1、ICS 11.220CCS B 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1064.3 2021绿 孔 雀 检 疫 技 术 第 3部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检测 技 术 规 范 Quarantine technique for Pavo muticusPart 3:Technical specifications for laboratory examination of chewing lice 2021 -09- 30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/T 1064.3 2021 I 目 次前 言 .III引 言 .1
2、 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .15 原 理 .16 试 验 条 件 .2 6.1 实 验 室 通 用 要 求 .26.2 人 员 要 求 .27 仪 器 设 备 和 试 剂 .27.1 仪 器 设 备 .27.2 试 剂 .28 样 品 .28.1 样 品 采 集 .28.2 样 本 保 存 .38.3 样 品 运 输 .38.4 生 物 安 全 要 求 .39 试 验 步 骤 .3 9.1 形 态 学 检 查 .39.2 PCR检 测 .310 试 验 数 据 处 理 .410.1 形 态 学 结 果 判 定 .410.2 P
3、CR结 果 判 定 .4附 录 A （ 规 范 性 ） 羽 虱 形 态 .5附 录 B （ 规 范 性 ） PCR反 应 .6 DB53/T 1064.3 2021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T1.1 2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T 1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 的 第 3部 分 。 DB53/T 1064已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1 部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 2 部 分 ： 禽
4、 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3 部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 4 部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。 本 文 件 主 要 起 草 单 位
5、： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 、 云 南 省 动 物 卫 生 监 督 所 、 昆 明 动 物 园 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 邹 丰 才 、 黄 艳 梅 、 宋 海 洋 、 朱 勋 程 、 杨 建 发 、 李 杰 、 陈 培 富 、 蒙 英 雯 、 衡 昭 君 、张 誉 方 、 朱 尤 帅 、 李 云 乔 。 DB53/T 1064.3 2021 引 言绿 孔 雀 （ Pavo muticus） 在 我 国 仅 分 布 于 云 南 ， 是 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物 ， 也 是 全 球 濒 危 物 种 ，并 已 列 入 濒 危 野
6、 生 动 植 物 种 国 际 贸 易 公 约 (CITES)和 世 界 自 然 保 护 联 盟 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 为切 实 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 野 生 动 物 保 护 法 和 中 华 人 民 共 和 国 动 物 防 疫 法 ， 编 制 并 发 布 DB53/T 1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 地 方 标 准 ， 可 让 从 事 绿 孔 雀 保 护 的 相 关 人 员 按 标 准 化 和 规 范 化 程 序 开 展 绿 孔 雀 病 原学 诊 断 ， 从 而 采 取 必 要 的 防 治 措 施 ， 以 提 高 染 疫 绿 孔 雀 的 成 活 率 ， 维 护
7、绿 孔 雀 种 群 健 康 和 地 区 生 态 平 衡 ，提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1 部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 仪器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 2 部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 禽流 感 病
8、 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方面 制 定 了 规 范 ； 第 3 部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 羽 虱 实 验 室 检 测 的 原 理 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 4 部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试
9、 验 原 理 、常 见 线 虫 形 态 特 征 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定了 规 范 。 DB53/T 1064.3 2021 1 绿 孔 雀 检 疫 技 术第 3 部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 绿 孔 雀 （ Pavomuticus） 检 疫 技 术 中 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 的 原 理 、 试 验 条 件 、 仪 器 设备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用
10、于 绿 孔 雀 检 疫 技 术 中 羽 虱 实 验 室 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求GB/T27401 实 验 室 质 量 控 制 规 范 动 物 检 疫3 术 语
11、 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 羽 虱 chewing lice羽 虱 是 主 要 寄 生 在 鸟 类 体 表 和 少 数 寄 生 于 哺 乳 动 物 的 永 久 性 体 表 寄 生 虫 ， 隶 属 于 昆 虫 纲 （ Insecta） 、 有 翅 亚 纲 （ Pterygota） 、 虱 目 （ Phthiraptera） 、 长 角 羽 虱 科 （ Philopteridae） 。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。BLAST： 基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 Basic Local Alignm
12、ent Search Toolbp： 碱 基 对 Base PairddH2O： 双 蒸 水 Double Distilled WaterDNA： 脱 氧 核 糖 核 酸 Deoxyribonucleic AcidNCBI： 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心 National Center for Biotechnology InformationPCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase Chain ReactionTAE： Tris-乙 酸 电 泳 缓 冲 液 Tris Acetate-EDTA Buffer 5 原 理根 据 羽 虱 的 形 态 特 征 ，
13、采 用 显 微 镜 镜 检 方 法 ， 判 定 是 否 有 羽 虱 感 染 ， 对 于 虫 卵 、 若 虫 、 存 疑 虫 体 及残 破 虫 体 无 法 确 定 其 种 类 ， 可 进 行 PCR鉴 定 。 DB53/T 1064.3 2021 2 6 试 验 条 件6.1 实 验 室 通 用 要 求实 验 室 满 足 GB 19489中 生 物 安 全 实 验 室 的 要 求 。6.2 人 员 要 求采 样 和 试 验 人 员 应 具 有 相 应 的 专 业 知 识 。7 仪 器 设 备 和 试 剂7.1 仪 器 设 备7.1.1 体 视 显 微 镜 。 7.2.2 载 玻 片 、 培 养
14、皿 、 离 心 管 、 样 品 管 。7.2.3 PCR仪 。7.2.4 微 量 移 液 器 ： 单 道 可 调 ， 量 程 0.5 L 10 L、 2 L 20 L、 10 L 100 L和 100 L1 000 L。7.2.5 电 子 天 平 ： 量 程 0.01 mg 10 000 mg。7.2.6 恒 温 水 浴 锅 ： 36 1 ， 65 1 。7.2.7 高 速 离 心 机 ： 转 速 可 达 12 000 r/min。7.2.8 电 泳 系 统 。7.2.9 微 波 炉 。7.2.10 凝 胶 成 像 系 统 。7.2 试 剂7.2.1 50 TAE缓 冲 液 ： Tris碱 2
15、42 g和 57.1 mL冰 醋 酸 ， 用 双 蒸 水 定 容 到 1 L。 7.2.2 核 酸 染 料 ， 用 于 凝 胶 成 像 显 示 条 带 。7.2.3 2 Taq PCR Mix。7.2.4 引 物 （ 基 于 COI基 因 设 计 引 物 ） 。7.2.5 霍 氏 液 。7.2.6 乙 酸 乙 酯 。7.2.7 70%乙 醇 。7.2.8 商 品 化 DNA提 取 试 剂 盒 。7.2.9 DL 2000 DNA Marker。7.2.10 琼 脂 糖 。 1.5%琼 脂 糖 凝 胶 ： 1.5 g琼 脂 糖 与 100 mL 1 TAE缓 冲 液 ， 加 热 融 化 均 匀
16、， 加 入 10 L核 酸 染 料 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 。8 样 品 8.1 样 品 采 集 DB53/T 1064.3 2021 3 在 体 表 皮 肤 、 毛 根 、 羽 毛 处 找 到 淡 黄 色 或 暗 灰 色 的 虱 体 或 虫 卵 ， 收 集 放 入 样 品 管 中 ， 做 好 记 录 。 刚死 亡 绿 孔 雀 可 将 其 放 入 有 乙 酸 乙 酯 的 密 闭 容 器 中 ， 熏 蒸 5min后 ， 用 手 逆 向 拨 动 羽 毛 ， 羽 虱 掉 落
17、 ,将 羽 虱收 集 放 入 样 品 管 。8.2 样 本 保 存将 羽 虱 样 本 保 存 于 70%乙 醇 内 ， 拧 紧 盖 子 后 上 下 摇 晃 使 虱 体 充 分 浸 泡 在 70%乙 醇 中 ， 并 检 查 是 否 有 液体 渗 漏 。 低 温 或 置 于 4 冰 箱 储 存 。8.3 样 品 运 输样 品 采 集 完 成 后 运 输 到 实 验 室 进 行 检 测 。 70%的 乙 醇 属 于 危 险 化 学 品 ， 运 输 过 程 中 要 确 保 容 器 不 泄漏 、 不 损 坏 。 不 应 与 酸 类 、 易 燃 物 、 自 燃 物 品 等 并 车 混 运 。8.4 生 物
18、 安 全 要 求 样 品 采 集 及 试 验 过 程 中 做 好 自 身 防 护 ， 同 时 注 意 对 绿 孔 雀 的 生 活 环 境 进 行 清 扫 、 环 境 消 毒 。 生 物 安全 要 求 按 照 GB/T 27401的 规 定 进 行 。9 试 验 步 骤9.1 形 态 学 检 查9.1.1 直 接 观 察 法按 下 列 区 域 顺 序 对 绿 孔 雀 进 行 检 查 ： 翅 (下 侧 )、 腹 侧 、 腹 部 、 臀 部 (下 侧 )、 胸 部 、 翅 (上 侧 )、 背 部 、臀 部 (上 侧 )、 颈 部 、 头 部 。 观 察 是 否 有 羽 虱 。9.1.2 显 微 镜
19、检 查将 样 品 管 内 保 存 的 羽 虱 放 在 透 明 培 养 皿 或 载 玻 片 上 ， 用 清 水 清 洗 干 净 虫 体 ， 滴 加 霍 氏 液 固 定 ， 盖 上 盖 玻 片 。 对 比 附 录 A中 的 图 A.1， 用 体 视 显 微 镜 进 行 形 态 学 观 察 。9.2 PCR检 测9.2.1 样 品 DNA提 取 与 保 存将 8.1收 集 的 羽 虱 样 品 用 商 品 化 DNA提 取 试 剂 盒 进 行 试 验 。 DNA提 取 具 体 操 作 步 骤 按 照 试 剂 盒 说 明 书进 行 ， 将 提 好 的 DNA保 存 于 4 冰 箱 中 。9.2.2 PC
20、R扩 增9.2.2.1 PCR扩 增 引 物PCR扩 增 引 物 见 附 录 B中 的 B.1。9.2.2.2 PCR扩 增 体 系 PCR扩 增 体 系 见 附 录 B中 的 B.2。9.2.2.3 PCR扩 增 程 序 DB53/T 1064.3 2021 4 样 品 DNA在 PCR仪 上 进 行 PCR扩 增 的 反 应 程 序 为 95 预 变 性 3min， 95 变 性 1min， 50 退 火45s， 72 延 伸 1.5min， 30个 循 环 后 ， 72 延 伸 10min。9.2.3 PCR产 物 检 测PCR扩 增 完 成 后 ， 取 PCR产 物 5 L， 加 入
21、1.5%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 孔 中 ， 以 DL 2000 DNA Marker作 为 参照 ， 110 V电 压 电 泳 30min后 ， 将 凝 胶 置 于 紫 外 凝 胶 成 像 分 析 系 统 中 进 行 观 察 拍 照 ， 若 出 现 预 期 的 475 bp左 右 的 条 带 ， 扩 增 条 带 进 行 测 序 后 验 证 。10 试 验 数 据 处 理10.1 形 态 学 结 果 判 定羽 虱 体 型 较 小 ， 长 0.5mm 10mm， 头 部 形 状 多 变 ， 类 似 于 三 角 形 或 卵 圆 形 ， 头 端 的 宽 度 大 于 胸 部 ， 触 角 一 对 ，
22、口 器 位 于 头 腹 面 ， 咀 嚼 式 。 胸 部 三 节 ， 无 翅 ， 三 对 足 分 别 位 于 前 、 中 、 后 胸 。 腹 部 圆 形 至 长卵 圆 形 ， 体 型 宽 短 或 细 长 ， 呈 淡 黄 色 或 灰 色 。用 显 微 镜 对 标 本 进 行 观 察 ， 发 现 形 态 符 合 附 录 A 中 图 A.1 羽 虱 形 态 特 征 ， 则 鉴 定 为 绿 孔 雀 羽 虱 。10.2 PCR结 果 判 定将 PCR产 物 测 序 结 果 与 NCBI GenBank中 的 序 列 进 行 BLAST 在 线 比 对 ， 与 羽 虱 相 应 序 列 匹 配 率 不 小于
23、90%时 即 可 判 定 绿 孔 雀 羽 虱 感 染 阳 性 。 DB53/T 1064.3 2021 5 附 录 A（ 规 范 性 ）羽 虱 形 态体 视 显 微 镜 下 羽 虱 形 态 如 图 A.1所 示 。 图 A.1 羽 虱 镜 检 图 （ 40） DB53/T 1064.3 2021 6 附 录 B（ 规 范 性 ）PCR反 应B.1 PCR扩 增 引 物 序 列根 据 COI基 因 设 计 PCR扩 增 引 物 ， 引 物 序 列 如 下 表 B.1所 示 。表 B.1 PCR 扩 增 引 物 序 列引 物 名 称 序 列 （ 5 -3 ）上 游 引 物 CCGGATCCTTYTGRTTYTTYGGNCAYCC 下 游 引 物 CCGGATCCACNACRTARTANGTRTCRTGB.2 PCR扩 增 体 系PCR扩 增 体 系 见 表 B.2。 表 B.2 PCR扩 增 体 系组 分 用 量 （ L）模 板 DNA（ 20 ng/L） 3.0上 游 引 物 （ 10 M） 1.0下 游 引 物 （ 10 M） 1.0 2 Taq PCR Mix 12.5无 菌 水 7.5合 计 25_ DB53/T1064.32021
