1、1 ICS 11.220CCS B 41 53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1059.2 2021滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 第 2 部 分 ： 毛 首 线 虫 实验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantine technique for Rhinopithecus bietiPart 2:Technical specifications for laboratory examination of Capillaria 2021 -09- 30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 DB53/T 1059.22021 I 目 次前
2、 言 .III引 言 .1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .15 试 验 原 理 .26 试 验 条 件 .2 6.1 实 验 室 通 用 要 求 .26.2 人 员 要 求 .26.3 生 物 安 全 要 求 .27 仪 器 设 备 和 试 剂 .27.1 主 要 仪 器 设 备 .27.2 主 要 试 剂 .28 样 品 采 集 与 保 存 .39 试 验 步 骤 .39.1 形 态 学 检 测 .39.2 PCR检 测 .310 试 验 数 据 处 理 .3 10.1 虫 卵 检 测 .410.2 虫 体 检 测 .4附 录
3、A （ 规 范 性 ） 粪 样 的 采 集 和 保 存 方 法 . 5附 录 B （ 规 范 性 ） 毛 首 线 虫 的 基 本 形 态 特 征 .7 DB53/T 1059.22021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 是 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 的 第 2部 分 。 DB53/T 1059已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规
4、范 ； 第 2部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 4部 分 ： 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件
5、主 要 起 草 单 位 ： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 、 昆 明 动 物 园 、 云 南 省 动 物 卫 生 监 督 所 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 杨 建 发 、 黄 艳 梅 、 蒙 英 雯 、 朱 勋 程 、 衡 昭 君 、 杨 俊 、 邹 丰 才 、 陈 培 富 、 宋 海 洋 、张 誉 方 、 李 云 乔 、 朱 尤 帅 。 DB53/T 1059.2 2021 引 言滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 是 中 国 特 有 珍 稀 濒 危 灵 长 类 动 物 ， 属 于 国 家 级 重 点 保 护 野 生动 物
6、， 列 入 世 界 自 然 保 护 联 盟 （ IUCN） 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 编 制 并 发 布 DB53/T 1059 滇 金 丝 猴 检疫 技 术 地 方 标 准 ， 推 进 滇 金 丝 猴 疫 病 诊 断 的 标 准 化 和 规 范 化 ， 指 导 从 事 野 生 动 物 保 护 相 关 的 专 业 人 员按 规 范 程 序 实 施 对 滇 金 丝 猴 相 关 病 原 的 实 验 室 检 测 ， 为 滇 金 丝 猴 的 科 学 研 究 和 保 护 工 作 提 供 病 原 或 疫 病调 查 的 基 础 数 据 ， 为 滇 金 丝 猴 检 疫 、 疫 病 监 测 和 防 治
7、 提 供 重 要 的 参 考 依 据 ， 促 进 滇 金 丝 猴 繁 育 和 扩 群 ，维 护 地 区 物 种 与 生 态 平 衡 ， 提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1部 分 ： 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 产 气 荚 膜 梭 菌 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、产 气 荚 膜 梭 菌 分 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 2部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测
8、 技 术 规 范 。 本 部 分 从 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 的 试 验 原 理 、试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 采 集 与 保 存 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 3部 分 ： 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 隐 孢 子 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、 试验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 4部 分 ： 志 贺
9、 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 志 贺 杆 菌 实 验 室 检 测 技 术 涉 及 的 总 则 、 志贺 杆 菌 分 类 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 。 DB53/T 1059.22021 1 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术第 2 部 分 ： 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范1 范 围本 文 件 规 定 了 滇 金 丝 猴 （ Rhinopithecus bieti） 检 疫 技 术 中 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 的 试
10、验 原 理 、试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 采 集 与 保 存 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 滇 金 丝 猴 检 疫 技 术 中 毛 首 线 虫 实 验 室 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件 下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文 件 ，仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修
11、改 单 ） 适 用 于 本文 件 。GB 19489 实 验 室 生 物 安 全 通 用 要 求3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 线 虫 nematodes线 虫 动 物 门 为 假 体 腔 动 物 ， 线 虫 属 通 常 呈 圆 柱 形 ， 线 状 或 毛 发 状 ， 某 些 种 类 呈 鞭 状 或 球 状 。 不 分 节 ，两 侧 对 称 并 具 有 三 胚 层 假 体 腔 ， 一 般 为 雌 雄 异 体 。 虫 体 大 小 随 种 类 不 同 差 别 较 大 ， 雄 虫 一 般 较 雌 虫 小 。寄 生 性 线 虫 最 常 见 寄 生 于
12、 消 化 道 。 3.2 毛 首 线 虫 trichuris毛 首 线 虫 是 滇 金 丝 猴 最 为 常 见 也 是 危 害 最 大 的 消 化 道 线 虫 。 虫 卵 随 滇 金 丝 猴 粪 便 排 到 外 界 ， 在 粪 便和 土 壤 中 发 育 为 感 染 性 虫 卵 ； 经 口 感 染 后 ， 幼 虫 在 小 肠 内 孵 出 ， 钻 入 肠 绒 毛 间 发 育 ， 然 后 移 行 到 盲 肠 和结 肠 内 发 育 为 成 虫 。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。PCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase Chain ReactionTAE：
13、Tris-乙 酸 电 泳 缓 冲 液 Tris Acetate-EDTA BufferDNA： 脱 氧 核 糖 核 酸 Deoxyribonucleic AcidNCBI： 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心 National Center for Biotechnology Information BLAST： 基 于 局 部 序 列 比 对 算 法 的 搜 索 工 具 Basic Local Alignment Search Tool DB53/T 1059.22021 2 5 试 验 原 理镜 检 滇 金 丝 猴 消 化 道 内 的 毛 首 线 虫 虫 卵 或 虫 体 ， 依
14、 据 其 形 态 特 征 鉴 定 病 原 ； 采 用 PCR方 法 开 展 分 子鉴 定 。6 试 验 条 件6.1 实 验 室 通 用 要 求实 验 室 应 满 足 GB 19489的 要 求 。6.2 人 员 要 求采 样 与 试 验 人 员 具 有 相 应 的 专 业 知 识 。 6.3 生 物 安 全 要 求采 样 及 试 验 过 程 中 做 好 自 身 防 护 ， 试 验 结 束 后 的 检 验 器 具 要 进 行 消 毒 处 理 ， 废 弃 样 品 要 及 时 进 行 无害 化 集 中 处 理 。7 仪 器 设 备 和 试 剂7.1 主 要 仪 器 设 备7.1.1 正 置 光 学
15、 显 微 镜 。7.1.2 载 玻 片 及 盖 玻 片 若 干 ， 漏 斗 、 玻 璃 棒 、 烧 杯 。7.1.3 金 属 筛 ： 60目 。7.1.4 PCR扩 增 仪 。7.1.5 高 速 台 式 离 心 机 。 7.1.6 单 道 可 调 移 液 器 （ 量 程 0.5 L 10 L、 2 L 20 L、 10 L 100 L 和 100 L 1000 L） 。7.1.7 电 子 天 平 （ 量 程 0.01 mg 10 000 mg） 。7.1.8 恒 温 水 浴 锅 ： 36 1 ， 65 1 。7.1.9 电 泳 槽 、 电 泳 仪 ， 紫 外 凝 胶 成 像 仪 ， 涡 旋 振
16、 荡 器 。7.2 主 要 试 剂7.2.1 饱 和 食 盐 水 。7.2.2 2.5%重 铬 酸 钾 液 。7.2.3 基 因 组 DNA提 取 试 剂 盒 。7.2.4 2 Taq PCR Master Mix。7.2.5 DL 2000 DNA Marker。7.2.6 无 菌 水 。7.2.7 50 TAE缓 冲 液 ： Tris 碱 242 g 和 57.1 mL冰 醋 酸 ， 用 双 蒸 水 定 容 到 1 L。 7.2.8 核 酸 染 料 ， 用 于 凝 胶 成 像 显 示 条 带 。7.2.9 1%琼 脂 糖 凝 胶 ： 1 g琼 脂 糖 与 100mL 1 TAE缓 冲 液
17、， 加 热 融 化 均 匀 ， 加 入 10 L 核 酸 染 料 ， 60 时 ， 倒 入 胶 槽 ， 插 上 样 品 梳 。 室 温 下 待 凝 胶 凝 固 后 ， 垂 直 向 上 拔 出 固 定 在 凝 胶 中 的 样 品 梳 。 DB53/T 1059.22021 3 8 样 品 采 集 与 保 存粪 样 的 采 集 和 保 存 方 法 见 附 录 A。9 试 验 步 骤9.1 形 态 学 检 测9.1.1 虫 卵 检 测采 用 饱 和 食 盐 水 漂 浮 法 ， 毛 首 线 虫 卵 富 集 在 饱 和 液 表 面 。 取 粪 样 5 g， 加 饱 和 食 盐 水 50 mL， 用 玻
18、璃棒 搅 匀 ， 通 过 60目 金 属 筛 或 双 层 纱 布 过 滤 到 干 净 烧 杯 中 ， 静 置 0.5h； 蘸 取 表 面 液 膜 ， 点 样 于 载 玻 片 上 ，盖 上 盖 玻 片 ， 进 行 镜 检 。 9.1.2 虫 体 检 测用 生 理 盐 水 清 洗 干 净 虫 体 ， 放 于 载 玻 片 ， 滴 加 乳 酸 酚 透 明 液 2 3滴 ， 盖 上 盖 玻 片 ， 在 光 学 显 微 镜 下观 察 透 明 虫 体 的 内 部 形 态 构 造 。 对 于 存 疑 虫 体 ， 结 合 下 述 PCR扩 增 方 法 对 其 进 行 虫 种 鉴 定 。9.2 PCR检 测9.2
19、.1 DNA提 取 和 保 存取 粪 样 ， 用 商 品 化 DNA提 取 试 剂 盒 进 行 DNA提 取 ， 提 取 步 骤 按 照 DNA提 取 试 剂 盒 说 明 书 进 行 。 1周 内 使用 到 的 DNA， 放 置 于 4 冰 箱 中 ； 需 要 长 期 保 存 的 DNA， 放 置 于 -20 冰 箱 中 。9.2.2 PCR扩 增9.2.2.1 PCR扩 增 引 物 针 对 线 虫 线 粒 体 细 胞 色 素 C氧 化 酶 第 一 亚 基 （ COXI） 基 因 设 计 引 物 ， 此 引 物 灵 敏 度 和 特 异 性 较 高 。上 下 游 引 物 序 列 如 下 ：JB3
20、： 5 -TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3 ； JB4.5： 5 -TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3 。9.2.2.2 PCR扩 增 体 系PCR扩 增 体 系 为 25 L， 包 括 2 Taq PCR Master Mix 12.5 L， 无 菌 水 10.5 L， 引 物 JB3和 JB4.5各 0.5 L， DNA模 板 1.0 L。9.2.2.3 PCR扩 增 程 序用 PCR扩 增 仪 设 置 反 应 程 序 ， 94 预 变 性 5min； 94 变 性 30s， 55 退 火 45s， 72 延 伸 1min， 设置 36个 循 环 反
21、应 ， 最 后 72 延 伸 5min， 16 结 束 反 应 ， 同 时 设 阴 性 对 照 和 阳 性 对 照 。9.2.2.4 PCR产 物 检 测 PCR扩 增 完 成 后 ， 取 PCR产 物 5 L， 加 入 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 孔 中 ， 以 DL 2000 DNA Marker作 为 参 照 ，110 V电 压 电 泳 30 min。 将 凝 胶 取 出 放 入 紫 外 凝 胶 成 像 仪 中 观 察 并 拍 照 。 若 出 现 预 期 的 420 bp左 右 的 条带 ， 扩 增 条 带 进 行 测 序 后 验 证 。10 试 验 数 据 处 理 DB53/T 1
22、059.22021 4 10.1 虫 卵 检 测经 饱 和 食 盐 水 漂 浮 法 镜 检 发 现 如 附 录 B中 图 B.1所 示 的 虫 卵 ， 直 接 判 定 为 滇 金 丝 猴 毛 首 线 虫 感 染 阳性 。 若 发 现 存 疑 虫 卵 ， 对 其 进 行 PCR扩 增 后 ， 将 PCR产 物 测 序 结 果 与 NCBI GenBank中 的 序 列 进 行 BLAST在线 比 对 ， 判 定 是 否 为 滇 金 丝 猴 毛 首 线 虫 感 染 阳 性 。10.2 虫 体 检 测对 虫 体 进 行 镜 检 观 察 到 如 附 录 B中 B.2描 述 的 虫 体 ， 直 接 判
23、定 为 滇 金 丝 猴 毛 首 线 虫 感 染 阳 性 。 若 发 现存 疑 虫 体 ， 对 其 进 行 PCR检 测 后 ， 将 PCR产 物 测 序 结 果 与 NCBI GenBank中 的 序 列 进 行 BLAST在 线 比 对 ， 判定 是 否 为 滇 金 丝 猴 毛 首 线 虫 感 染 阳 性 。 AB DB53/T 1059.22021 5 AC附 录 A（ 规 范 性 ）粪 样 的 采 集 和 保 存 方 法A.1 采 样 工 具一 次 性 PE手 套 、 自 封 袋 、 样 品 管 、 记 号 笔 、 标 签 纸 等 。A.2 粪 样 新 鲜 程 度 判 定将 粪 便 样
24、品 放 于 自 封 袋 ， 根 据 粪 便 表 面 的 湿 润 程 度 、 完 整 程 度 以 及 气 味 等 条 件 ， 判 断 粪 便 样 品 的 新 鲜 程 度 并 记 录 。A.3 粪 样 的 选 取 原 则A.3.1 应 采 集 滇 金 丝 猴 新 鲜 粪 样 ， 同 一 堆 粪 样 只 采 集 一 份 样 品 ， 两 堆 样 品 的 距 离 应 大 于 3 m。A.3.2 如 遇 到 滇 金 丝 猴 母 幼 粪 样 应 分 开 采 集 ； 依 据 母 猴 和 幼 猴 的 粪 样 大 小 有 明 显 差 异 作 出 判 断 ， 并 在备 注 栏 记 录 。A.4 样 品 采 集 方
25、法A.4.1 采 集 粪 样 外 部 和 内 部 的 样 品 ， 每 次 采 样 时 应 更 换 新 的 PE手 套 ， 以 避 免 样 品 间 的 交 叉 污 染 。A.4.2 采 集 时 ， 直 接 剥 取 分 离 新 鲜 粪 样 的 表 层 部 分 和 内 部 部 分 ， 分 别 放 入 自 封 袋 ， 贴 上 样 品 标 签 纸 ，写 上 样 品 编 号 ， 将 样 品 管 放 入 自 封 袋 ， 并 再 次 写 上 样 品 编 号 。A.4.3 同 一 堆 粪 样 应 尽 量 多 取 样 品 。 A.5 样 品 记 录 与 编 号在 采 集 粪 样 时 ， 应 填 写 滇 金 丝 猴
26、 粪 样 采 集 记 录 表 （ 见 表 A.1） 。 记 录 采 样 信 息 包 括 样 品 编 号 ，采 集 管 数 ， 内 部 管 数 ， 外 部 管 数 ， 种 群 ， 采 集 地 名 ， 经 纬 度 、 海 拔 ， 新 鲜 程 度 、 采 集 日 期 ， 采 集 人 等 信息 。 表 A.1 滇 金 丝 猴 粪 样 采 集 记 录 表样 品 编 号 采 集 管 数 内 部 管 数 外 部 管 数 种 群 采 集 地 名 经 纬 度 、 海 拔 新 鲜 程 度 采 集 日 期 采 集 人 注 ： 新 鲜 程 度 等 级 ： 新 鲜 、 一 般 、 较 差 。A.6 样 品 的 临 时
27、保 存野 外 样 品 采 回 后 ， 有 条 件 在 4 下 低 温 保 存 ， 直 到 样 品 送 到 相 关 实 验 室 。A.7 样 品 的 运 输 和 实 验 室 保 存 DB53/T 1059.22021 6 野 外 样 品 采 集 完 成 后 ， 应 于 48 h内 送 到 相 关 实 验 室 ， 并 尽 快 进 行 DNA提 取 工 作 。 运 输 过 程 中 应 注 意保 持 低 温 ， 可 将 粪 样 静 置 于 冰 袋 上 ， 用 泡 沫 箱 进 行 保 温 。 DB53/T 1059.22021 7 BD附 录 B（ 规 范 性 ）毛 首 线 虫 的 基 本 形 态 特
28、征B.1 虫 卵 特 征虫 卵 为 棕 黄 色 ， 腰 鼓 形 ， 卵 壳 较 厚 ， 两 端 有 卵 塞 ， 具 体 形 态 特 征 见 图 B.1。 图 B.1 滇 金 丝 猴 毛 首 线 虫 虫 卵 光 学 显 微 镜 镜 检 照 片 （ 100）B.2 虫 体 特 征虫 体 外 观 形 如 鞭 状 ， 也 称 鞭 虫 ， 呈 乳 白 色 。 前 端 细 长 ， 约 占 整 个 虫 体 长 的 2/3， 长 10 mm 50 mm；后 部 粗 短 为 体 部 ， 内 有 生 殖 器 官 和 肠 管 。 雄 虫 尾 部 卷 曲 ； 雌 虫 尾 部 较 直 。E _ DB53/T1059.22021
