1、ICS 11.220CCS B 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1057 2021滇 金 丝 猴 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取 技 术 规 程 Regulationfordataacquisitionofgutmicrobiotafor Rhinopithecus bieti 2021 - 09 - 30发 布 2021 - 10 - 14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/T 10572021 I 目 次前 言 .III1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 基 本 要 求 .24.1 实 验
2、 室 通 用 要 求 .24.2 主 要 试 剂 及 仪 器 设 备 .25 样 品 采 集 和 保 存 .2 6 滇 金 丝 猴 肠 道 微 生 物 总 DNA 提 取 及 检 测 .26.1 试 剂 盒 选 取 .26.2 肠 道 微 生 物 总 DNA 提 取 .26.3 肠 道 微 生 物 总 DNA 质 量 检 测 .27 肠 道 微 生 物 组 高 通 量 测 序 .27.1 肠 道 微 生 物 16S rRNA 基 因 引 物 选 取 及 扩 增 .27.2 肠 道 微 生 物 16S rRNA PCR扩 增 产 物 电 泳 检 测 及 纯 化 .37.3 肠 道 微 生 物 1
3、6S rRNA 基 因 测 序 .37.4 肠 道 微 生 物 宏 基 因 组 测 序 .38 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取 .38.1 16S rRNA基 因 数 据 质 控 .3 8.2 宏 基 因 组 数 据 质 控 .38.3 宏 基 因 组 数 据 去 除 宿 主 信 息 .38.4 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取 .3附 录 A （ 规 范 性 ） 主 要 试 剂 及 仪 器 设 备 .4附 录 B （ 规 范 性 ） 粪 便 样 品 的 采 集 和 保 存 方 法 .5附 录 C （ 规 范 性 ） 总 DNA样 品 的 提 取 步 骤 、 琼 脂 糖 凝 胶
4、电 泳 检 测 及 成 像 方 法 .8附 录 D （ 规 范 性 ） 16S rRNA PCR引 物 、 反 应 体 系 、 反 应 时 间 及 产 物 纯 化 步 骤 .9 DB53/T 10572021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南
5、省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 ： 云 南 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 于 黎 、 黄 艳 梅 、 张 志 刚 、 朱 勋 程 、 李 依 恬 、 李 宁 、 刘 纯 兵 、 徐 志 茹 、 姚 雪 沁 、胡 靖 扬 、 吴 宏 、 匡 卫 民 。 DB53/T 10572021 1 滇 金 丝 猴 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了
6、滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取 的 基 本 要 求 、 样 品 采 集 和 保 存 、肠 道 微 生 物 总 DNA提 取 及 检 测 、 肠 道 微 生 物 组 高 通 量 测 序 、 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取 。本 文 件 适 用 于 野 外 及 圈 养 滇 金 丝 猴 微 生 物 组 数 据 获 取 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅
7、 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 肠 道 微 生 物 gutmicrobiota动 物 肠 道 中 存 在 的 数 量 庞 大 的 微 生 物 ， 并 帮 助 宿 主 完 成 多 种 生 理 生 化 功 能 的 微 生 物 群 落 。3.2 肠 道 微 生 物 总 DNA gutmicrobiotat
8、otalDNA肠 道 内 所 有 微 生 物 DNA和 部 分 宿 主 DNA的 总 和 。3.3 宏 基 因 组 metagenome特 定 环 境 下 所 有 生 物 的 遗 传 物 质 的 总 和 ， 其 中 包 括 了 样 品 中 所 有 微 生 物 的 遗 传 信 息 。3.4 16S核 糖 体 RNA （ 16SrRNA）细 菌 染 色 体 上 编 码 核 糖 体 RNA亚 基 的 一 个 基 因 ， 存 在 于 所 有 细 菌 的 基 因 组 中 。3.5 16S核 糖 体 RNAV3-V4区 （ 16SrRNAV3-V4）16SrRNA基 因 序 列 中 高 度 变 化 的 区
9、 域 。3.6 聚 合 酶 链 式 反 应 polymerasechainreaction， PCR以 一 对 寡 核 苷 酸 引 物 、 四 种 脱 氧 核 糖 核 苷 酸 (dNTPs)为 原 料 ， 在 合 适 的 温 度 、 离 子 条 件 和 耐 热 DNA聚 合 酶 催 化 下 ， 在 体 外 人 工 合 成 特 异 的 DNA片 段 的 过 程 。3.7 基 因 组 测 序 genomesequencing对 生 物 体 的 基 因 组 序 列 进 行 测 定 ， 以 获 得 基 因 组 信 息 。 DB53/T 10572021 2 3.8 高 通 量 测 序 high-thr
10、oughputsequencing能 一 次 并 行 对 几 十 万 到 几 百 万 条 DNA分 子 进 行 序 列 测 定 的 技 术 。3.9 读 长 reads高 通 量 测 序 平 台 产 生 的 序 列 读 长 称 为 reads， 即 测 序 读 到 的 碱 基 序 列 片 段 ， 是 测 序 的 最 小 单 位 。3.10宿 主 host给 微 生 物 提 供 营 养 和 场 所 的 生 物 ， 本 标 准 中 指 滇 金 丝 猴 。4 基 本 要 求4.1 实 验 室 通 用 要 求 实 验 室 应 满 足 GB 19489中 生 物 安 全 实 验 室 的 要 求 。4.2
11、 主 要 试 剂 及 仪 器 设 备主 要 试 剂 及 仪 器 设 备 见 附 录 A。5 样 品 采 集 和 保 存肠 道 微 生 物 从 滇 金 丝 猴 粪 便 样 品 中 获 取 ， 粪 便 样 品 的 采 集 和 保 存 方 法 见 附 录 B。6 滇 金 丝 猴 肠 道 微 生 物 总 DNA 提 取 及 检 测6.1 试 剂 盒 选 取 选 取 滇 金 丝 猴 粪 便 样 品 中 提 取 肠 道 微 生 物 总 DNA， 有 多 种 商 用 试 剂 盒 可 供 选 择 。6.2 肠 道 微 生 物 总 DNA提 取参 照 商 用 试 剂 盒 说 明 书 进 行 总 DNA提 取 ，
12、 提 取 步 骤 见 附 录 C。6.3 肠 道 微 生 物 总 DNA质 量 检 测使 用 微 量 分 光 光 度 计 和 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 DNA浓 度 检 测 。 粪 便 样 品 提 取 的 总 DNA 260/280在1.7 2.1之 间 ， 浓 度 超 过 2 ng/L， 总 量 超 过 0.25 g的 DNA样 品 为 合 格 。 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 及 成 像 方法 见 附 录 C。7 肠 道 微 生 物 组 高 通 量 测 序7.1 肠 道 微 生 物 16SrRNA 基 因 引 物 选 取 及 扩 增 16S rRNA基 因 引 物 选
13、择 V3-V4区 的 引 物 338F及 806R。 扩 增 区 域 为 16S rRNA基 因 V3-V4区 。 引 物 序 列 及反 应 条 件 见 附 录 D。7.2 肠 道 微 生 物 16SrRNAPCR扩 增 产 物 电 泳 检 测 及 纯 化 DB53/T 10572021 3 7.2.1 PCR扩 增 完 成 后 ， 取 PCR 产 物 3L， 经 2%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ， 如 电 泳 条 带 清 楚 、 片 段 大 小 正确 ， 表 明 PCR扩 增 成 功 。 不 符 合 质 量 要 求 的 产 物 ， 可 重 新 进 行 PCR扩 增 。 每 个 样 本
14、 进 行 3 个 PCR重 复 ，需 将 3 个 重 复 的 PCR产 物 混 合 ， 以 达 到 测 序 量 。7.2.2 PCR产 物 纯 化 ， 流 程 参 照 商 用 试 剂 盒 纯 化 流 程 。 纯 化 步 骤 见 附 录 D。7.3 肠 道 微 生 物 16SrRNA基 因 测 序16SrRNA基 因 测 序 使 用 高 通 量 测 序 平 台 进 行 。 根 据 所 使 用 的 建 库 试 剂 盒 构 建 文 库 。 根 据 高 通 量 测序 试 剂 盒 和 测 序 仪 操 作 说 明 完 成 试 剂 装 载 ， 设 置 测 序 参 数 进 行 测 序 。7.4 肠 道 微 生
15、 物 宏 基 因 组 测 序宏 基 因 组 测 序 可 使 用 高 通 量 测 序 平 台 进 行 。 根 据 所 使 用 的 建 库 试 剂 盒 构 建 文 库 。 根 据 高 通 量 测 序 试剂 盒 和 测 序 仪 操 作 说 明 完 成 试 剂 装 载 ， 设 置 测 序 参 数 进 行 测 序 。 8 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取8.1 16SrRNA基 因 数 据 质 控16SrRNA基 因 测 序 数 据 ， 通 过 生 物 信 息 学 软 件 进 行 质 控 ， 获 取 16SrRNA基 因 数 据 。 质 控 去 除 双 端引 物 序 列 和 基 因 条 形 码 序
16、 列 ， 过 滤 拼 接 后 序 列 长 度 小 于 400bp的 序 列 ， 可 使 用 QIIME2软 件 “ quality-filter”默 认 设 置 进 行 初 始 质 量 筛 选 ， “ Deblur” 去 除 低 丰 度 序 列 以 及 剪 切 序 列 末 端 ， 统 一 获 得 前 400bp区 段 的高 质 量 序 列 ， 获 得 滇 金 丝 猴 肠 道 微 生 物 16SrRNA基 因 数 据 。8.2 宏 基 因 组 数 据 质 控宏 基 因 组 测 序 数 据 ， 通 过 生 物 信 息 学 软 件 进 行 质 控 。 宏 基 因 组 数 据 质 控 标 准 为 碱
17、基 平 均 质 量 阈 值 高于 20， 最 短 reads长 度 大 于 50bp。8.3 宏 基 因 组 数 据 去 除 宿 主 信 息 使 用 滇 金 丝 猴 全 基 因 组 数 据 作 为 参 考 基 因 组 ， 宏 基 因 组 质 控 数 据 使 用 BWA软 件 的 MEM算 法 默 认 参数 ， 与 滇 金 丝 猴 全 基 因 组 序 列 比 对 ， 去 除 比 对 上 的 序 列 ， 获 取 滇 金 丝 猴 肠 道 微 生 物 宏 基 因 组 数 据 。8.4 肠 道 微 生 物 组 数 据 获 取质 控 后 的 16SrRNA基 因 数 据 以 及 质 控 、 去 除 宿 主
18、 信 息 后 的 宏 基 因 组 数 据 即 为 滇 金 丝 猴 肠 道 微 生 物组 数 据 。 DB53/T 10572021 4 AA附 录 A（ 规 范 性 ）主 要 试 剂 及 仪 器 设 备A.1 主 要 试 剂A.1.1 50 TAE缓 冲 液 (TAE Buffer)： Tris碱 242 g和 57.1 mL冰 醋 酸 ， 用 双 蒸 水 定 容 到 1 L。A.1.2 GeneFinder核 酸 染 料 ， 用 于 凝 胶 成 像 显 示 条 带 。A.1.3 6 上 样 缓 冲 液 （ Loading Buffer） ， 含 有 溴 酚 蓝 ， 用 于 电 泳 和 凝 胶
19、 成 像 。A.1.4 2.5 mM dNTP试 剂 ： dATP、 dCTP、 dGTP和 dTTP的 预 混 溶 液 。 A.1.5 5 PCR Buffer。A.1.6 FastPfu 酶 。A.1.7 无 菌 水 ： ddH2O。A.1.8 琼 脂 糖 。A.1.9 1%琼 脂 糖 凝 胶 ： 用 于 DNA质 量 检 测 。 1 g琼 脂 糖 与 100 mL 1 TAE缓 冲 液 ， 加 热 融 化 均 匀 ， 60 时 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 。A.1.
20、10 2%琼 脂 糖 凝 胶 ： 用 于 PCR产 物 检 测 。 2 g琼 脂 糖 与 100 mL 1 TAE缓 冲 液 ， 加 热 融 化 均 匀 ， 60 时 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 。A.1.11 牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） ： 球 蛋 白 ， PCR反 应 过 程 中 起 到 稳 定 扩 增 酶 、 降 低 PCR抑 制 物 的 作 用 。A.1.12 所 使 用 的 试 剂 盒 中 的 相 关 试 剂 。A.2 仪 器 设 备A.2.1 PCR
21、仪 。 A.2.2 低 温 高 速 离 心 机 。A.2.3 单 道 可 调 移 液 器 （ 2 L， 10 L， 200 L， 1 000 L） 。A.2.4 电 子 天 平 （ 量 程 0.01 mg 10 000 mg） 。A.2.5 水 浴 恒 温 振 荡 器 。A.2.6 普 通 离 心 机 。A.2.7 超 纯 水 器 。A.2.8 高 压 灭 菌 器 。A.2.9 电 泳 仪 。A.2.10 凝 胶 成 像 系 统 。A.2.11 磁 力 搅 拌 器 。A.2.12 超 低 温 冰 箱 （ 80 ） 。A.2.13 低 温 冰 箱 （ 20 ） 。 B DB53/T 105720
22、21 5 附 录 B（ 规 范 性 ）粪 便 样 品 的 采 集 和 保 存 方 法B.1 采 样B.1.1 基 本 要 求采 样 时 ， 应 符 合 实 验 动 物 的 福 利 和 伦 理 的 相 关 要 求 。B.1.2 采 样 工 具 、 标 本 容 器 标 准 以 及 人 员 要 求B.1.2.1 圈 养 滇 金 丝 猴 采 样 工 具记 录 表 格 、 一 次 性 PE手 套 、 封 口 袋 、 5mL塑 料 样 品 管 、 无 水 乙 醇 、 记 号 笔 、 铅 笔 、 标 签 纸 、 剪 刀 、 镊 子 、 注 射 器 、 酒 精 棉 等 。B.1.2.2 野 外 滇 金 丝 猴
23、 采 样 工 具在 B.1.2.1的 基 础 上 ， 增 加 北 斗 定 位 系 统 、 罗 盘 、 地 形 图 等 。B.1.2.3 标 本 容 器 的 标 准盛 粪 便 标 本 的 容 器 应 清 洁 、 干 燥 、 有 盖 ， 无 吸 水 和 渗 漏 。 细 菌 学 检 查 ， 粪 便 标 本 应 采 集 于 灭 菌 、 有盖 的 容 器 内 。B.1.2.4 采 样 人 员 要 求样 本 采 集 人 员 应 是 经 过 专 业 培 训 的 人 员 ， 严 格 穿 戴 个 人 防 护 装 备 。B.2 粪 便 新 鲜 程 度 判 定 以 滇 金 丝 猴 粪 便 表 面 的 完 整 程 度
24、 、 湿 度 颜 色 以 及 气 味 等 条 件 判 断 滇 金 丝 猴 粪 便 的 新 鲜 程 度 。 新 鲜 的粪 便 样 品 表 面 完 整 光 滑 无 杂 质 ， 微 微 湿 润 有 光 泽 感 ， 呈 绿 色 或 深 绿 色 。B.3 粪 便 样 品 的 选 取 原 则B.3.1 采 集 滇 金 丝 猴 新 鲜 粪 便 ， 同 一 堆 粪 便 只 采 集 一 份 样 品 ， 两 堆 样 品 的 距 离 应 大 于 3 m。B.3.2 滇 金 丝 猴 母 幼 粪 便 样 品 ， 应 分 开 采 集 ； 依 据 母 猴 和 幼 猴 的 粪 便 大 小 有 明 显 差 异 作 出 判 断
25、， 并 在备 注 栏 记 录 。B.3.3 采 集 3 g 5 g新 鲜 粪 便 。B.4 样 品 采 集 方 法B.4.1 采 集 粪 便 内 部 的 样 品 ， 并 佩 戴 一 次 性 PE手 套 。 每 次 采 样 时 应 更 换 新 的 PE手 套 ， 以 避 免 样 品 间 的交 叉 污 染 。B.4.2 采 集 时 ， 直 接 剥 取 分 离 新 鲜 粪 便 的 内 部 部 分 ， 分 别 放 入 盛 有 无 水 乙 醇 的 样 品 管 中 ， 拧 紧 盖 子 后 上 下 用 力 摆 动 数 次 ， 使 样 品 得 到 充 分 湿 润 ， 并 检 查 是 否 有 液 体 渗 漏 。
26、 贴 上 样 品 标 签 纸 ， 标 识 样 品 编 号 和坐 标 ， 将 样 品 管 放 入 自 封 袋 ， 并 再 次 写 上 样 品 编 号 ， 以 避 免 无 水 乙 醇 漏 出 导 致 编 号 丢 失 。B.5 样 品 记 录 与 编 号 DB53/T 10572021 6 在 采 集 粪 便 样 品 时 ， 应 填 写 滇 金 丝 猴 粪 便 样 品 采 集 记 录 表 A （ 见 表 B.1） 和 滇 金 丝 猴 粪 便 样品 采 集 记 录 表 B （ 见 表 B.2） 。 记 录 采 样 包 括 样 品 编 号 、 采 集 管 数 、 种 群 、 采 集 地 点 、 采 集
27、日 期 、 采集 人 、 经 纬 度 、 海 拔 、 新 鲜 程 度 、 粪 粒 大 小 等 信 息 。表 B.1 滇 金 丝 猴 粪 便 样 品 采 集 记 录 表 A样 品 编 号 采 集 管 数 种 群 采 集 地 点 采 集 日 期 采 集 人表 B.2 滇 金 丝 猴 粪 便 样 品 采 集 记 录 表 B 样 品 编 号 经 度 纬 度 海 拔 （ m） 新 鲜 程 度 粪 粒 大 小 （ g) 备 注B.6 样 品 的 临 时 保 存野 外 样 品 采 回 后 ， 应 仔 细 检 查 核 对 标 签 和 记 录 ， 并 补 充 无 水 乙 醇 至 样 品 完 全 浸 没 。 无
28、水 乙 醇 中 的 样品 可 以 室 内 常 温 保 存 ； 有 条 件 时 可 进 行 冷 藏 或 冷 冻 保 存 。B.7 样 品 的 运 输 及 验 收B.7.1 运 输 材 料 、 设 备 和 仪 器 B.7.1.1 样 本 容 器 ： 容 器 仅 指 直 接 盛 放 样 本 的 瓶 子 、 管 子 等 小 型 容 器 。B.7.1.2 运 输 设 备 和 器 材 ： 指 车 载 冰 箱 、 冰 盒 、 冰 袋 、 干 冰 。B.7.2 运 输 要 求B.7.2.1 送 样 时 ， 样 品 应 尽 量 使 用 冰 盒 （ 泡 沫 盒 干 冰 冰 袋 ） 盛 装 ， 以 保 证 运 输
29、过 程 中 的 低 温 条 件 。由 于 保 存 DNA的 无 水 乙 醇 是 易 燃 易 爆 的 化 学 品 ， 样 品 应 通 过 专 用 汽 车 运 送 ， 并 注 意 车 内 通 风 ， 车 内 不应 吸 烟 。 运 输 过 程 中 样 品 应 远 离 火 源 ， 避 免 挤 压 。B.7.2.2 填 写 样 本 运 输 纪 录 表 ， 具 体 见 表 B.3。表 B.3 样 本 运 输 记 录 表样 本 编 号 运 输 方 式 货 单 号 样 本 容 器 运 输 设 备 及 器 材 样 本 完 整 性 B.7.3 样 本 验 收B.7.3.1 样 本 接 收 时 ， 应 观 察 样
30、本 容 器 的 外 观 ， 检 查 有 无 破 损 ， 并 记 录 外 观 状 态 。B.7.3.2 查 看 样 本 运 输 纪 录 表 ， 核 对 样 本 数 量 及 运 输 方 式 。B.7.3.3 如 箱 内 有 温 度 记 录 设 备 ， 应 优 先 取 出 核 对 箱 内 温 度 记 录 。 DB53/T 10572021 7 B.7.3.4 样 本 取 出 后 ， 应 立 即 转 移 进 入 预 制 冷 的 低 温 存 储 设 备 中 ， 并 逐 一 登 记 入 库 。B.8 样 本 实 验 室 保 存B.8.1 粪 便 样 本 应 放 于 80 冰 箱 进 行 低 温 保 存 ，
31、 若 条 件 不 允 许 ， 可 短 期 （ 1个 月 内 ） 在 20 冰 箱中 冷 冻 保 存 。 注 意 在 样 本 冻 存 期 间 ， 请 勿 反 复 冻 融 。B.8.2 样 本 的 储 存 容 器 应 有 标 定 的 使 用 温 度 ， 并 能 长 时 间 密 封 储 存 在 80 低 温 环 境 下 。 本 文 件 推 荐使 用 冻 存 管 。 DB53/T 10572021 8 BC附 录 C（ 规 范 性 ）总 DNA样 品 的 提 取 步 骤 、 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 及 成 像 方 法C.1 总 DNA样 品 的 提 取 步 骤本 文 件 选 取 常 用 商
32、 品 试 剂 盒 进 行 总 DNA样 品 的 提 取 ， 可 选 取 其 他 试 剂 盒 进 行 总 DNA提 取 ， 按 试剂 盒 说 明 进 行 提 取 ， 常 用 提 取 步 骤 如 下 （ 若 试 剂 盒 有 特 殊 说 明 则 按 试 剂 盒 说 明 进 行 ） ：a) 添 加 500mg 磁 珠 、 0.5g样 品 和 1mLSLX-MlusBuffer到 2mL离 心 管 中 ， 粉 碎 研 磨 仪 45HZ震 荡 250s； b) 加 入 100LDSBuffer， 颠 倒 混 匀 ；c) 70 孵 育 10min， 95 孵 育 2min；d) 室 温 13000rpm/m
33、in， 离 心 5min；e) 转 移 800L上 清 至 新 的 2mL离 心 管 中 ， 加 入 270LP2Buffer以 及 100LHTRReagent；f) 颠 倒 混 匀 ， 20 孵 育 5min；g) 室 温 13000rpm/min离 心 5min；h) 转 移 上 清 至 新 2mL离 心 管 ， 加 入 等 量 XP5Buffer及 40L磁 珠 ， 上 下 颠 倒 混 匀 8min；i) 磁 力 架 吸 附 ， 弃 去 残 液 ， 取 下 管 子 ， 加 入 500LXP5Buffer， 混 匀 ；j) 磁 力 架 吸 附 ， 弃 去 残 液 ， 取 下 管 子 ，
34、加 入 600LPHB， 混 匀 ；k) 磁 力 架 吸 附 ， 弃 去 残 液 ， 取 下 管 子 ， 加 入 600LSPWWashBuffer， 混 匀 ；l) 磁 力 架 吸 附 ， 弃 去 残 液 ， 取 下 管 子 ， 加 入 600LSPWWashBuffer， 混 匀 ；m) 磁 力 架 吸 附 ， 弃 去 残 液 ， 室 温 13000rpm/min， 离 心 10s；n) 磁 力 架 吸 附 ， 用 移 液 枪 弃 去 残 液 ， 室 温 静 置 8min； o) 加 入 100LElutionBuffer， 混 匀 ， 静 置 5min；p) 磁 力 架 吸 附 ， 转
35、移 上 清 至 新 的 1.5mL离 心 管 ， 得 到 总 DNA。C.2 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 及 成 像 方 法C.2.1 配 制 浓 度 为 1%的 琼 脂 糖 凝 胶 （ 即 1 TAE电 泳 缓 冲 液 100 mL加 1 g琼 脂 糖 ） ， 加 热 融 化 混 匀 ， 冷却 至 60 左 右 ， 加 入 浓 度 为 0.005% Goldenview核 酸 染 料 （ 按 每 100 mL琼 脂 糖 溶 液 中 加 入 5 L核 酸 染料 溶 液 的 比 例 ） ， 混 匀 后 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 配 置 2%琼 脂 糖 凝 胶 需 1 T
36、AE电 泳 缓 冲 液 100 mL加 2g琼 脂 糖 。C.2.2 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 ， 将 琼 脂 糖 凝 胶 和 胶 板 置 于 电 泳 槽中 ， 使 样 本 孔 位 于 电 场 负 极 ， 向 电 泳 槽 中 加 入 1 TAE电 泳 缓 冲 液 。C.2.3 取 3 L DNA， 加 2 L上 样 缓 冲 液 并 混 匀 ， 然 后 依 次 将 DNA分 子 量 标 准 、 检 测 样 品 上 样 到 点 样孔 中 。 电 泳 电 压 为 130 V， 当 上 样 缓 冲 液 中 的 溴 酚 蓝 条
37、 带 迁 移 至 凝 胶 1/2的 位 置 ， 停 止 电 泳 。 最 后 取 出 琼脂 糖 凝 胶 ， 置 于 凝 胶 成 像 仪 成 像 拍 照 、 保 存 。 DB53/T 10572021 9 CD附 录 D（ 规 范 性 ）16SrRNAPCR引 物 、 反 应 体 系 、 反 应 时 间 及 产 物 纯 化 步 骤D.1 PCR反 应 引 物 序 列表 D.1给 出 PCR反 应 引 物 序 列 。 表 D.1 PCR反 应 引 物 序 列 引 物 名 称 序 列338F ACTCCTACGGGAGGCAGCAG806R GGACTACHVGGGTWTCTAATD.2 PCR反 应
38、 体 系可 使 用 多 种 PCR扩 增 酶 进 行 扩 增 ， 本 标 准 使 用 FastPfu酶 。 表 D.2给 出 PCR反 应 体 系 。表 D.2 PCR反 应 体 系 （ 20L）组 分 用 量 （ L）无 菌 水 (ddH 2O) 6.85 PCRBuffer 42.5mMdNTP 2338F(5M) 0.8806R(5M) 0.8Taq 酶 （ 2.5U/L） 0.4牛 血 清 白 蛋 白 （ 20mg/L） 0.2模 板 （ 总 DNA2.0ng/L） 5D.3 PCR反 应 时 间D.3.1 表 D.3给 出 PCR反 应 时 间 。 表 D.3 PCR反 应 时 间
39、温 度 时 间 循 环95 3min 1个 循 环95 30s 27个 循 环55 30s72 45s72 10min 1个 循 环4 1个 循 环D.3.2 PCR反 应 程 序 为 ： 95 预 变 性 3min； 95 变 性 30s， 最 适 退 火 温 度 55 变 性 30s， 72 延 伸 45s， 设 置 27个 循 环 反 应 ， 72 后 延 伸 10min。 DB53/T 10572021 10 D.4 PCR产 物 纯 化 步 骤D.4.1 可 使 用 多 种 试 剂 盒 进 行 PCR产 物 纯 化 ， 本 文 件 使 用 的 试 剂 盒 是 AxyPrep DNA
40、Gel Extraction Kit。D.4.2 在 紫 外 灯 下 切 下 含 有 目 的 DNA的 琼 脂 糖 凝 胶 ， 用 纸 巾 吸 尽 凝 胶 表 面 液 体 并 切 碎 。 计 算 凝 胶 重 量 ，该 重 量 作 为 一 个 凝 胶 体 积 （ 100 mg=100 L体 积 ） 。D.4.3 加 入 3个 凝 胶 体 积 的 Buffer DE-A， 混 合 后 与 75 加 热 ， 间 断 混 合 ， 直 至 凝 胶 完 全 融 化 。D.4.4 加 0.5个 Buffer DE-B， 混 合 均 匀 。D.4.5 吸 取 步 骤 3中 的 混 合 液 ， 转 移 到 DNA制 备
