1、 DB53/T 1052.3 2021 云南省地方标准 云上黑山羊养殖规范 第 3 部分： 胚胎移植 2021 - 05 - 25 发布 2021 - 08 - 25 实施 ICS 65.020.30 CCS B 43 53 云南省市场监督管理局 发布 DB53/T 1052.3 2021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件是DB53/T 1052云上黑山羊养殖规范的第3部分。DB53/T 1052分为以下8部分： 第1部分：品种； 第2部分：人工授精； 第3部分：胚胎移植； 第4部分：营养需要； 第5部分：粗
2、饲料； 第6部分：饲养管理； 第7部分：疫病防治； 第8部分：羊舍及辅助设施。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由云南省农业农村厅提出。 本文件由云南省农业标准化专业技术委员会（YNTC07）归口。 本文件起草单位：云南省畜牧兽医科学院、云南省种羊繁育推广中心、曲靖市沾益区饲草饲料工作 站。 本文件主要起草人：邵庆勇、洪琼花、赵智勇、兰蓉、李卫娟、杨红远、权国波、寸金全、丁艳。 DB53/T 1052.3 2021 II 引言 种、料、管、防及养殖设施设备是畜牧产业的重要环节和基础。DB53/T 1052-2021云上黑山羊养 殖规范是以201
3、9年4月国家审定新品种“云上黑山羊”为载体制定综合养殖标准，旨在从品种、繁殖、 营养、饲料、管理、疫病、设施等环节指导和规范云上黑山羊养殖，带动云上黑山羊规范化、标准化、 产业化发展的同时，可提高养殖场（户）养殖水平和养殖效益，促进云南肉羊产业高质量发展。 DB53/T 1052-2021由八个部分构成。 第 1 部分：品种。目的在于确立云上黑山羊特征和特性、生产性能和等级评定，适用于云上黑 山羊品种鉴定和种羊等级评定。 第 2 部分：人工授精。目的在于确立开展云上黑山羊人工授精采精用种公羊选择、采精、精液 检查、精液保存、冻精质量评价、母羊发情鉴定和输精等技术要求。 第 3 部分：胚胎移植。
4、目的在于确立开展云上黑山羊快速扩繁时供体羊的选择与饲养管理、超 数排卵与配种、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存与解冻、胚胎移植等技术要求。 第 4 部分：营养需要。目的在于确立云上黑山羊养殖过程中各生长和生理阶段羊营养需要量。 第 5 部分：粗饲料。目的在于确立云上黑山羊养殖过程中主要青绿饲料、青干草、秸秆和全株 玉米青贮要求。 第 6 部分：饲养管理。目的在于确立云上黑山羊饲养管理的基本要求、配种、各类羊只的饲养 管理、一般管理技术等内容。 第 7 部分：疫病防治。目的在于确立云上黑山羊饲养场的卫生要求、引种、传染病防控、寄生 虫病防治与无害化处理等要求。 第 8 部分：羊舍及辅助设施。
5、目的在于确立云上黑山羊养殖场建设的选址、规划与布局原则， 羊舍和饲养密度，羊舍和辅助设施建设等内容。 规范养殖过程中，从关键的生产环节开始。DB53/T 1052-2021 包含的八部分内容均是符合生产实 际需要，相互对接，涵盖了生产环节中的品种、繁殖、营养、饲料、管理、疫病防治，同时结合了科学 合理的饲养设施。该标准可规范养殖过程，充分发挥云上黑山羊生产性能，提高养殖水平，节本增效， 促进规模化标准化养殖的构建。 DB53/T 1052.3 2021 1 云上黑山羊养殖规范 第 3 部分：胚胎移植 1 范围 本文件确立了供体羊的选择与饲养管理、超数排卵和配种、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻
6、保 存与解冻、胚胎移植等技术要求。 本文件适用于云上黑山羊扩繁。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 826 绵羊胚胎移植技术规程 NY 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 DB53/T 1052.2 云上黑山羊养殖规范 第 2部分：人工授精 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 供体羊的选择与饲养管理 4.1 供体羊的选择 供体羊选择应符合以下条件： a) 符合云上黑山羊的典型特征，一级及
7、以上等级，系谱清楚，遗传性能稳定； b) 健康、体质健壮、中等及以上膘情； c) 发情周期正常，生殖机能正常，无遗传性或传染性疾病； d) 年龄 1.5 周岁 4 周岁，体重 40 kg 以上，空怀； e) 经产母羊产后 90 d 以上，羔羊已断奶，生殖机能恢复正常； f) 重复超排间隔时间在 60 d 以上。 4.2 饲养管理 供体羊的饲养管理应满足以下要求： a) 分群饲养，专人管理； b) 保持饲养环境相对稳定，饲养环境卫生、干燥、圈舍温度适宜，避免应激反应； c) 营养均衡，饮用水符合 NY 5027 的要求。 5 超数排卵和配种 DB53/T 1052.3 2021 2 5.1 超数
8、排卵 5.1.1 激素 FSH（垂体促卵泡素）、 P（孕酮，激素包埋在硅胶栓 CIDR内，在阴道内缓慢释放）。 5.1.2 方法 按以下方法进行超数排卵： a) 于发情周期的任意一天埋置阴道孕酮硅胶栓（ CIDR），计为第 1 d，第 9 d 更换第二个 CIDR； b) 第 15 d 开始采用减量法每天早、晚间隔 12 h 各注射一次 FSH，连续注射 4 d 共 8 次， 4 d 注射 总剂量比例为 4： 3： 2： 1； c) 在第 7 次注射 FSH 时取出 CIDR； d) FSH 注射总剂量按供体羊体重计算，宜在 0.20 mg/kg 0.25 mg/kg 之间。 5.2 记录 按
9、 NY/T 826要求记录供体羊超数排卵。 5.3 配种 供体羊取栓后 12 h 36 h进行发情鉴定，发情母羊进行本交或人工授精，发情鉴定和人工授精方法 按 DB53/T 1052.2要求执行。 6 胚胎回收 6.1 时间 供体羊发情后第一次配种或输精当日记为 0 d，在第 2 d 3 d或第 6 d 7 d用手术法分别从输卵管或 子宫角回收胚胎，母羊回收胚胎前禁食 24 h，禁水 12 h。 6.2 冲胚方法 6.2.1 输卵管法 操作方法参照 NY/T 826执行。 6.2.2 子宫法 子宫法冲胚按照以下步骤和要求进行： a) 按 NY/T 826 规定准备药品、器材、配制冲胚液，也可以
10、使用商品化的专用冲胚液； b) 将供体羊仰卧于手术保定架上， 按每公斤体重静脉注射 0.02 mL 0.03 mL 2%盐酸赛拉唑麻醉； c) 手术部位宜选择乳房前腹中线部，刮净术部毛，分别用清水和消毒液清洗，然后由里向外涂 以 2% 4%的碘酒，待干后再用 75%的酒精棉脱碘； d) 盖上创巾，使预定的切口部位暴露在创巾开口的中部； e) 按皮肤、皮下组织、肌肉、腹膜的顺序切口，然后将食指及中指由切口伸入腹腔，在骨盆腔、 膀胱周围触摸子宫，并将子宫、卵巢引出切口外； f) 记录两侧卵巢黄体数和卵泡数； g) 在子宫体基部打孔，将冲卵管插入，依据羊只发情到冲胚当天时间间隔，使气球在子宫角中 部
11、，冲卵管尖端靠近子宫角前端； DB53/T 1052.3 2021 3 h) 使用 5 mL 一次性注射器缓慢注入 3 mL 5 mL 气体，冲卵管另一端接大平皿； i) 用套管针在子宫角细部无血管处插入，外接抽取 25 mL 37冲胚液的注射器，一只手的手指 在套管针头后方捏紧子宫角细部，另一只手推注射器，缓慢注入液体，使液体顺畅地从冲卵管 流入大平皿中待检； j) 冲完后将气球放气，抽出冲卵管和套管针，用同样方法回收另一侧胚胎。 6.3 记录 按 NY/T 826要求记录供体羊胚胎回收。 7 胚胎质量鉴定 7.1 检胚收集 检胚收集按下列要求进行： a) 实验室温度 20 25， 体视显微
12、镜下由低倍到高倍检胚， 一般在 40 倍左右发现胚胎， 100 倍 对胚胎鉴定分级； b) 将检出的胚胎放入盛有保存液的 35 mm 培养皿中，冲洗胚胎 3 次 5 次，然后把全部胚胎移 至另一个培养皿；一只供体羊的胚胎放在同一个培养皿内。 7.2 发育阶段鉴定 在 40 倍 120 倍的体视显微镜下，观察受精卵或胚胎的发育状态、形态轮廓、色泽、卵裂球的大小、 均匀度、细胞密度、变性程度以及胚龄与发育期是否吻合等，胚胎发育期划分为下列七个阶段： a) 第 2 d 3 d 从输卵管回收的胚胎，发育阶段为 2 细胞期 8 细胞期，可清楚地观察到卵裂球， 卵黄腔内空隙较大，为受精卵； b) 第 3
13、d 4.5 d 回收的胚胎，可以观察到球状的细胞团，分不清卵裂球，细胞团占据卵黄腔的大 部分，为桑椹胚； c) 第 4.5 d 5 d 回收的胚胎，细胞团变小，占卵黄的 60% 70%，为致密桑椹胚； d) 第 5 d 6 d 天回收的胚胎，细胞团的一部分出现发亮的胚泡团和滋养层，为早期囊胚； e) 第 6 d 7 d 天回收的胚胎，内细胞团和滋养层界线清晰，胚泡腔明显，细胞充满卵黄腔，为 囊胚； f) 发情后第 7 d 7.5 d 回收的胚胎，囊腔明显扩大，体积增大到原来的 1.2 倍 1.5 倍，与透明 带之间无空隙，透明带变薄，相当于正常厚度的 1/3，为扩张囊胚； g) 在发情后的第
14、7.5 d 8 d，由于胚泡腔继续扩张，致使透明带破裂，胚细胞脱出，为孵化胚。 7.3 等级评定 分为以下四个等级： a) A 级，优质胚。发育正常，胚龄与发育期相吻合，轮廓清楚，透明度适中，细胞密度大，卵裂 均匀，无变性的细胞； b) B 级，良好胚。发育基本符合预定胚龄，轮廓清楚，明暗适中或稍暗稍淡，细胞密度较小或小 型卵裂球过多，细胞变性率为 10% 20%； c) C 级，普通胚。轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，细胞变性率为 30% 40%； d) D 级，等外胚（不可用胚）。未受精卵和变性胚。 7.4 各等级胚胎的使用 DB53/T 1052.3 2021 4 各等级胚胎的使
15、用按以下要求执行： a) 冷冻保存用胚胎应选择 A 级囊胚； b) 鲜胚移植时按可用胚胎总数和可移植胚胎受体羊数量，以 A、 B、 C 级胚胎混合使用； c) 每只受体羊移植不超过 2 枚 A 级胚胎或 3 枚 B 级胚胎； d) C 级胚胎不单独移植，应与 A 级胚胎按 1： 1 或 B 级胚胎 1： 2 进行搭配移植。 8 胚胎冷冻保存与解冻 8.1 冷冻保存 8.1.1 仪器及材料 体视显微镜、程序冷冻仪、 0.25 mL塑料冷冻细管、培养皿、封口粉、冷冻记号笔等。 8.1.2 试剂 冲胚液、以冲胚液为基础液配制的 0.5 mol/L 乙二醇、 1.0 mol/L 乙二醇 、 1.5 m
16、ol/L 乙二醇、 0.5 mol/L 蔗糖。 8.1.3 冷冻 按下列方法进行冷冻： a) 标记，在 0.25 mL 细管上用冷冻记号笔写上品种、耳号、胚胎数量、发育阶段和质量等级； b) 洗涤与平衡， 先将胚胎用冲胚液洗涤 3 次， 依次在 0.5 mol/L 和 1.0 mol/L 乙二醇中各平衡 5 min 后装管； c) 装管，用 0.25 mL 细管吸取少量 0.5 mol/L 蔗糖、空气、 1.5 mol/L 乙二醇、空气、 1.5 mol/L 乙 二醇，并在此段放入已平衡好的胚胎，再吸取空气、 1.5 mol/L 乙二醇、空气、 0.5 mol/L 蔗糖， 最后，用封口粉封口；
17、 d) 0.25 ml 冷冻细管各段分布图详见图 1； e) 冷冻，胚胎放入冷冻细管后再平衡 15 min，然后将细管放入程序冷冻仪，以-3/min 的速率 从室温降至-6.5并植冰（用沾有液氮的脱脂棉轻触胚胎段两头的冷冻液，诱发细管内冰晶的 形成），在此温度下平衡 10 min，再以-0.3/min 的速率降至-35，平衡 10 min 后投入液氮 保存，程序图详见图 2。 图 1 胚胎冷冻保存细管（ 0.25 ml）装管图 DB53/T 1052.3 2021 5 图 2 胚胎冷冻程序图 8.2 解冻 解冻按照以下步骤进行： a) 从液氮中取出装有胚胎的细管，空气浴 7 s 10 s 后
18、37水浴 10 s； b) 用消毒纸巾擦干细管，再用半干的酒精棉球擦拭细管表面，剪掉细管两端封口； c) 将细管内液体盛放于培养皿中，于体视显微镜下快速检出胚胎移入 0.5 mol/L 蔗糖缓冲液中平 衡 5 min，再用冲胚液洗涤 3 次后备用。 9 胚胎移植 9.1 受体羊选择 受体羊选择应符合以下要求： a) 空怀； b) 繁殖性能良好、健康，膘情在 7 成以上； c) 年龄 1.5 岁 5 岁，经观察有两个正常发情周期。 9.2 受体羊饲养管理 受体羊应按以下要求饲养管理： a) 单独组群加强饲养，在移植前 30 d 开始补饲； b) 饲养环境稳定，避免应激反应； c) 加强公羊管理，
19、避免偷配； d) 新购进受体羊需进行驱虫和综合免疫处理，隔离观察、复膘适应新环境，发情周期正常后再 做为受体羊使用。 9.3 受体羊同期发情处理 受体羊同期发情按以下方法处理： a) 将孕酮硅胶栓（ CIDR，孕酮含量为 300 mg/个）或海绵栓（孕酮含量为 400 mg/个）埋置入母 羊阴道，放置 15 d 17 d 后取出； b) 取栓时肌注孕马血清促性腺激素（ PMSG） 200 IU/只 250 IU/只， 24 h 48 h 内观察发情； c) 受体羊发情之日为 0 d，按胚龄一致性要求进行移植。 9.4 受体羊发情鉴定 DB53/T 1052.3 2021 6 受体羊的发情鉴定按
20、 DB53/T 1052.2规定执行。 9.5 要求 胚胎移植应满足以下要求： a) 根据发情记录判定供体（胚龄）与受体羊的发情时间差确定移植时间，供、受体羊发情时间 差宜在 12 h 以内； b) 根据黄体突出卵巢的直径，将黄体发育程度分为优（ 0.5 cm 1.0 cm）、中（ 0.3 cm 0.49 cm）、 差（小于 0.3 cm），黄体发育为中等及以上时适合进行移植操作； c) 胚胎移植部位应与供体母羊回收胚胎的部位一致，即输卵管回收的胚胎移植于输卵管，子宫 角回收的胚胎移植于子宫角； d) 受体羊术前需禁食 24 h、禁水 12 h。 9.6 操作 9.6.1 常规手术法 将受体羊
21、仰卧于手术保定架上，按每公斤体重静脉注射 0.01 mL 0.02 mL 2%盐酸赛拉唑，手术部 位及手术要求执行 5.2.2相关规定，具体方法如下： a) 输卵管移植时，将有黄体一侧的输卵管伞部拨开，找到管口，把装有胚胎的移植器从此插入 3 cm 4 cm，然后将胚胎轻轻推出即可，操作中不可用力牵拉卵巢，不能触摸黄体； b) 子宫角移植时，将黄体较好一侧的子宫角拉出，避开血管，用曲别针制成的打孔针在子宫角 打孔，把装有胚胎的移植器从此孔插入子宫腔内，伸至子宫角尖端后将胚胎轻轻推出即可。 9.6.2 腹腔内窥镜法 将受体羊仰卧于手术保定架上，按每公斤体重静脉注射 0.01 mL 0.02 mL
22、 2%盐酸赛拉唑，手术部 位及手术要求执行 5.2.2相关规定，具体方法如下： a) 用手术刀片在腹中线两侧，距乳房 2 cm 处，各切一个 1.0 cm 1.5 cm 的小口； b) 用与腹腔镜配套的专用打孔器将腹膜、肌肉打通，在两侧刀口内放入腹腔镜和子宫钳； c) 在子宫不暴露于体外的情况下，利用腹腔镜观察卵巢上黄体发育情况； d) 用子宫钳夹住黄体较好侧子宫角尖端系膜并将其拉出，避开血管，在子宫角打孔； 将装有胚胎的移植枪朝子宫角方向推出胚胎。 9.7 记录 胚胎移植记录参见表 1。 表 1 胚胎移植记录表 黄体发育 受体 耳号 发情 时间 左侧 右侧 供体 耳号 移植胚 胎数量 胚龄、
23、质量 移植 部位 产羔 日期 产羔数 备注 9.8 术后管理 9.8.1 创口处理及观察 DB53/T 1052.3 2021 7 术后创口处理及观察要求如下： a) 供体冲胚完毕后，用 37灭菌生理盐水湿润母羊子宫，冲去凝血块，器官复位，腹腔内倒入 250 mL 37灭菌生理盐水； b) 腹膜、肌肉层采用连续缝合后撒适量青霉素粉，皮肤层采用节节缝合法缝合后伤口用碘酒消 毒； c) 从手术当天开始每天早、 晚肌肉注射青霉素、 链霉素各 80 万 IU， 同时用碘酒对伤口进行消毒， 连续 3 d，第 7 d 可拆线； d) 受体羊移植胚胎后，将子宫角复位即可缝合，方法和供体羊一致，缝合完毕后肌肉
24、注射孕酮 2 mL 和青霉素、链霉素各 80 万 IU； e) 供体、受体羊术后观察 24 h，无异常后跟群放牧或与其他羊只混群； f) 如有卧地不起、弓腰弓背或不进食不排便的现象，应及时检查创口缝合情况，给予必要治疗 或重新缝合。 9.8.2 术后饲养 供体、受体羊术后饲养应注意以下事项： a) 初期，饲喂干草及清洁的饮水，加盐的温水为宜； b) 术后 3 d，恢复术前精料饲喂量； c) 受体羊应补充维生素和矿物质，并加强饲养管理，避免应激反应； d) 受体羊术后 1 个 2 个发情周期内应注意观察返情情况， 若返情则应及时安排配种或下一次移 植。 e) 2 个情期未返情的羊初步判断为妊娠，对妊娠羊加强饲养管理，应满足其对蛋白质的需要； f) 做好妊娠母羊的助产、产羔记录和羔羊培育工作，； g) 产羔记录应包括产羔母羊耳号、供体耳号、产羔日期、羔羊数、羔羊初生重等。 _ DB53/T 1052.32021
