1、ICS 11.220CCS B 41云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1064.4 2021绿 孔 雀 检 疫 技 术 第 4部 分 ： 消 化 道 线 虫 实验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantine technique for Pavo muticusPart 4:Technical specifications for laboratory examination of nematodes indigestive tract 2021 -09- 30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 53 DB53/T 1064.42021
2、 I 目 次前 言 .III引 言 .1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .15 试 验 原 理 .16 常 见 线 虫 形 态 特 征 .2 7 试 验 条 件 .27.1 实 验 室 通 用 要 求 .27.2 人 员 要 求 .27.3 生 物 安 全 要 求 .28 仪 器 设 备 和 试 剂 .28.1 主 要 仪 器 设 备 .28.2 主 要 试 剂 .29 样 品 .310 试 验 步 骤 .310.1 形 态 学 检 测 .310.2 PCR检 测 .3 11 试 验 数 据 处 理 .311.1 虫 卵 检 测 .
3、411.2 虫 体 检 测 .4附 录 A （ 资 料 性 ） 消 化 道 线 虫 的 基 本 形 态 特 征 .5附 录 B （ 规 范 性 ） 粪 样 的 采 集 和 保 存 方 法 .6附 录 C （ 资 料 性 ） 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 虫 卵 虫 体 镜 检 照 片 .7 DB53/T 1064.42021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T 1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 的 第 4部 分 。
4、 DB53/T 1064已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1 部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 2 部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3 部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 4 部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。 本 文 件 主
5、要 起 草 单 位 ： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 、 云 南 省 动 物 卫 生 监 督 所 、 昆 明 动 物 园 。本 文 件 起 草 人 ： 杨 建 发 、 黄 艳 梅 、 张 誉 方 、 吴 长 江 、 邹 丰 才 、 朱 勋 程 、 陈 培 富 、 宋 海 洋 、 衡 昭 君 、蒙 英 雯 、 朱 尤 帅 、 李 云 乔 。 DB53/T 1064.42021 引 言绿 孔 雀 （ Pavo muticus） 在 我 国 仅 分 布 于 云 南 ， 是 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物 ， 也 是 全 球 濒 危 物 种 ，并 已 列
6、入 濒 危 野 生 动 植 物 种 国 际 贸 易 公 约 (CITES)和 世 界 自 然 保 护 联 盟 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 为切 实 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 野 生 动 物 保 护 法 和 中 华 人 民 共 和 国 动 物 防 疫 法 ， 编 制 并 发 布 DB53/T 1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 地 方 标 准 ， 可 让 从 事 绿 孔 雀 保 护 的 相 关 人 员 按 标 准 化 和 规 范 化 程 序 开 展 绿 孔 雀 病 原学 诊 断 ， 从 而 采 取 必 要 的 防 治 措 施 ， 以 提 高 染 疫 绿 孔 雀 的 成 活 率
7、 ， 维 护 绿 孔 雀 种 群 健 康 和 地 区 生 态 平 衡 ，提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1 部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 仪器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 2 部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、
8、 禽流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方面 制 定 了 规 范 ； 第 3 部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 羽 虱 实 验 室 检 测 的 原 理 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 4 部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测
9、技 术 的 试 验 原 理 、常 见 线 虫 形 态 特 征 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定了 规 范 。 DB53/T 1064.42021 1 绿 孔 雀 检 疫 技 术 第 4 部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范1 范 围本 规 范 明 确 了 绿 孔 雀 （ Pavomuticus） 检 疫 技 术 中 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、 常 见 线虫 形 态 特 征 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂
10、、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 绿 孔 雀 检 疫 技 术 中 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全
11、通 用 要 求GB/T 27401 实 验 室 质 量 控 制 规 范 动 物 检 疫3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 线 虫 nematodes线 虫 动 物 门 为 假 体 腔 动 物 ， 线 虫 属 通 常 呈 圆 柱 形 ， 线 状 或 毛 发 状 ， 某 些 种 类 呈 鞭 状 或 球 状 。 不 分 节 ，两 侧 对 称 并 具 有 三 胚 层 假 体 腔 ， 一 般 为 雌 雄 异 体 。 虫 体 大 小 随 种 类 不 同 差 别 较 大 ， 雄 虫 一 般 较 雌 虫 为 小 。寄 生 性 线 虫 最 常 见 寄 生 于 消
12、化 道 。 4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。BLAST： 基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 Basic Local Alignment Search ToolDNA： 脱 氧 核 糖 核 酸 Deoxyribonucleic AcidNCBI： 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心 National Center for Biotechnology InformationPCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase Chain ReactionTAE： Tris-乙 酸 电 泳 缓 冲 液 Tris Acetate-
13、EDTA Buffer5 试 验 原 理绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 的 检 测 可 采 用 形 态 学 观 察 线 虫 虫 卵 或 虫 体 的 方 法 ， 当 镜 检 发 现 形 态 特 征 明 确 的 线虫 虫 卵 ， 如 毛 细 线 虫 ， 可 直 接 作 出 判 定 ； 对 于 无 法 利 用 形 态 学 鉴 定 的 虫 卵 或 虫 体 ， 进 一 步 采 用 PCR方 法 进 行 虫 种 鉴 定 。 DB53/T 1064.4 2021 2 6 常 见 线 虫 形 态 特 征绿 孔 雀 常 见 的 线 虫 主 要 有 蛔 虫 （ Ascaridia） 、 异 刺 线 虫 （ Het
14、erakis） 和 毛 细 线 虫 （ Capillaria） 。绿 孔 雀 线 虫 的 基 本 形 态 特 征 参 见 附 录 A。7 试 验 条 件7.1 实 验 室 通 用 要 求实 验 室 应 满 足 GB 19489中 的 要 求 。7.2 人 员 要 求采 样 和 试 验 人 员 应 具 有 相 应 的 专 业 知 识 。 7.3 生 物 安 全 要 求采 样 及 试 验 过 程 中 做 好 自 身 防 护 ， 试 验 结 束 后 的 检 验 器 具 要 进 行 消 毒 处 理 ， 废 弃 样 品 要 及 时 进 行 无害 化 集 中 处 理 。8 仪 器 设 备 和 试 剂8.1
15、 主 要 仪 器 设 备8.1.1 正 置 光 学 显 微 镜 、 体 视 显 微 镜 。8.1.2 载 玻 片 及 盖 玻 片 若 干 ， 漏 斗 、 玻 璃 棒 、 烧 杯 。8.1.3 金 属 筛 ： 60目 。8.1.4 PCR扩 增 仪 。8.1.5 高 速 台 式 离 心 机 。 8.1.6 电 子 天 平 ： 量 程 0.01 mg 10 000 mg。8.1.7 恒 温 水 浴 锅 ： 36 1 ， 65 1 。8.1.8 超 纯 水 器 ， 高 压 灭 菌 锅 。8.1.9 单 道 移 液 器 （ 量 程 0.5 L 10 L、 2 L 20 L、 10 L 100 L 和
16、100 L 1 000 L） 。8.1.10 电 泳 槽 、 电 泳 仪 、 紫 外 凝 胶 成 像 仪 、 涡 旋 振 荡 器 。8.2 主 要 试 剂8.2.1 饱 和 食 盐 水 。8.2.2 2.5%重 铬 酸 钾 液 ， 乳 酸 酚 透 明 液 。8.2.3 基 因 组 DNA提 取 试 剂 盒 。8.2.4 2 Taq PCR Master Mix。8.2.5 DL 2000 DNA Marker。8.2.6 无 菌 水 。 8.2.7 50 TAE缓 冲 液 ： Tris 碱 242 g 和 57.1 mL冰 醋 酸 ， 用 双 蒸 水 定 容 到 1 L。8.2.8 核 酸 染
17、 料 ， 用 于 凝 胶 成 像 显 示 条 带 。8.2.9 1%琼 脂 糖 凝 胶 ： 1g 琼 脂 糖 与 100mL1 TAE缓 冲 液 ， 加 热 融 化 均 匀 ， 加 入 10 L 核 酸 染 料 ， 60 时 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 。 DB53/T 1064.42021 3 9 样 品样 品 从 绿 孔 雀 粪 便 中 采 集 ， 采 样 和 保 存 方 法 见 附 录 B。10 试 验 步 骤10.1 形 态 学 检 测10.1.1 虫 卵 检 测
18、采 用 饱 和 食 盐 水 漂 浮 法 ， 线 虫 卵 富 集 在 饱 和 液 表 面 。 取 粪 样 5 g， 加 饱 和 食 盐 水 50 mL， 用 玻 璃 棒 搅匀 ， 通 过 60目 金 属 筛 或 双 层 纱 布 过 滤 到 干 净 烧 杯 中 ， 静 置 0.5 h； 蘸 取 表 面 液 膜 ， 点 样 于 载 玻 片 上 ， 盖上 盖 玻 片 ， 进 行 镜 检 。 10.1.2 虫 体 检 测从 粪 样 中 分 离 虫 体 ， 用 生 理 盐 水 清 洗 干 净 ， 放 于 载 玻 片 ， 滴 加 乳 酸 酚 透 明 液 2 3滴 ， 盖 上 盖 玻 片 ，在 光 学 显 微
19、 镜 下 观 察 透 明 虫 体 的 内 部 形 态 构 造 。 对 于 存 疑 虫 体 ， 结 合 下 述 PCR扩 增 方 法 对 其 进 行 虫 种 鉴定 。10.2 PCR检 测10.2.1 DNA的 提 取 和 保 存取 粪 样 ， 用 商 品 化 DNA提 取 试 剂 盒 进 行 DNA提 取 ， 步 骤 按 照 DNA提 取 试 剂 盒 说 明 书 进 行 。 1周 内 使 用 到的 DNA， 保 存 于 4 冰 箱 中 ； 需 要 长 期 保 存 的 DNA， 保 存 于 -20 冰 箱 中 。10.2.2 PCR扩 增10.2.2.1 PCR扩 增 引 物 针 对 线 虫 I
20、TS基 因 的 部 分 片 段 设 计 引 物 ， 此 引 物 灵 敏 度 和 特 异 性 较 高 。 上 下 游 引 物 序 列 如 下 ：BD1： 5-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3； BD2： 5ATGCTTAAATTCAGCGGGT-3 。10.2.2.2 PCR扩 增 体 系PCR扩 增 体 系 为 50 L， 包 括 2 Taq PCR Master Mix 25.0 L， 无 菌 水 19.0 L， 引 物 BD1和 BD2各2.0 L， DNA模 板 2.0 L。10.2.2.3 PCR扩 增 程 序用 PCR扩 增 仪 设 置 反 应 程 序 ， 94 预 变
21、性 5min； 94 变 性 30s， 50 退 火 30s， 72 延 伸 30s， 设置 30个 循 环 反 应 ， 最 后 72 延 伸 5min， 16 结 束 反 应 ， 同 时 设 阴 性 对 照 和 阳 性 对 照 。10.2.2.4 PCR产 物 检 测PCR扩 增 完 成 后 ， 取 PCR产 物 5 L， 加 入 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 孔 中 ， 以 DL 2000 DNA Marker作 为 参 照 ， 110 V电 压 电 泳 30min。 将 凝 胶 取 出 放 入 紫 外 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 并 拍 照 。 若 出 现 预 期 的 1 000
22、bp左 右 的 条带 ， 扩 增 条 带 进 行 测 序 后 验 证 。11 试 验 数 据 处 理 DB53/T 1064.4 2021 4 11.1 虫 卵 检 测经 饱 和 食 盐 水 漂 浮 法 镜 检 发 现 如 附 录 C中 图 C.1或 图 C.2所 示 的 虫 卵 ， 直 接 判 定 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫感 染 阳 性 。 若 发 现 存 疑 虫 卵 ， 对 其 进 行 PCR检 测 后 ， 将 PCR产 物 测 序 结 果 与 NCBI GenBank中 的 序 列 进 行BLAST在 线 比 对 ， 判 定 是 否 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 感 染
23、阳 性 。11.2 虫 体 检 测对 虫 体 进 行 镜 检 观 察 到 如 附 录 C中 图 C.3或 图 C.4所 示 的 虫 体 ， 直 接 判 定 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 感 染 阳性 。 若 发 现 存 疑 虫 体 ， 对 其 进 行 PCR检 测 后 ， 将 PCR产 物 测 序 结 果 与 NCBI GenBank中 的 序 列 进 行 BLAST在线 比 对 ， 判 定 是 否 为 绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 感 染 阳 性 。 DB53/T 1064.42021 5 附 录 A（ 资 料 性 ）消 化 道 线 虫 的 基 本 形 态 特 征寄 生 于 孔 雀
24、体 内 的 线 虫 主 要 为 蛔 虫 （ Ascaridia） 、 异 刺 线 虫 （ Heterakis） 和 毛 细 线 虫 （ Capillaria） ： 蛔 虫 （ Ascaridia） 呈 黄 白 色 ， 圆 柱 状 ， 雄 虫 长 2.6 cm 7 cm； 雌 虫 长 6.5 cm 11 cm。 虫 卵 呈椭 圆 形 ， 深 灰 色 ， 卵 壳 光 滑 ， 大 小 为 （ 70 90） m （ 47 51） m； 异 刺 线 虫 （ Heterakis） 属 于 异 刺 科 异 刺 属 线 虫 ， 寄 生 于 孔 雀 等 禽 类 的 盲 肠 。 虫 体 呈 细 线 状 ， 淡黄
25、色 。 雄 虫 长 7 mm 13 mm； 雌 虫 长 10 mm 15 mm。 虫 卵 呈 椭 圆 形 ， 浅 灰 色 ， 大 小 为 （ 65 80）m （ 35 46） m； 毛 细 线 虫 （ Capillaria） 成 虫 呈 乳 白 色 。 前 端 细 长 ， 毛 发 状 ， 虫 体 后 端 由 细 变 粗 ， 形 状 呈 鞭 子样 。 雄 虫 长 23.7 mm 54.4 mm， 尾 部 卷 曲 ； 雌 虫 长 39.4 mm 53.0 mm， 尾 部 稍 有 弯 曲 。 虫 卵呈 腰 鼓 形 ， 黄 褐 色 ， 卵 壳 较 厚 ， 两 端 有 卵 塞 ， 大 小 （ 65 80
26、） m （ 35 46） m。 DB53/T 1064.4 2021 6 附 录 B（ 规 范 性 ）粪 样 的 采 集 和 保 存 方 法B.1 采 样 工 具一 次 性 PE手 套 、 自 封 袋 、 样 品 管 、 照 相 机 等 。B.2 粪 样 的 选 取 原 则B.2.1 采 集 绿 孔 雀 新 鲜 粪 样 ， 同 一 堆 粪 样 只 采 集 一 份 样 品 。B.2.2 如 遇 到 绿 孔 雀 母 幼 粪 样 ， 分 开 采 集 ； 依 据 母 绿 孔 雀 和 幼 绿 孔 雀 的 粪 样 大 小 有 明 显 差 异 作 出 判 断 ，并 在 备 注 栏 记 录 。B.3 样 品
27、采 集 方 法 B.3.1 在 采 集 用 于 消 化 道 线 虫 研 究 的 粪 样 时 ， 采 集 较 为 新 鲜 、 无 污 染 的 粪 便 样 品 ， 并 佩 戴 一 次 性 PE手套 。 每 次 采 样 时 应 更 换 新 的 PE手 套 ， 以 避 免 样 品 间 的 交 叉 污 染 。B.3.2 采 集 时 ， 直 接 剥 取 分 离 新 鲜 粪 样 的 表 层 部 分 和 内 部 部 分 ， 分 别 放 入 样 品 管 中 ， 贴 上 样 品 标 签 纸 ，写 上 样 品 编 号 和 采 集 地 经 纬 度 、 海 拔 ， 将 样 品 管 放 入 自 封 袋 ， 并 再 次 写
28、 上 样 品 编 号 。B.3.3 同 一 堆 粪 样 应 尽 量 多 取 样 品 。B.4 样 品 记 录 与 编 号在 采 集 粪 样 时 ， 应 填 写 绿 孔 雀 粪 样 采 集 记 录 表 （ 见 表 B.1） 。 记 录 采 样 包 括 样 品 编 号 ， 采 集 管数 ， 采 集 地 名 称 ， 采 集 地 经 纬 度 、 海 拔 ， 采 集 日 期 ， 采 集 人 等 信 息 。表 B.1 绿 孔 雀 粪 样 采 集 记 录 表 样 品 编 号 采 集 管 数 采 集 地 名 称 采 集 地 经 纬 度 、 海 拔 采 集 日 期 采 集 人B.5 样 品 的 临 时 保 存野
29、 外 样 品 采 回 后 ， 仔 细 检 查 核 对 标 签 和 记 录 。 有 条 件 时 在 4 冷 藏 保 存 ， 直 到 样 品 送 到 相 关 实 验 室 。B.6 样 品 的 运 输 和 实 验 室 保 存野 外 样 品 采 集 完 成 后 应 于 48 h内 送 到 相 关 分 子 生 物 学 实 验 室 ， 并 尽 快 进 行 DNA提 取 工 作 。 运 输 过 程中 应 注 意 保 持 低 温 ， 可 将 粪 样 静 置 于 冰 袋 上 ， 用 泡 沫 箱 进 行 保 温 。 B.7 样 品 的 采 集 、 运 输 和 处 理 过 程 中 的 生 物 安 全粪 样 的 采
30、集 、 运 输 和 处 理 过 程 中 的 生 物 安 全 要 求 应 符 合 GB/T 27401 实 验 室 质 量 控 制 规 范 的 要 求 。 DB53/T 1064.42021 7 附 录 C（ 资 料 性 ）绿 孔 雀 消 化 道 线 虫 虫 卵 虫 体 镜 检 照 片绿 孔 雀 消 化 道 毛 细 线 虫 虫 卵 镜 检 照 片 如 图 C.1所 示 ， 蛔 虫 虫 卵 镜 检 照 片 如 图 C.2所 示 ， 毛 细 线 虫 虫 体镜 检 照 片 如 图 C.3所 示 ， 异 刺 线 虫 虫 体 镜 检 照 片 如 图 C.4所 示 。 图 C.1 毛 细 线 虫 虫 卵 光 学 显 微 镜 镜 检 照 片 （ 100） 图 C.2 蛔 虫 虫 卵 光 学 显 微 镜 镜 检 照 片 （ 100） DB53/T 1064.4 2021 8 图 C.3 毛 细 线 虫 虫 体 体 视 显 微 镜 镜 检 照 片 （ 20） 图 C.4 异 刺 线 虫 虫 体 体 视 显 微 镜 镜 检 照 片 （ 20）_ DB53/T1064.42021
