI试 验 结 果 判 定 .710.3 核 酸 检 测 结 果 判 定 .8附 录 A（ 规 范 性 ） 缓 冲 溶 液 和 1%鸡 红 细 胞 悬 液 .9附 录 B（ 资 料 性 ） 采 样 记 录 表 .10 DB53/T 1064.22021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准
4、 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 的 第 2部 分 。 DB53/T1064已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 2部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 4部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的
5、 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 ： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 陈 培 富 、 黄 艳 梅 、 卓 娜 、 李 建 春 、 胡 世 享 、 杨 俊 、 钱 丽 敏 、 何 依 蓉 、 邹 丰 才 、杨 建 发 。 DB53/T 1064.22021
6、 引 言绿 孔 雀 （ Pavo muticus） 在 我 国 仅 分 布 于 云 南 ， 是 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物 ， 也 是 全 球 濒 危 物 种 ，并 已 列 入 濒 危 野 生 动 植 物 种 国 际 贸 易 公 约 (CITES)和 世 界 自 然 保 护 联 盟 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 为切 实 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 野 生 动 物 保 护 法 和 中 华 人 民 共 和 国 动 物 防 疫 法 ， 编 制 并 发 布 DB53/T1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 地 方 标 准 ， 可 让 从 事 绿 孔 雀 保 护 的 相
7、关 人 员 按 标 准 化 和 规 范 化 程 序 开 展 绿 孔 雀 病 原学 诊 断 ， 从 而 采 取 必 要 的 防 治 措 施 ， 以 提 高 染 疫 绿 孔 雀 的 成 活 率 ， 维 护 绿 孔 雀 种 群 健 康 和 地 区 生 态 平 衡 ，提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 仪器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方
8、面 制 定 了 规 范 ； 第 2部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 禽流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方面 制 定 了 规 范 ； 第 3部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 羽 虱 实 验 室 检 测 的 原 理 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据
9、 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 4部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、常 见 线 虫 形 态 特 征 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定了 规 范 。 DB53/T 1064.22021 1 绿 孔 雀 检 疫 技 术第 2部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示 ： 由 于 禽 流 感 病 毒 可 感 染 人 类 ， 采
10、 样 和 检 测 人 员 应 穿 戴 防 护 服 及 口 罩 ， 并 采 取 必 要 的 消 毒措 施 。 涉 及 禽 流 感 病 毒 的 实 验 操 作 ， 应 在 相 应 的 生 物 安 全 级 别 实 验 室 （ 符 合 GB19489的 要 求 ） 进 行 。 本检 测 技 术 规 范 中 凡 接 触 病 毒 样 品 的 检 验 器 材 、 废 弃 物 及 其 包 装 物 均 应 做 消 毒 或 灭 菌 等 无 害 化 处 理 ， 以 免污 染 环 境 或 扩 散 病 毒 。1 范 围本 文 件 规 定 了 绿 孔 雀 （ Pavo muticus） 检 疫 技 术 中 禽 流 感 病
11、 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 禽 流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 和 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 绿 孔 雀 检 疫 技 术 中 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 标 注 日 期 的 引 用 文件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 标 注 日 期
12、 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适用 于 本 文 件 。GB19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求NY/T541 兽 医 诊 断 样 品 采 集 、 保 存 与 运 输 技 术 规 范3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 禽 流 感 avianinfluenza禽 流 感 是 由 正 粘 病 毒 科 （ Orthomyxoviridae） 甲 型 流 感 病 毒 属 （ Influenzavirus A） 成 员 引 起 禽 类 的 一种 急 性 、 全 身 出 血 性 传 染
13、 病 。3.2 病 毒 血 凝 viralhemagglutination具 有 血 凝 活 性 的 病 毒 （ 如 流 感 病 毒 ） 粒 子 ， 凭 借 其 表 面 的 血 凝 素 识 别 、 结 合 特 定 动 物 红 细 胞 表 面 受体 并 使 红 细 胞 凝 集 （ 即 红 细 胞 不 再 自 然 下 沉 汇 集 ） 。3.3 病 毒 血 凝 抑 制 viralhemagglutinationinhibition抗 体 特 异 性 结 合 于 具 有 血 凝 活 性 的 病 毒 粒 子 的 血 凝 素 （ H） 抗 原 位 点 ， 干 扰 病 毒 H蛋 白 与 红 细 胞 受体 之
14、 间 的 结 合 ， 从 而 阻 断 或 抑 制 病 毒 粒 子 凝 集 红 细 胞 的 能 力 。 3.4 反 转 录 -聚 合 酶 链 式 反 应 reversetranscription-polymerasechainreaction DB53/T 1064.22021 2 以 RNA（ mRNA） 为 模 板 ， 经 逆 转 录 酶 催 化 生 成 cDNA， 再 以 cDNA为 模 板 进 行 聚 合 酶 链 式 反 应（ PCR） 扩 增 ， 常 用 于 获 得 目 的 基 因 或 检 测 mRNA表 达 。3.5 弗 林 蛋 白 furin亦 称 作 成 对 碱 性 氨 基 酸
15、裂 解 酶 ， 是 动 物 细 胞 产 生 的 内 切 蛋 白 酶 ， 能 识 别 、 裂 解 流 感 病 毒 血 凝 素 （ H）蛋 白 中 存 在 的 R-X-X-R位 点 ， 产 生 H1和 H2两 个 亚 基 ， 以 形 成 具 有 感 染 活 性 的 流 感 病 毒 粒 子 。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。AIV： 禽 流 感 病 毒 Avian influenza virusAMV： 禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 Avian myeloblastosis virus DEPC： 焦 碳 酸 二 乙 酯 DiethypyrocarbonatedNTP：
16、 脱 氧 核 苷 酸 DeoxyribonucleotidetriphosphateH： 血 凝 素 HemagglutininHA： 血 凝 HemagglutinationHAU： 血 凝 单 位 HemagglutinationunitHEPES： 4-羟 乙 基 哌 嗪 乙 磺 酸 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacidHI： 血 凝 抑 制 HemagglutinationinhibitionHPAI： 高 致 病 性 禽 流 感 HighlypathogenicavianinfluenzaM： 基 质 蛋 白 Matrix
17、proteinMDCK： 犬 肾 传 代 细 胞 Madin-DarbykidneycellsN： 神 经 氨 酸 酶 NeuraminidasePBS： 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 Phosphate-bufferedsalinePCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerasechainreaction RBCs： 红 细 胞 RedbloodcellsRNA： 核 糖 核 酸 RibonucleicacidRT-PCR： 反 转 录 -聚 合 酶 链 式 反 应 Reversetranscription-polymerasechainreactionSPF： 无 特 定 病 原
18、体 Specificpathogenfree5 总 则5.1 鸡 胚 接 种 和 MDCK细 胞 培 养 均 是 分 离 禽 流 感 病 毒 的 有 效 方 法 ， 检 测 流 感 病 毒 时 ， 根 据 具 体 情 况 选用 其 一 ， 或 同 时 采 用 。5.2 取 5.1收 获 的 尿 囊 液 或 MDCK细 胞 培 养 物 上 清 做 HA试 验 和 HI试 验 ， 确 定 分 离 毒 株 的 种 属 及 血 清 型（ 亚 型 ） 。5.3 对 5.1或 5.2分 离 毒 株 采 用 RT-PCR扩 增 分 析 其 M基 因 ， 做 出 禽 流 感 病 毒 定 性 鉴 定 。5.4
19、对 5.2确 定 的 禽 流 感 病 毒 H5、 H7或 H9血 清 亚 型 的 分 离 毒 株 ， 用 血 清 亚 型 特 异 性 引 物 做 RT-PCR扩 增 检 测 其 H基 因 ， 并 依 据 H基 因 测 序 结 果 判 定 分 离 毒 株 的 致 病 性 程 度 。6 禽 流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型 DB53/T 1064.22021 3 根 据 禽 流 感 病 毒 致 病 性 或 毒 力 的 不 同 ， 可 以 将 禽 流 感 分 为 高 致 病 性 禽 流 感 、 低 致 病 性 禽 流 感 和 无 致病 性 禽 流 感 。 已 知 流 感
20、 病 毒 可 分 为 18个 H亚 型 和 11个 N亚 型 。 其 中 ， 由 H5和 H7亚 型 毒 株 （ 以 H5N1和 H7N7为 代 表 ） 引 起 的 禽 流 感 通 常 为 HPAI， 其 传 染 性 强 ， 死 亡 率 高 、 危 害 大 。7 仪 器 设 备 和 试 剂7.1 实 验 室 器 材PCR仪 、 凝 胶 成 像 系 统 、 台 式 低 温 高 速 离 心 机 、 电 泳 仪 、 电 泳 槽 、 冰 箱 、 微 量 移 液 器 、 水 浴 锅 、 照胶 仪 、 手 术 器 械 、 棉 拭 子 、 离 心 管 、 抗 凝 管 、 一 次 性 滤 器 （ 滤 膜 孔
21、径 0.45m） 、 细 胞 培 养 瓶 、 V形 孔 血凝 反 应 板 、 微 型 振 荡 器 等 。7.2 试 剂 RNA提 取 试 剂 或 试 剂 盒 、 氯 仿 、 异 丙 醇 、 75%乙 醇 、 1.0%琼 脂 糖 凝 胶 、 阿 氏 液 （ Alseverssolution）（ 见 附 录 A.1） 、 1% 鸡 红 细 胞 悬 液 （ 见 附 录 A.2） 、 0.01mol/LPBS（ pH7.2） 、 核 酸 染 料 、 标 准 禽 流感 病 毒 抗 原 与 参 考 毒 株 、 阳 性 对 照 血 清 、 阴 性 对 照 血 清 、 MDCK 细 胞 、 DMEM 培 养
22、基 、 青 霉 素 、 链霉 素 、 HEPES、 胰 蛋 白 酶 、 引 物 、 10扩 增 反 应 缓 冲 液 、 dNTPs（ 每 种 核 苷 酸 2.5mmol/L） 、 琼 脂 糖 、核 酸 上 样 缓 冲 液 、 胶 回 收 试 剂 盒 等 。8 样 品8.1 采 样 要 求 与 原 则8.1.1 采 样 要 求采 样 应 符 合 NY/T541的 要 求 。 8.1.2 采 样 原 则采 集 的 样 品 应 具 有 典 型 性 ， 从 濒 死 、 死 亡 或 处 于 急 性 发 病 期 的 绿 孔 雀 采 集 样 品 ， 对 暴 发 疫 病 的 群 体宜 采 集 多 只 发 病
23、或 死 亡 绿 孔 雀 的 样 品 。 采 样 过 程 应 无 菌 操 作 ， 装 样 品 的 容 器 应 确 保 密 封 完 好 ， 注 意 避 免被 污 染 以 及 污 染 环 境 ， 并 及 时 填 写 采 样 记 录 表 （ 见 附 录 B） ， 确 保 样 品 编 号 与 标 签 一 致 。8.2 采 样 类 型 和 采 样 方 法8.2.1 口 咽 拭 子 和 泄 殖 腔 拭 子采 样 方 法 如 下 ：a) 取 咽 喉 拭 子 时 ， 将 拭 子 深 入 孔 雀 喉 头 口 及 上 颚 裂 来 回 刮 3次 5次 取 咽 喉 分 泌 液 ；b) 取 泄 殖 腔 拭 子 时 ， 将
24、 拭 子 深 入 孔 雀 泄 殖 腔 转 一 圈 并 沾 取 少 量 内 容 物 ；c) 同 一 个 体 的 咽 喉 拭 子 和 泄 殖 腔 拭 子 合 并 放 入 预 先 盛 有 1.0mLPBS（ 含 100IU/mL青 霉 素 和 100g/mL链 霉 素 ） 的 离 心 管 中 ， 盖 紧 管 盖 ， 并 对 样 品 编 号 。 8.2.2 组 织 样 品若 绿 孔 雀 死 亡 在 24h以 内 ， 则 适 合 采 集 组 织 样 品 。 每 只 绿 孔 雀 采 集 肺 （ 或 气 管 ） 、 脑 、 心 、 肝 、脾 、 胃 、 肾 等 组 织 各 1份 ， 数 量 均 宜 不 少
25、于 3g。 待 检 样 品 装 入 一 次 性 密 封 袋 或 其 它 灭 菌 容 器 ， 确 保 密封 完 好 ， 编 号 ， 送 实 验 室 。 DB53/T 1064.22021 4 8.2.1 血 清每 只 孔 雀 采 集 静 脉 血 2mL 3mL， 盛 于 无 菌 器 皿 中 或 10mL离 心 管 中 ， 37 静 置 1h或 4 静置 3h 4h， 经 2000r/min3000r/min 离 心 15min 分 离 血 清 ， 将 血 清 移 、 分 装 于 新 的 无 菌 离 心 管 ， 盖紧 ， 封 好 管 口 ， 贴 上 标 签 。刚 死 亡 的 绿 孔 雀 可 用 无
26、 菌 注 射 器 从 其 心 脏 采 血 ， 直 接 转 移 至 无 菌 离 心 管 中 ， 密 封 ， 编 号 ， 同 法 分 离血 清 。8.3 样 品 储 运8.3.1 口 咽 及 泄 殖 腔 拭 子拭 子 样 品 在 4 条 件 下 保 存 不 应 超 过 24h， 若 长 期 保 存 ， 应 置 于 80 冰 箱 。8.3.2 组 织 样 品 组 织 样 品 应 冰 冻 （ 20 以 下 ） 保 存 和 运 输 ， 且 不 能 反 复 冻 融 。8.3.3 血 清一 周 内 做 检 查 的 血 清 可 置 4 冰 箱 保 存 。 若 长 时 间 保 存 ， 应 将 血 清 放 入 2
27、0 或 80 冰 箱 冻 存 。9 试 验 步 骤9.1 样 品 制 备9.1.1 口 咽 及 泄 殖 腔 拭 子用 经 灭 菌 的 镊 子 将 拭 子 中 的 液 体 充 分 挤 出 ， 混 匀 样 品 ， 直 至 拭 子 上 没 有 肉 眼 可 见 的 样 品 ， 室 温 放 置30min， 4 3000r/min离 心 15min， 转 移 上 清 液 于 1.5mL无 菌 离 心 管 内 ， 编 号 备 用 。 9.1.2 组 织 样 品取 适 量 待 检 样 品 置 于 洁 净 、 灭 菌 并 烘 干 的 研 钵 中 ， 加 入 液 氮 充 分 研 磨 。 按 1g 组 织 样 品
28、加 10mLPBS的 比 例 混 匀 ， 4 3000r/min离 心 15min， 取 上 清 液 转 入 1.5mL 无 菌 离 心 管 内 ， 编 号 ， 备 用 。9.2 鸡 胚 接 种9.2.1 样 品 处 理取 9.1得 到 的 上 清 液 过 滤 ， 滤 过 液 作 为 接 种 材 料 。9.2.2 样 品 接 种取 9.2.1样 品 ， 以 0.2mL/胚 剂 量 经 尿 囊 腔 途 径 接 种 9d 11dSPF鸡 胚 ， 每 个 样 品 接 种 3 5枚 鸡 胚 ，封 闭 进 针 孔 ， 在 37 孵 化 箱 内 孵 育 ， 每 隔 12h观 察 鸡 胚 死 亡 情 况 。
29、 无 菌 收 集 24h96h死 亡 鸡 胚 及 96h仍 存 活 鸡 胚 的 尿 囊 液 ， 采 用 HI试 验 测 定 尿 囊 液 有 无 HA活 性 。 9.3 MDCK细 胞 培 养具 体 操 作 步 骤 如 下 ： DB53/T 1064.22021 5 a) 将 样 品 滤 过 液 接 种 于 长 成 致 密 单 层 的 MDCK 细 胞 瓶 内 ， 置 于 35 37 、 含 5%CO2 培 养箱 内 培 养 ， 使 病 毒 吸 附 细 胞 2h；b) 弃 掉 样 品 液 ， 用 DMEM 维 持 液 （ 含 3%犊 牛 血 清 ） 洗 一 遍 ， 每 瓶 加 入 5mLDMEM
30、 维 持 液 ，置 于 35 37 、 5%CO2培 养 箱 内 培 养 。 维 持 液 成 份 ： DMEM 培 养 基 ， 青 霉 素 、 链 霉 素 、HEPES、 胰 酶 终 浓 度 分 别 为 100IU/mL、 100g/mL、 25mmol/L和 2g/mL， 用 NaHCO3 将pH值 调 整 为 7.2， 过 滤 除 菌 ， 无 菌 检 验 合 格 ；c) 逐 日 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 病 变 ， 分 别 取 阴 性 对 照 、 未 出 现 病 变 的 和 出 现 病 变 的 细 胞 培 养 物上 清 液 ， 用 HA试 验 测 定 病 毒 的 血 凝
31、滴 度 （ 效 价 ） ；d) 当 75% 100%细 胞 出 现 病 变 时 收 获 病 毒 ， 将 细 胞 瓶 放 于 70 冰 箱 ， 冻 融 1 2次 以 使 细 胞 破裂 及 释 放 病 毒 。9.4 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验 和 血 凝 抑 制 （ HI） 试 验9.4.1 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验 方 法 ：a) 在 96孔 V型 微 量 反 应 板 ， 每 孔 预 先 加 25LPBS；b) 向 第 1孔 加 入 25L病 毒 溶 液 （ 尿 囊 液 或 细 胞 培 养 物 上 清 ） ， 反 复 吹 吸 3次 5次 混
32、匀 ；c) 从 第 1孔 吸 取 25L病 毒 溶 液 加 入 第 2孔 ， 混 匀 后 吸 取 25L加 入 第 3孔 ， 如 此 进 行 2倍 连 续稀 释 至 第 11孔 ， 从 第 11孔 吸 取 25L溶 液 弃 去 ， 但 第 12孔 加 入 25LPBS或 正 常 尿 囊 液 作为 阴 性 对 照 孔 ；d) 每 孔 加 入 25LPBS；e) 每 孔 加 入 25L1%鸡 红 细 胞 悬 液 ；f) 轻 轻 振 荡 血 凝 反 应 板 以 混 匀 反 应 体 系 ， 室 温 （ 20 25 ） 静 置 40min， 或 4 静 置 60min，当 阴 性 对 照 孔 的 红 细
33、 胞 在 孔 底 汇 集 成 原 点 时 判 定 结 果 。9.4.2 病 毒 血 凝 抑 制 （ HI） 试 验病 毒 血 凝 抑 制 （ HI） 试 验 方 法 ： a) 在 96孔 血 凝 反 应 板 ， 每 孔 预 先 加 入 25LPBS；b) 向 第 一 孔 加 入 25L血 清 样 品 ， 混 匀 ；c) 在 血 凝 反 应 板 上 将 血 清 作 横 向 的 2倍 连 续 稀 释 ， 但 第 12孔 、 第 13孔 、 第 14孔 和 第 15孔 分 别设 置 为 加 25LPBS的 红 细 胞 对 照 孔 、 加 未 做 任 何 免 疫 禽 血 清 的 阴 性 对 照 孔 、
34、 加 新 城 疫 病 毒 抗体 的 对 照 孔 和 加 禽 腺 病 毒 抗 体 的 对 照 孔 （ 对 已 确 定 禽 流 感 病 毒 血 清 亚 型 的 分 离 毒 株 ， 还 可 设 置阳 性 对 照 孔 ） ；d) 每 孔 加 入 25L4HAU 的 病 毒 抗 原 ， 室 温 （ 20 25 ） 静 置 不 少 于 30min， 或 4 静 置 不少 于 60min；e) 每 孔 加 入 25L1%RBCs， 轻 轻 振 荡 混 匀 ， 室 温 （ 20 25 ） 静 置 约 40min， 或 4 放 置约 60min， 当 红 细 胞 对 照 孔 呈 显 著 钮 扣 状 时 判 定
35、结 果 。9.5 逆 转 录 -聚 合 酶 链 式 反 应 （ RT-PCR） 扩 增 检 测9.5.1 病 毒 RNA的 提 取 可 用 商 品 化 RNA提 取 试 剂 盒 提 取 待 检 样 品 （ 棉 拭 子 、 组 织 或 鸡 胚 尿 囊 液 ） 、 阳 性 对 照 样 品 及 阴 性对 照 样 品 的 病 毒 RNA。 也 可 用 RNA提 取 试 剂 （ 如 Trizol） 提 取 ， 方 法 如 下 ：a) 将 经 预 处 理 的 250L待 检 样 品 加 入 750LRNA提 取 试 剂 中 ， 振 荡 2min， 室 温 放 置 5min； DB53/T 1064.220
36、21 6 b) 加 入 250L氯 仿 ， 在 微 型 振 荡 器 上 振 荡 1min， 室 温 放 置 5min， 4 、 12000r/min（ 约 14000g）离 心 15min；c) 转 移 上 层 水 相 至 新 离 心 管 中 ， 加 入 等 量 的 异 丙 醇 ， 充 分 混 匀 ， 室 温 放 置 15min， 4 条 件 下12000r/min（ 约 14000g） 离 心 15min；d) 小 心 吸 弃 上 清 ， 加 入 预 先 经 DEPC处 理 的 75%乙 醇 750L， 4 、 12000r/min（ 约 14000g）离 心 5min；e) 小 心 吸 弃
37、 上 清 ， 将 沉 淀 自 然 风 干 或 于 50 烘 干 ， 加 适 量 的 经 DEPC处 理 的 超 纯 水 溶 解 ；f) 取 5L提 取 物 与 1L6核 酸 上 样 缓 冲 液 混 匀 ， 做 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 查 RNA 提 取 效 果 ，对 组 织 样 品 观 测 到 28S、 18S及 5.8SrRNA三 个 条 带 或 至 少 前 两 个 条 带 ， 提 示 RNA提 取 合 格 ；g) 提 取 的 RNA应 在 2h 内 进 行 RT 或 RT-PCR 扩 增 ， 若 需 长 期 保 存 RNA， 应 置 于 80 冰 箱 或液 氮 内 。9.5.2 RT-PCR扩 增 （ 一 步 法 ） 取 提 取 的 RNA3L 和 每 对 引 物 （ 见 表 1） 各 1L， 配 制 RT-PCR 扩 增 体 系
