1、ICS 65.020.30 CCS B41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1067 2021纯 种 绿 孔 雀 鉴 定 技 术 规 程 Technical specification for identification of pure Pavo muticus 2021 -09-30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/T 10672021 I 目 次前 言 .III1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 形 态 鉴 定 .14.1 鉴 定 材 料 .14.2 鉴 定 内 容 .
2、24.3 形 态 特 征 .2 4.4 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 性 状 差 别 .24.5 疑 似 绿 孔 雀 个 体 形 态 鉴 定 .25 分 子 鉴 定 .25.1 鉴 定 材 料 .35.2 鉴 定 原 理 .35.3 样 品 采 集 .35.4 DNA制 备 .35.5 基 因 组 重 测 序 .45.6 参 考 基 因 组 选 择 .45.7 纯 种 鉴 定 .4附 录 A （ 资 料 性 ） 蓝 孔 雀 和 绿 孔 雀 性 状 对 比 图 .5附 录 B （ 资 料 性 ） DNA样 品 的 提 取 与 检 测 .6 附 录 C （ 资 料 性 ） 试 剂 及 仪 器 设 备
3、 .8附 录 D （ 资 料 性 ） 鉴 定 结 果 样 表 .9 DB53/T 10672021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委
4、 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 ： 中 国 科 学 院 昆 明 动 物 研 究 所 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 董 锋 、 黄 艳 梅 、 单 鹏 飞 、 李 建 春 、 王 洁 、 李 杰 、 吴 飞 、 伍 和 启 、 高 建 云 、 岩 道 、常 江 、 杨 晓 君 。 DB53/T 10672021 1 纯 种 绿 孔 雀 鉴 定 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了 纯 种 绿 孔 雀 （ Pavo muticus） 鉴 定 技 术 的 形 态 鉴 定 、 分 子 鉴 定 。本 文
5、 件 适 用 于 绿 孔 雀 的 纯 种 鉴 定 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本文 件 。 GB/T 30989-2014 高 通 量 基 因 测 序 技 术 规 程GB/T 35892 实 验 动 物 福 利 伦 理 审 查 指 南3 术 语
6、和 定 义GB/T 30989界 定 的 以 及 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 物 种 鉴 定 species identification通 过 形 态 特 征 、 分 子 鉴 定 ， 确 定 检 测 样 本 是 否 为 纯 种 个 体 的 过 程 。3.2 基 因 组 genome一 种 生 物 体 具 有 的 所 有 遗 传 信 息 的 总 和 。来 源 ： GB/T 30989-2014， 3.2 3.3 参 考 基 因 组 序 列 reference genome sequence通 过 对 某 个 物 种 的 基 因 组 进 行 从 头 测 序 ，
7、利 用 生 物 信 息 学 分 析 方 法 进 行 拼 接 、 组 装 ， 而 获 得 的 基 因组 序 列 信 息 。3.4 基 因 组 重 测 序 genome resequencing针 对 有 参 考 基 因 组 序 列 的 物 种 的 不 同 个 体 进 行 基 因 组 测 序 ， 以 获 取 个 体 或 群 体 间 的 差 异 性 信 息 。3.5 小 片 段 基 因 组 文 库 small-insert genomic library片 段 大 小 在 1 kb以 下 的 普 通 DNA文 库 （ 200 bp、 350 bp、 500 bp等 ） ， 可 用 于 基 因 组 重
8、 测 序 。4 形 态 鉴 定 4.1 鉴 定 材 料 DB53/T 1067 2021 2 供 鉴 定 的 个 体 应 为 绿 孔 雀 亚 成 体 或 成 体 。4.2 鉴 定 内 容鉴 定 内 容 见 表 1。 表 1 绿 孔 雀 形 态 学 鉴 定 内 容性 状 鉴 定 项 目整 体 性 状 体 型 、 体 色冠 羽 性 状 冠 羽 颜 色 、 形 状 、 羽 轴 结 构面 部 性 状 眼 先 颜 色 、 裸 皮 颜 色 、 形 状颈 胸 、 背 部 性 状 羽 色 、 形 状4.3 形 态 特 征 4.3.1 整 体 性 状4.3.1.1 个 体 较 大 ， 雄 性 体 重 3850
9、g 5000 g， 雌 性 体 重 1060 g 1160 g， 体 羽 主 要 呈 金 翠 绿 色 。4.3.1.2 雄 鸟 头 顶 具 一 簇 直 立 的 冠 羽 ， 下 背 具 闪 耀 紫 辉 的 铜 钱 状 花 斑 ； 尾 屏 发 达 ， 长 可 达 1 m， 羽 端有 一 闪 耀 蓝 色 和 翠 绿 色 相 嵌 的 眼 状 斑 ； 尾 羽 黑 褐 色 ， 形 短 而 隐 于 尾 屏 下 ； 初 级 覆 羽 和 初 级 飞 羽 棕 黄 色 。4.3.1.3 雌 鸟 无 尾 屏 ， 初 级 飞 羽 外 翈 有 黑 色 横 斑 ， 背 羽 多 呈 黑 褐 色 而 密 布 棕 褐 色 斑 纹
10、 ， 羽 色 也 较 淡 钝 ，不 如 雄 鸟 艳 丽 。4.3.2 冠 羽 性 状4.3.2.1 冠 羽 颜 色 ： 羽 缘 具 翠 绿 色 宽 缘 ， 中 央 呈 辉 蓝 色 。4.3.2.2 冠 羽 形 状 ： 簇 状 。4.3.2.3 羽 枝 结 构 ： 羽 轴 两 侧 由 羽 基 至 顶 端 均 着 生 羽 小 枝 。4.3.3 颊 部 性 状 4.3.3.1 眼 周 裸 皮 呈 浅 钴 蓝 色 ， 颊 部 裸 皮 呈 浅 钴 黄 色 。4.3.3.2 眼 先 雄 性 蓝 黑 色 ， 雌 性 棕 褐 色 。4.3.4 颈 胸 背 性 状颈 胸 部 及 上 背 部 呈 金 铜 色 的
11、铜 钱 状 花 斑 ， 羽 基 暗 紫 蓝 色 ， 常 展 露 于 外 ， 羽 缘 闪 翠 绿 色 。4.4 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 性 状 差 别绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 整 体 形 态 对 比 参 见 附 录 A图 A.1。 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 之 冠 羽 、 颊 部 以 及 颈 胸 背 性 状 对 比见 附 录 A图 A.2。4.5 疑 似 绿 孔 雀 个 体 形 态 鉴 定将 待 检 个 体 与 纯 种 绿 孔 雀 按 4.3、 4.4条 要 求 进 行 逐 一 观 察 、 比 对 及 记 录 ， 全 部 性 状 符 合 纯 种 绿 孔 雀形 态 学 特 征 ， 判 定
12、为 疑 似 绿 孔 雀 。 5 分 子 鉴 定 DB53/T 10672021 3 5.1 鉴 定 材 料经 形 态 鉴 定 为 疑 似 绿 孔 雀 或 无 法 进 行 形 态 鉴 定 的 个 体 的 血 液 、 羽 毛 样 品 等 。5.2 鉴 定 原 理绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 （ Pavo cristatus） 存 在 显 著 的 基 因 组 水 平 遗 传 分 化 ， 可 通 过 计 算 和 统 计 待 检 样 品基 因 组 中 两 物 种 的 遗 传 组 成 贡 献 率 判 断 其 种 质 资 源 状 况 。5.3 样 品 采 集5.3.1 样 品 采 集 中 的 动 物 福 利
13、应 符 合 GB/T 35892 的 要 求 。5.3.2 血 液 采 集 使 用 一 次 性 真 空 采 血 管 （ 添 加 EDTA-K2） 采 血 50 L 100 L。 血 样 短 期 保 存 于 -20 冰 箱 ， 长 期 保 存 于 -80 冰 箱 。5.3.3 血 液 不 可 获 取 时 ， 可 用 无 菌 塑 胶 手 套 收 集 自 然 脱 落 飞 羽 、 尾 羽 或 尾 上 覆 羽 等 。 剪 取 如 图 1 所 示 的 羽 根 部 分 ， 短 期 保 存 于 -20 冰 箱 ， 长 期 保 存 于 -80 冰 箱 。 图 1 用 于 DNA提 取 的 羽 毛 部 分 示 意
14、 图5.4 DNA制 备可 采 用 传 统 DNA提 取 方 法 （ 参 见 附 录 B中 B.1） 或 商 业 试 剂 盒 提 取 DNA， 常 用 试 剂 和 仪 器 参 见 附 录 C，用 于 建 库 的 DNA宜 符 合 如 下 要 求 ：a) 使 用 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 和 凝 胶 成 像 系 统 （ DNA 完 整 性 胶 检 测 见 附 录 B 中 B.2） 检 测 DNA 完 整 性 ，凝 胶 电 泳 条 带 清 晰 且 应 在 2 kb 以 上 （ 如 图 2 示 例 ） ；b) 使 用 紫 外 分 光 光 度 计 检 测 DNA纯 度 和 浓 度 （ 检 测 方
15、 法 参 见 附 录 B 中 B.3） ， 在 260 nm和 280nm的 紫 外 线 吸 收 值 比 值 （ OD260/280） 在 1.8 2.0之 间 ， 浓 度 不 低 于 50 ng/uL， 总 质 量 不 低 于 3g。 DB53/T 1067 2021 4 图 2 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 DNA 条 带 示 意 图注 ： 其 中 M代 表 DNA分 子 量 标 准 Marker， 1 6代 表 待 检 DNA样 品 。 图 中 DNA主 带 清 晰 且 在 2 Kb以 上 。5.5 基 因 组 重 测 序开 展 DNA样 品 的 小 片 段 基 因 组 文 库 构 建 （
16、 即 建 库 ） 和 测 序 ， 技 术 要 求 应 符 合 GB/T 30989的 要 求 。选 择 两 端 序 列 对 读 （ 即 双 端 测 序 ） 模 式 。 上 述 建 库 和 测 序 可 送 至 商 业 公 司 开 展 。 为 保 证 分 析 质 量 ， 每 待检 个 体 总 测 序 原 始 数 据 量 不 低 于 5 Gbp， 去 除 接 头 序 列 以 备 后 需 分 析 。5.6 参 考 基 因 组 选 择在 NCBI数 据 库 中 选 择 已 发 布 最 新 版 本 的 纯 种 蓝 孔 雀 基 因 组 （ 如 GenBank访 问 号 ： GCA_005519975.1）和
17、 纯 种 绿 孔 雀 基 因 组 （ 如 GenBank访 问 号 ： GCA_016647715.1） 作 为 参 考 基 因 组 。5.7 纯 种 鉴 定 可 采 用 开 源 软 件 sppIDer， 分 别 计 算 和 统 计 待 检 个 体 基 因 组 测 序 数 据 中 比 对 到 纯 种 绿 孔 雀 和 蓝 孔 雀参 考 基 因 组 成 分 的 比 例 。 当 蓝 孔 雀 的 基 因 组 贡 献 率 低 于 1%时 ， 软 件 判 定 待 检 个 体 为 纯 种 绿 孔 雀 个 体 。当 蓝 孔 雀 的 基 因 组 贡 献 率 高 于 1%时 ， 软 件 判 定 待 检 个 体 为
18、 非 绿 孔 雀 纯 种 个 体 ， 鉴 定 结 果 模 板 参 见 附 录 D。 DB53/T 10672021 5 附 录 A（ 资 料 性 ）蓝 孔 雀 和 绿 孔 雀 性 状 对 比 图 图 A.1 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 整 体 形 态 对 比注 ： 引 自 Daniel Giraud Elliot,1872. A monograph of the Phasianidae, or, Family of the pheasants. 图 A.2 绿 孔 雀 与 蓝 孔 雀 的 冠 羽 、 面 部 以 及 颈 胸 背 部 性 状 对 比注 ： 引 自 Daniel Giraud El
19、liot,1872. A monograph of the Phasianidae, or, Family of the pheasants. DB53/T 1067 2021 6 附 录 B（ 资 料 性 ）DNA样 品 的 提 取 与 检 测B.1 使 用 传 统 方 法 提 取 血 液 或 羽 毛 DNAB.1.1 取 5 L 10 L血 液 或 1 3个 来 自 同 一 个 体 的 羽 根 于 1.5 mL离 心 管 中 。 如 是 羽 根 ， 使 用 灭 过 菌的 眼 科 剪 剪 碎 。B.1.2 加 入 500 L于 4 预 冷 的 细 胞 裂 解 液 （ 配 方 为 ： 100
20、mM Tris-HCl， 5 mM EDTA， 500 mM NaCl，1% SDS， pH8.0） ， 混 匀 悬 浊 液 。B.1.3 向 裂 解 产 物 中 加 入 20 L蛋 白 酶 K溶 液 （ 10 mg/mL） ， 混 匀 后 ， 放 入 恒 温 混 匀 仪 于 1 000 rpm混 匀频 率 和 55 消 化 3 h以 上 ， 但 不 要 超 过 10 h。B.1.4 将 消 化 液 温 度 降 至 室 温 ， 加 入 200 L醋 酸 钾 溶 液 上 下 颠 倒 摇 晃 20s左 右 ， 使 其 充 分 混 合 。 B.1.5 放 入 普 通 高 速 离 心 机 中 13 0
21、00 rpm离 心 5min， 使 蛋 白 /SDS复 合 物 沉 淀 。B.1.6 将 上 清 转 移 到 另 一 干 净 1.5 mL离 心 管 中 ， 加 入 600 L异 丙 醇 ， 充 分 混 合 ， 用 13 000 rpm离 心5min收 集 DNA沉 淀 。B.1.7 倒 去 上 清 ， 加 入 500 L 70 乙 醇 溶 液 ， 颠 倒 管 子 数 次 ， 用 13 000 rpm离 心 3min。B.1.8 倒 去 上 清 ， 在 实 验 台 上 敞 口 放 置 3min 10min促 使 残 余 乙 醇 挥 发 。B.1.9 将 DNA沉 淀 溶 解 于 50 L 10
22、0 L双 蒸 水 中 ， 吸 取 5 L用 于 琼 脂 糖 凝 胶 检 测 和 核 酸 定 量 检 测 ， 其余 转 入 -20 保 存 。B.2 DNA完 整 性 胶 检 测B.2.1 用 双 蒸 水 洗 净 制 胶 模 板 和 梳 子 ， 调 节 水 平 ， 放 在 制 胶 平 板 上 ， 向 电 泳 槽 中 倒 入 1XTAE电 泳 缓 冲 液 ，其 量 以 没 过 电 泳 槽 0.2 cm为 宜 。B.2.2 称 取 1 g琼 脂 糖 与 100 mL 1xTAE缓 冲 液 ， 加 入 到 配 胶 用 的 三 角 烧 瓶 内 ， 旋 转 摇 晃 均 匀 。B.2.3 微 波 炉 内 加
23、 热 2.5min， 取 出 后 加 入 一 滴 荧 光 染 料 ， 轻 轻 旋 转 以 充 分 混 匀 凝 胶 溶 液 。 B.2.4 倒 入 胶 槽 ， 加 入 梳 子 ， 室 温 下 放 置 30min至 凝 胶 完 全 凝 结 ， 小 心 向 上 拔 出 梳 子 ， 将 凝 胶 预 浸 在 电泳 槽 内 ， 静 置 2min至 加 样 孔 内 无 气 泡 。B.2.5 使 用 移 液 器 取 1 L DNA样 品 ， 与 1 L 6loading buffer混 匀 后 ， 加 入 凝 胶 的 加 样 孔 内 。B.2.6 接 通 电 泳 仪 电 源 ， 保 证 加 样 孔 的 一 端
24、 朝 向 负 极 ， 150 V恒 压 运 行 20min 40min， loading buffer中 溴 酚 蓝 代 表 的 片 段 大 小 为 300 bp， 电 泳 中 保 证 该 指 示 剂 不 要 泳 动 出 凝 胶 。B.2.7 电 泳 完 毕 ， 关 闭 电 源 ， 在 凝 胶 成 像 仪 紫 外 模 式 下 观 察 电 泳 带 及 其 位 置 ， 并 与 DNA分 子 量 标 准 Marker比 较 以 判 断 DNA样 品 的 完 整 性 。B.3 DNA纯 度 和 浓 度 测 量B.3.1 本 文 件 采 用 的 紫 外 分 光 光 度 计 为 NanoDrop2000，
25、 若 用 其 它 品 牌 和 型 号 的 仪 器 ， 分 析 步 骤 请 参 考具 体 说 明 书 。B.3.2 启 动 NanoDrop2000配 套 软 件 ， 设 置 检 测 样 品 为 “ 核 酸 ” ， 进 入 检 测 界 面 。B.3.3 命 名 样 品 ID， 设 置 样 品 类 型 为 DNA， 使 用 双 蒸 水 作 为 空 白 液 进 行 基 线 校 准 。 B.3.4 使 用 滤 纸 擦 净 空 白 液 ， 依 次 检 测 DNA样 品 。 DB53/T 10672021 7 B.3.5 测 量 结 束 后 ， 将 测 量 参 数 输 出 到 表 格 ， 使 用 双 蒸
26、水 和 滤 纸 清 洁 3 5次 ， 并 关 闭 软 件 。 DB53/T 1067 2021 8 AA附 录 C（ 资 料 性 ）试 剂 及 仪 器 设 备C.1 主 要 试 剂C.1.1 50TAE缓 冲 液 (Tris-醋 酸 盐 -EDTA)： 一 种 核 酸 电 泳 缓 冲 液 ， 主 要 用 于 DNA的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 。主 要 成 分 为 Tris-乙 酸 盐 （ 浓 度 40mM） 和 EDTA（ 浓 度 1mM） 。 可 直 接 用 双 蒸 水 稀 释 50倍 至 工 作 浓 度 （ 1）使 用 。C.1.2 核 酸 荧 光 染 料 ： 用 于 凝 胶 成 像
27、显 示 条 带 。 C.1.3 6xLoading Buffer： 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 上 样 缓 冲 液 ， 可 以 显 示 两 条 带 ， 前 面 的 蓝 色 条 带 是 溴 酚 蓝 ，代 表 的 片 段 大 小 是 300 bp， 后 面 的 绿 色 条 带 是 二 甲 苯 青 ， 代 表 的 片 段 大 小 在 4 000 bp左 右 。C.1.4 蛋 白 酶 K溶 液 ： 用 于 核 酸 与 蛋 白 质 的 分 离 ， 浓 度 为 10 mg/mL。C.1.5 3M醋 酸 钾 溶 液 ： 取 60 mL的 5 mol/L醋 酸 钾 ， 加 11.5 mL冰 醋 酸 ， 加 双
28、 蒸 水 稀 释 至 100 mL，PH4.8。C.1.6 异 丙 醇 ： 分 析 纯 级 。C.1.7 70%乙 醇 溶 液 。C.1.8 双 蒸 水 ： ddH 2O。C.1.9 琼 脂 糖 。C.1.10 细 胞 裂 解 缓 冲 液 ： 100 mM Tris-HCl， 5 mM EDTA 500mM NaCl， 1% SDS, pH8.0。C.1.11 蛋 白 酶 K。C.1.12 SDS： 十 二 烷 基 硫 酸 钠 。C.1.13 DNA分 子 量 标 准 Marker： 100 bp 2000 bp。C.2 仪 器 设 备C.2.1 单 道 可 调 式 移 液 器 （ 如 ， 最
29、 大 量 程 分 别 为 3 L， 20 L， 200 L， 1000 L） 。C.2.2 恒 温 混 匀 仪 。C.2.3 普 通 高 速 离 心 机 。C.2.4 电 子 天 平 （ 量 程 0.01 mg 10 000 mg） 。C.2.5 高 压 灭 菌 器 。 C.2.6 水 平 电 泳 仪 。C.2.7 凝 胶 成 像 系 统 。C.2.8 紫 外 分 光 光 度 计 。 DB53/T 10672021 9 B附 录 D（ 资 料 性 ）鉴 定 结 果 样 表鉴 定 结 果 见 表 D.1。 表 D.1 鉴 定 结 果鉴 定 个 体 编 号 ： _； 个 体 年 龄 _； 个 体
30、性 别 _； 鉴 定 人 _。 鉴 定 方 法 鉴 定 内 容 结 果 描 述绿 孔 雀 蓝 孔 雀 其 他形 态 鉴 定 （ 如 未开 展 ， 可 不 填 此项 ） 整 体 性 状 雄 性 体 羽 呈 金 翠 绿 色 体 羽 呈 蓝 色 体 羽 呈 混 杂雌 性 体 羽 呈 金 翠 绿 色 体 羽 呈 棕 褐 色 体 羽 呈 混 杂冠 羽 性 状 冠 羽 簇 形 冠 羽 伞 状 冠 羽 性 状 杂 合面 部 性 状 雄 性 眼 先 呈 蓝 黑 色 眼 先 呈 亮 蓝 色 混 杂 眼 周 裸 皮 浅 钴 蓝 色 眼 周 裸 皮 白 色 眼 周 裸 皮 杂 色 颊 部 裸 皮 浅 钴 黄 色 颊
31、 部 裸 皮 白 色 颊 部 裸 皮 杂 色雌 性 眼 先 呈 棕 褐 色 眼 先 呈 锈 褐 色 混 杂 眼 周 裸 皮 浅 钴 蓝 色 眼 周 裸 皮 白 色 混 杂 颊 部 裸 皮 浅 钴 黄 色 颊 部 裸 皮 白 色 混 杂 颈 胸 背 部 性 状 雄 性 呈 金 铜 色 铜 钱 状 花 斑 呈 蓝 色 丝 状 混 杂雌 性 呈 金 铜 色 铜 钱 状 花 斑 呈 绿 色 鱼 鳞 状 斑 纹 混 杂分 子 鉴 定 （ 如 未开 展 ， 可 不 填 此项 ） 基 因 组 组 成 绿 孔 雀 基 因 组 分 占 比 _ 蓝 孔 雀 基 因 组 分 占 比 _ 统 计 结 果 显 著 不 显 著 DB53/T 1067 2021 10 表 D.1(续 )鉴 定 方 法 鉴 定 内 容 结 果 描 述鉴 定 结 果 鉴 定 个 体 为 ： 绿 孔 雀 纯 种 个 体 非 绿 孔 雀 纯 种 个 体_ DB53/T10672021
