1、ICS 65.020.30CCS B 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1058 2021滇 金 丝 猴 个 体 识 别 分 子 技 术 规 程 RegulationofmoleculartechniquesofindividualidentificationforRhinopithecus bieti 2021 -09- 30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/T 1058 2021 I 目 次前 言 .III1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 原 理 .25 操 作 程
2、 序 .25.1 样 品 制 备 及 DNA 提 取 .25.2 DNA质 量 检 测 .2 5.3 DNA保 存 .25.4 微 卫 星 标 记 .25.5 微 卫 星 标 记 PCR.25.6 微 卫 星 基 因 分 型 .36 个 体 识 别 .3附 录 A （ 规 范 性 ） 滇 金 丝 猴 个 体 识 别 微 卫 星 标 记 信 息 表 .4附 录 B （ 规 范 性 ） 主 要 试 剂 及 仪 器 设 备 .5附 录 C （ 规 范 性 ） 脱 氧 核 糖 核 酸 样 品 （ DNA） 样 品 的 提 取 .7附 录 D （ 规 范 性 ） PCR反 应 .9 DB53/T 105
3、8 2021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 ： 云 南
4、大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 于 黎 、 黄 艳 梅 、 李 依 恬 、 朱 勋 程 、 徐 志 茹 、 李 迅 、 胡 靖 扬 、 吴 宏 、 匡 卫 民 。 DB53/T 1058 2021 1 滇 金 丝 猴 个 体 识 别 分 子 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 个 体 识 别 分 子 技 术 的 原 理 、 操 作 程 序 、 个 体 识 别 。本 文 件 适 用 于 滇 金 丝 猴 个 体 识 别 、 遗 传 多 样 性 评 估 、 群 体 历 史
5、评 估 和 遗 传 档 案 建 立 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。 本 文 件 没 有 规 范 性 引 用 文 件 。3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 微 卫 星 标 记 microsa
6、tellitemarker基 因 组 中 的 简 单 串 联 重 复 脱 氧 核 糖 核 酸 （ DNA） 片 段 ， 含 短 串 联 重 复 序 列 （ Shorttandemrepeats，STR） 和 简 单 重 复 序 列 （ Simplesequencerepeats， SSR） 。 在 个 体 间 重 复 次 数 发 生 变 化 的 多 态 性 微 卫 星位 点 ， 可 以 作 为 微 卫 星 标 记 使 用 。3.2 微 卫 星 序 列 microsatellitesequence基 因 组 中 由 1 6个 核 苷 酸 为 基 本 重 复 单 元 组 成 的 DNA串 联 重
7、复 序 列 ， 也 称 为 短 串 联 重 复 序 列 或 简 单 重 复 序 列 。3.3 脱 氧 核 糖 核 酸 样 品 DNAsamples利 用 滇 金 丝 猴 组 织 （ 如 毛 发 、 血 液 、 肌 肉 组 织 等 ） 或 新 鲜 粪 便 提 取 的 滇 金 丝 猴 基 因 组 脱 氧 核 糖 核 酸（ DNA） 样 品 。3.4 聚 合 酶 链 式 反 应 polymerasechainreaction（ PCR）以 一 对 寡 核 苷 酸 引 物 、 四 种 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 (dNTPs)为 原 料 ， 在 合 适 的 温 度 、 离 子 条 件 和 耐 热 DN
8、A聚 合 酶 催 化 下 ， 在 体 外 人 工 合 成 特 异 的 DNA片 段 的 过 程 。3.5 微 卫 星 基 因 分 型 microsatellitegenotyping对 样 品 进 行 微 卫 星 位 点 PCR扩 增 后 ， 利 用 自 动 化 毛 细 血 管 电 泳 技 术 测 定 个 体 基 因 型 。3.6 微 卫 星 个 体 识 别 microsatelliteindividualidentification DB53/T 1058 2021 2 采 用 微 卫 星 多 态 性 技 术 ， 判 断 前 后 两 次 或 多 次 出 现 的 生 物 学 检 材 是 否 属
9、 于 同 一 个 体 。 采 用 微 卫 星 多态 性 技 术 进 行 个 体 识 别 ， 以 确 认 个 体 身 份 。3.7 微 卫 星 特 异 性 引 物 microsatellitespecificprimers用 于 滇 金 丝 猴 微 卫 星 分 子 鉴 定 选 用 的 一 套 微 卫 星 引 物 ， 具 有 多 态 性 、 稳 定 性 和 重 复 性 。4 原 理微 卫 星 广 泛 分 布 于 动 物 基 因 组 的 不 同 位 置 ， 微 卫 星 位 点 具 有 高 度 的 遗 传 多 态 性 ， 微 卫 星 标 记 具 有 高度 的 物 种 特 异 性 和 良 好 的 扩 增
10、 重 现 性 ， 是 动 物 个 体 识 别 的 首 选 标 记 。 在 检 验 过 程 中 ， 可 将 不 同 的 样 品 作为 待 检 样 品 ， 待 检 样 品 之 间 的 基 因 型 差 异 作 为 判 定 不 同 个 体 的 依 据 。 本 文 件 用 了 10对 高 多 态 性 的 微 卫 星标 记 ， 用 于 滇 金 丝 猴 个 体 识 别 （ 见 附 录 A） 。 5 操 作 程 序5.1 样 品 制 备 及 DNA提 取收 集 滇 金 丝 猴 的 血 液 、 肌 肉 、 皮 肤 、 毛 发 、 粪 便 等 样 品 ， 样 品 采 集 应 符 合 实 验 动 物 的 福 利 和
11、 伦 理 的相 关 要 求 。 使 用 针 对 不 同 样 品 形 式 对 应 的 专 用 商 品 试 剂 盒 或 传 统 分 子 生 物 学 技 术 手 段 进 行 DNA提 取 。主 要 试 剂 、 仪 器 设 备 见 附 录 B， 样 品 的 DNA提 取 具 体 步 骤 见 附 录 C。5.2 DNA质 量 检 测使 用 微 量 分 光 光 度 计 和 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 对 每 个 DNA样 品 进 行 浓 度 分 析 ， 260/280在 1.7 2.1之 间 ，浓 度 超 过 40 ng/L的 DNA样 品 合 格 。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 及 成 像
12、方 法 见 附 录 C。5.3 DNA保 存 近 期 （ 一 个 月 内 ） 使 用 的 DNA， 装 有 DNA的 离 心 管 保 存 于 20 冰 箱 中 。 长 期 保 存 的 DNA， 装 有DNA的 离 心 管 保 存 于 80 超 低 温 冰 箱 中 。5.4 微 卫 星 标 记使 用 10个 微 卫 星 标 记 进 行 滇 金 丝 猴 个 体 识 别 。 微 卫 星 标 记 信 息 见 附 录 A。5.5 微 卫 星 标 记 PCR5.5.1 微 卫 星 标 记 PCR引 物 合 成 与 荧 光 标 记根 据 10个 微 卫 星 遗 传 标 记 的 序 列 合 成 引 物 ， 并
13、 对 正 向 引 物 的 5端 进 行 荧 光 标 记 ， 每 个 微 卫 星 标 记 有一 条 引 物 带 有 荧 光 标 记 。 在 试 验 过 程 中 ， 应 避 光 操 作 ， 以 免 影 响 引 物 的 荧 光 标 记 效 果 。5.5.2 PCR反 应 体 系 可 选 用 多 种 PCR扩 增 酶 进 行 微 卫 星 PCR， PCR反 应 体 系 见 附 录 D， 表 D.1。5.5.3 PCR反 应 程 序样 品 DNA在 PCR仪 上 进 行 PCR扩 增 的 反 应 程 序 ， 反 应 程 序 见 附 录 D， 表 D.2。5.5.4 PCR反 应 最 适 退 火 温 度
14、DB53/T 1058 2021 3 10对 微 卫 星 引 物 退 火 温 度 见 附 录 D， 表 D.2。5.5.5 PCR产 物 质 量 检 测PCR扩 增 完 成 后 ， 取 PCR产 物 2L， 经 2%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ， 如 电 泳 条 带 清 楚 片 段 大 小 正 确 ，参 考 长 度 应 符 合 附 录 C所 示 ， 符 合 微 卫 星 扩 增 大 小 ， 表 明 PCR扩 增 成 功 ， 成 为 符 合 质 量 要 求 的 PCR产 物 。将 符 合 质 量 要 求 的 PCR产 物 使 用 锡 箔 纸 盒 避 光 存 放 于 4 冰 箱 ， 用 于
15、后 续 测 序 仪 检 测 ， 进 行 基 因 分 型 ；对 于 不 符 合 质 量 要 求 的 样 品 ， 要 进 行 PCR条 件 优 化 ， 改 变 PCR反 应 体 系 和 反 应 时 间 ， 重 新 进 行 PCR扩 增和 质 量 检 测 。5.6 微 卫 星 基 因 分 型5.6.1 将 符 合 质 量 要 求 的 PCR产 物 采 用 遗 传 分 析 仪 进 行 基 因 扫 描 分 型 。5.6.2 不 同 颜 色 标 记 引 物 的 PCR产 物 可 以 混 合 后 进 行 基 因 扫 描 分 型 ， 获 取 微 卫 星 分 型 峰 图 和 数 值 。 为消 除 系 统 误 差
16、 ， 所 有 样 品 使 用 同 一 型 号 分 型 设 备 进 行 基 因 分 型 ， 所 有 批 次 都 选 用 相 同 分 子 内 标 ， 并 且 使 用 同 一 数 据 判 读 软 件 进 行 数 据 判 读 。5.6.3 获 取 的 微 卫 星 分 型 峰 图 和 数 值 ， 对 各 微 卫 星 位 点 重 复 单 元 碱 基 数 对 测 序 结 果 进 行 人 工 校 正 。 在校 正 中 ， 根 据 分 型 峰 图 和 数 值 ， 参 考 片 段 大 小 ， 判 断 分 型 数 据 的 奇 偶 性 。 根 据 分 型 数 值 ， 将 偏 差 小 于 等于 1的 基 因 型 校 正
17、 为 碱 基 重 复 数 的 整 数 倍 数 值 ， 偏 差 大 于 1重 新 进 行 PCR， 以 确 保 数 据 真 实 可 靠 。6 个 体 识 别用 生 物 学 软 件 对 微 卫 星 位 点 的 分 型 数 据 进 行 个 体 识 别 ：a) 当 两 个 或 两 个 以 上 的 样 品 微 卫 星 标 记 分 型 结 果 完 全 一 致 时 ， 判 定 样 品 来 自 同 一 个 体 ；b) 当 两 个 样 品 的 微 卫 星 标 记 分 型 结 果 中 有 2 个 及 以 上 标 记 分 型 结 果 不 同 时 ， 判 定 样 品 来 自 不 同 个体 ；c) 当 两 个 样 品
18、的 微 卫 星 标 记 分 型 结 果 中 只 有 1 个 标 记 差 异 时 ， 认 为 两 个 样 品 来 自 相 同 个 体 。 DB53/T 1058 2021 4 附 录 A（ 规 范 性 ）滇 金 丝 猴 个 体 识 别 微 卫 星 标 记 信 息 表滇 金 丝 猴 个 体 识 别 微 卫 星 标 记 信 息 表 见 表 A.1。表 A.1 滇 金 丝 猴 个 体 识 别 微 卫 星 标 记 信 息 表编 号 标 记 名 称 引 物 序 列 5-3 核 心 序 列 参 考 长 度 （ bp）1 RB1 F:GCAAAGACACACACATAGGCTCA (AAAG)n 195 22
19、7R:ATGCCTTCTTTGTCTCTTGATCTT 2 RB2 F:AGAGAGAATCCCCCTGAGCAT (AGGA)n 219 251R:GAGCAAGACTCCATCTCAAAACA3 RB3 F:TTCCAACTAACACTAAAAGGAGGG (TTCC)n 210 230R:CACAGGGGTGAAAATATTCAAGA4 RB4 F:GACAACCCAGAGCCATCTATGTA (TCTTT)n 204 229R:TGGGTGACAGAGTAAGACTCGGT5 RB5 F:CTGTGGAATCTGCCCATCAA (TTCC)n 237 261R:GCCTGGACAA
20、CAGAGTAAGACAC6 RB6 F:GCTTCTGAATTCTTCCAATGTCC (AGAT)n 220 236R:CCCTGAATTCCAAGAATGTCAA 7 RB7 F:GTCTACTGTGGGTGAACCTGGA (CCTT)n 208 228R:TGGGCCTAGAAGGTTGTGGT8 RB8 F:AGAGGTTGCAGTGAGCCAAGA (TAGA)n 196 220R:GGACTACTGCTAAGCAAGGTATCG9 RB9 F:GGGTATCAGTCTGCTTTGGAATC (TACAA)n 218 238R:GCACAAGTTCCCATTGCCATA10 RB
21、10 F:GCCCTCCACTGCTCAATTTT (ATTGT)n 289 314R:GGTAGGAGAACTGCTTGATCCC DB53/T 1058 2021 5 附 录 B（ 规 范 性 ）主 要 试 剂 及 仪 器 设 备B.1 主 要 试 剂B.1.1 除 非 另 有 说 明 ， 在 分 析 中 所 使 用 的 试 剂 均 为 分 析 纯 ， 所 使 用 的 水 均 为 无 菌 水 。B.1.2 50 TAE缓 冲 液 (TAE Buffer)： Tris碱 242 g和 冰 醋 酸 57.1 mL， 用 双 蒸 水 定 容 到 1 L。B.1.3 GeneFinder核 酸 染
22、 料 ， 用 于 凝 胶 成 像 显 示 条 带 。B.1.4 6 上 样 缓 冲 液 （ Loading Buffer） ， 含 有 溴 酚 蓝 ， 用 于 电 泳 和 凝 胶 成 像 。B.1.5 2.5 mM dNTP试 剂 ： dATP、 dCTP、 dGTP和 dTTP的 预 混 溶 液 。B.1.6 5 PCR Buffer。B.1.7 GoldStar 酶 。 B.1.8 无 菌 水 ： ddH2O。B.1.9 琼 脂 糖 （ 纯 度 100%） 。B.1.10 1%琼 脂 糖 凝 胶 （ 用 于 检 测 DNA） ： 1 g琼 脂 糖 与 100 mL 1 TAE缓 冲 液 ，
23、 加 热 融 化 均 匀 ，60 时 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 。B.1.11 2%琼 脂 糖 凝 胶 （ 用 于 检 测 PCR产 物 ） ： 2 g琼 脂 糖 与 100 mL 1 TAE缓 冲 液 ， 加 热 融 化 均 匀 ，60 时 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 。B.1.12 STE 缓 冲 液 ： 30 mM Tris-HCL， 200
24、 mM EDTA， 50 mM NaCl， pH 8.0。B.1.13 Tris饱 和 酚 。B.1.14 水 饱 和 酚 。B.1.15 异 戊 醇 （ C 5H12O） 。B.1.16 异 丙 醇 （ CH3CH(OH)CH3） 。B.1.17 氯 仿 （ CHCl3） 。B.1.18 TE： 10 mM Tris-HCL， 1mM EDTA， pH=8.0。B.1.19 苯 酚 （ C6H5OH） 。B.1.20 蛋 白 酶 K。B.1.21 十 二 烷 基 硫 酸 钠 ： SDS。B.1.22 DNA提 取 试 剂 盒 可 选 用 QIAamp Fast DNA Stool（ 5160
25、4） ， 使 用 试 剂 盒 中 的 相 关 试 剂 。 试 剂盒 可 进 行 自 由 选 择 。B.2 仪 器 设 备B.2.1 PCR仪 。B.2.2 低 温 高 速 离 心 机 。 B.2.3 单 道 可 调 移 液 器 （ 2 L， 10 L， 200 L， 1 000 L） 。B.2.4 电 子 天 平 （ 量 程 0.01 mg 10 000 mg） 。B.2.5 水 浴 恒 温 振 荡 器 。B.2.6 普 通 离 心 机 。B.2.7 超 纯 水 器 。B.2.8 高 压 灭 菌 器 。 DB53/T 1058 2021 6 B.2.9 电 泳 仪 。B.2.10 凝 胶 成
26、像 系 统 。B.2.11 磁 力 搅 拌 器 。B.2.12 遗 传 分 析 仪 。B.2.13 超 低 温 冰 箱 （ 80 ） 。B.2.14 低 温 冰 箱 （ 20 ） 。B.2.15 DNA混 合 仪 。 DB53/T 1058 2021 7 附 录 C（ 规 范 性 ）脱 氧 核 糖 核 酸 样 品 （ DNA） 样 品 的 提 取C.1 说 明DNA提 取 可 用 多 种 方 式 进 行 ， 可 使 用 不 同 试 剂 盒 等 方 法 ， 本 文 件 给 出 粪 便 样 品 DNA的 试 剂 盒 提 取法 、 组 织 血 液 样 品 DNA的 传 统 提 取 方 法 。C.2
27、粪 便 样 品 的 DNA提 取C.2.1 试 剂 盒本 标 准 采 用 的 试 剂 盒 为 QIAampFastDNAStool（ 51604） ， 所 有 离 心 步 骤 ， 在 室 温 下 （ 15 25 ） ，14000rpm/min进 行 。 如 果 不 能 提 供 14000rpm/min离 心 速 度 ， 则 增 加 离 心 时 间 比 例 。 C.2.2 预 处 理C.2.2.1 为 尽 可 能 多 的 获 得 滇 金 丝 猴 肠 道 脱 落 细 胞 ， 最 大 限 度 去 除 粪 便 样 品 中 的 多 糖 、 色 素 等 阻 抑 物 ，需 要 对 样 品 进 行 预 处 理
28、 。C.2.2.2 利 用 研 磨 仪 将 粪 便 样 品 磨 碎 ， 使 得 脱 落 下 来 的 肠 道 细 胞 充 分 存 在 于 样 品 保 存 液 中 。C.2.2.3 通 过 离 心 法 富 集 样 品 中 的 肠 道 细 胞 以 备 DNA提 取 。C.2.2.4 使 用 预 冷 的 无 水 乙 醇 和 无 菌 水 对 富 集 物 进 行 洗 涤 离 心 ， 以 去 除 样 品 中 的 阻 抑 物 成 分 。C.2.3 准 备 工 作C.2.3.1 确 保 缓 冲 AW1和 缓 冲 AW2已 经 按 照 试 剂 盒 标 签 上 的 说 明 准 备 。C.2.3.2 使 用 前 将
29、缓 冲 液 混 合 均 匀 。C.2.3.3 如 果 在 Buffer ASL或 Buffer AL 中 有 沉 淀 形 成 ， 在 70 水 浴 锅 内 加 热 至 溶 解 。C.2.3.4 准 备 70 水 浴 在 C.2.4.7使 用 。 C.2.4 DNA提 取C.2.4.1 称 取 180 mg 220 mg粪 便 于 2 mL离 心 管 置 于 冰 上 做 预 处 理 。C.2.4.2 向 样 品 中 加 入 1 mL缓 冲 液 InhibitEX Buffer， 间 歇 振 荡 涡 旋 1min 2min至 样 品 完 全 同 质 化 。C.2.4.3 全 速 离 心 1.5mi
30、n， 使 粪 便 均 质 化 。C.2.4.4 取 25 L蛋 白 酶 K进 入 一 个 新 的 2 mL微 离 心 管 。C.2.4.5 从 第 3步 中 吸 取 600 L上 清 于 有 蛋 白 酶 K的 2 mL离 心 管 中 。C.2.4.6 加 600 L Buffer AL 涡 旋 15s。C.2.4.7 70 孵 育 10min， 中 途 颠 倒 混 匀 1 2次 。 简 短 离 心 收 集 管 盖 上 的 液 滴 。C.2.4.8 在 裂 解 液 中 加 600 L无 水 乙 醇 ， 涡 旋 混 匀 。 简 短 离 心 收 集 管 盖 上 的 液 滴 。C.2.4.9 将 上
31、一 步 所 得 溶 液 取 600 L加 入 到 一 个 吸 附 柱 中 （ 吸 附 柱 放 入 2 mL收 集 管 ） 。 全 速 14 000 rpm/min离 心1.5min， 倒 掉 废 液 ， 将 吸 附 柱 放 入 新 的 收 集 管 中 。C.2.4.10 打 开 柱 子 的 盖 子 ， 加 入 另 外 600 L的 裂 解 液 ， 全 速 14 000 rpm/min离 心 1.5min， 倒 掉 废 液 ， 将 吸 附 柱 放 入 新 的 收 集 管 中 。 DB53/T 1058 2021 8 C.2.4.11 重 复 C.2.4.10 将 第 三 份 600 L的 裂 解
32、 液 负 载 到 柱 子 上 。 全 速 14 000 rpm/min离 心 1.5min， 倒掉 废 液 ， 将 吸 附 柱 放 入 新 的 收 集 管 中 。C.2.4.12 加 入 500 L Buffer AW1到 柱 子 中 。 盖 紧 离 心 管 盖 ， 全 速 14 000 rpm/min离 心 1.5min。 将 离心 管 取 出 ， 放 入 一 新 的 2 mL收 集 管 中 。 丢 弃 旧 收 集 管 及 其 中 液 体 。C.2.4.13 加 入 500 L Buffer AW2到 柱 子 中 。 盖 紧 离 心 管 盖 ， 以 全 速 14 000 rpm/min离 心
33、 3min。 将 离心 管 取 出 ， 放 入 新 的 2 mL收 集 管 中 （ 试 剂 盒 提 供 ） 。 丢 弃 旧 收 集 管 及 其 中 液 体 。C.2.4.14 将 离 心 管 取 出 ， 放 入 新 的 2 mL收 集 管 中 后 以 全 速 14 000 rpm/min离 心 2min。C.2.4.15 将 柱 子 转 移 到 新 的 1.5 mL离 心 管 中 ， 小 心 加 入 无 菌 水 ， 室 温 下 静 置 2min， 全 速 14 000 rpm/min离 心 2min， 把 DNA洗 脱 下 来 。C.2.4.16 准 备 0.2 mL的 PCR小 管 ， 吸
34、取 4 L用 于 胶 检 测 和 定 量 ， 将 1.5 mL离 心 管 中 的 DNA样 品 迅 速放 于 20 冰 箱 。C.3 组 织 、 血 液 样 品 DNA的 提 取 C.3.1 取 1.5 mL全 血 或 少 许 组 织 样 品 0.03 g， 加 入 450 L STE 缓 冲 液 （ 30 mM Tris-HCL， 200 mMEDTA， 50 mM NaCl， pH 8.0） 和 终 浓 度 分 别 为 10%的 SDS 75 L和 200 mg/mL的 蛋 白 酶 K 25 L；充 分 混 匀 后 置 于 57 温 箱 中 消 化 8 h 12 h至 澄 清 ， 其 间
35、摇 匀 数 次 。C.3.2 加 入 等 体 积 的 水 饱 和 酚 或 Tris饱 和 酚 550 L 700 L， 人 工 缓 慢 混 匀 20min或 在 DNA混 合 仪 上缓 慢 转 动 抽 提 24 h， 小 心 的 混 合 两 相 。 于 室 温 9 000 rpm/min离 心 10min， 将 上 清 液 转 至 另 一 干 净 的 Eppendorf管 中 。C.3.3 加 入 等 体 积 的 苯 酚 :氯 仿 :异 戊 醇 （ 25:24:1） 混 合 液 300 L缓 慢 混 匀 抽 提 20min或 在 DNA混 合 仪 上缓 慢 转 动 抽 提 24 h， 9 00
36、0 rpm/min离 心 10min， 上 清 液 转 至 另 一 干 净 的 Eppendorf管 。C.3.4 再 加 入 等 体 积 的 氯 仿 ： 异 戊 醇 （ 24： 1） 抽 提 10 min或 在 DNA混 合 仪 上 缓 慢 转 动 抽 提 24 h， 9 000 rpm/min离 心 10min， 上 清 液 转 至 另 一 干 净 的 Eppendorf管 中 。C.3.5 加 入 等 体 积 的 异 丙 醇 沉 淀 DNA， 于 20 静 置 120min以 上 沉 淀 DNA， 12 000 rpm/min离 心 10min后 ，弃 上 清 。C.3.6 加 入 1
37、000 L70%乙 醇 振 荡 洗 涤 ， 除 去 一 些 盐 分 或 其 他 不 利 于 DNA溶 解 的 成 分 ， 13 000 rpm/min 离 心 10min后 ， 弃 上 清 （ 重 复 两 次 ） 。C.3.7 尽 可 能 彻 底 除 去 70%乙 醇 ， 于 室 温 将 DNA沉 淀 置 于 敞 开 的 Eppendorf管 内 ， 直 至 可 见 痕 量 乙 醇 挥发 殆 尽 。C.3.8 加 入 150 L 200 L TE（ 10mM Tris-HCL， 1mM EDTA， pH=8.0） 缓 冲 液 或 无 菌 水 溶 解 ， 置37 充 分 溶 解 ， 68 加 热
38、 灭 活 ， 待 DNA完 全 溶 解 后 置 于 4 冰 箱 或 长 期 保 存 于 20 待 用 。C.4 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 及 成 像 方 法C.4.1 配 制 浓 度 为 1%的 琼 脂 糖 凝 胶 （ 即 1 TAE电 泳 缓 冲 液 100 mL加 1 g琼 脂 糖 ） ， 加 热 融 化 混 匀 ， 冷却 至 60 C左 右 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 配 制 2%琼 脂 糖 凝 胶 需 1 TAE电 泳 缓 冲 液 100 mL加 2 g琼 脂糖 。C.4.2 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝
39、胶 中 的 样 品 梳 ， 将 琼 脂 糖 凝 胶 和 胶 板 置 于 电 泳 槽中 ， 使 样 本 孔 位 于 电 场 负 极 ， 向 电 泳 槽 中 加 入 1 TAE电 泳 缓 冲 液 。C.4.3 取 2 L DNA， 加 2 L已 经 加 入 Genefinder染 料 的 上 样 缓 冲 液 并 混 匀 ， 然 后 依 次 将 DNA分 子 量 标 准 、 检 测 样 品 上 样 到 点 样 孔 中 。 电 泳 电 压 为 130 V， 当 上 样 缓 冲 液 中 的 溴 酚 蓝 条 带 迁 移 至 凝 胶 1/2的 位置 ， 停 止 电 泳 。C.4.3.1 取 出 琼 脂 糖
40、凝 胶 ， 置 于 凝 胶 成 像 仪 成 像 拍 照 、 保 存 。 DB53/T 1058 2021 9 附 录 D（ 规 范 性 ）PCR反 应D.1 总 则本 标 准 使 用 的 是 GoldStar酶 ， 可 使 用 多 种 酶 进 行 PCR扩 增 ， 根 据 选 择 的 PCR酶 制 定 相 应 的 反 应 体 系 、反 应 时 间 以 及 最 适 退 火 温 度 。D.2 PCR反 应 体 系PCR反 应 体 系 见 表 D.1。 表 D.1 PCR反 应 体 系 组 分 用 量 （ L）模 板 （ 20ng/L） 2.0引 物 F（ 10M） 0.1引 物 R（ 10M） 0
41、.1dNTP（ 2.5mM） 1.25 PCRBuffer 2.0无 菌 水 (ddH2O) 4.5GoldStar 酶 （ 5U/L） 0.1合 计 10D.3 PCR反 应 程 序PCR反 应 程 序 为 ： 95 预 变 性 10min； 94 变 性 30s， touchdown温 度 40s， 72 延 伸 40s。 设 置 13个 循 环 反 应 ， touchdown温 度 是 指 每 过 一 个 循 环 退 火 温 度 降 0.5 ； 94 变 性 30s， 最 适 退 火 温 度 40s，72 延 伸 40s， 设 置 30个 循 环 反 应 ， 60 后 延 伸 30min。D.4 PCR反 应 最 适 退 火 温 度PCR反 应 最 适 退 火 温 度 见 表 D.2。表 D.2 10对 微 卫 星 引 物 PCR反 应 的 最 适 退 火 温 度引 物 RB1 RB2 RB3 RB4 RB5 RB6 RB7 RB8 RB9 RB10温 度（ ） 49 53 51 56 55 50 58 54 54 55_ DB53/T10582021
