1、ICS 11.220CCS B 41云 南 省 地 方 标 准DB53/T 1064.1 2021绿 孔 雀 检 疫 技 术绿 孔 雀 检 疫 技 术第 1部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 Quarantine technique for Pavo muticusPart 1: Technical specifications for laboratory examination ofavian paramyxoviruses 2021 -09- 30发 布 2021- 10-14实 施云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布 53 DB53/T 106
2、4.12021 I 目 次前 言 .III引 言 .I1 范 围 .12 规 范 性 引 用 文 件 .13 术 语 和 定 义 .14 缩 略 语 .25 总 则 .26 仪 器 设 备 和 试 剂 .2 6.1 实 验 室 设 备 .26.2 试 剂 .37 样 品 .37.1 采 样 要 求 与 原 则 .37.2 采 集 工 具 .37.3 样 品 类 型 与 采 样 方 法 .37.4 采 样 登 记 表 的 填 写 .47.5 样 品 的 保 存 和 运 输 .48 试 验 步 骤 .48.1 鸡 胚 接 种 （ 病 毒 分 离 ） .48.2 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验
3、和 血 凝 抑 制 （ HI） 试 验 .48.3 禽 副 黏 病 毒 L 和 M 基 因 的 RT-PCR扩 增 .5 8.4 新 城 疫 病 毒 F 基 因 的 RT-PCR扩 增 及 测 序 分 析 .69 试 验 数 据 处 理 .79.1 HA试 验 结 果 判 定 .79.2 HI试 验 结 果 判 定 .79.3 L和 M基 因 扩 增 结 果 判 定 .79.4 F基 因 扩 增 结 果 及 毒 力 判 定 .7附 录 A （ 规 范 性 ） 试 剂 配 制 .8附 录 B （ 规 范 性 ） 采 样 记 录 表 .10附 录 C （ 规 范 性 ） RT-PCR 引 物 .1
4、1 DB53/T 1064.12021 III 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.1-2020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定 起草 。 本 文 件 DB53/T 1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 的 第 1部 分 。 DB53/T 1064已 经 发 布 了 以 下 部 分 ： 第 1 部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 2 部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第 3 部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规 范 ； 第
5、 4 部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 云 南 省 林 业 与 草 原 局 、 云 南 省 市 场 监 督 管 理 局 共 同 提 出 。 本 文 件 由 云 南 省 林 业 标 准 化 技 术 委 员 会 （ YNTC02） 归 口 。本 文 件 主 要 起 草 单 位 ： 云 南 农 业 大 学 、 云 南 省 标 准 化 研 究 院 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 陈 培 富 、 黄 艳
6、 梅 、 胡 世 享 、 杨 敏 、 卓 娜 、 李 宁 、 钱 丽 敏 、 邹 丰 才 、 何 依 蓉 、 杨建 发 。 DB53/T 1064.12021 引 言绿 孔 雀 （ Pavo muticus） 在 我 国 仅 分 布 于 云 南 ， 是 国 家 级 重 点 保 护 野 生 动 物 ， 也 是 全 球 濒 危 物 种 ，并 已 列 入 濒 危 野 生 动 植 物 种 国 际 贸 易 公 约 (CITES)和 世 界 自 然 保 护 联 盟 濒 危 物 种 红 色 名 录 。 为切 实 贯 彻 中 华 人 民 共 和 国 野 生 动 物 保 护 法 和 中 华 人 民 共 和 国
7、动 物 防 疫 法 ， 编 制 并 发 布 DB53/T 1064 绿 孔 雀 检 疫 技 术 地 方 标 准 ， 可 让 从 事 绿 孔 雀 保 护 的 相 关 人 员 按 标 准 化 和 规 范 化 程 序 开 展 绿 孔 雀 病 原学 诊 断 ， 从 而 采 取 必 要 的 防 治 措 施 ， 以 提 高 染 疫 绿 孔 雀 的 成 活 率 ， 维 护 绿 孔 雀 种 群 健 康 和 地 区 生 态 平 衡 ，提 升 生 物 多 样 性 保 护 成 效 。本 文 件 已 发 布 4个 部 分 ： 第 1 部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分
8、从 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 仪器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 2 部 分 ： 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 禽 流 感 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 的 总 则 、 禽流 感 病 毒 毒 株 的 毒 力 划 分 和 血 清 亚 型 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方面 制 定 了 规 范 ； 第 3 部 分 ： 羽 虱 实 验 室 检 测 技 术 规
9、 范 。 本 部 分 从 羽 虱 实 验 室 检 测 的 原 理 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定 了 规 范 ； 第 4 部 分 ： 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 规 范 。 本 部 分 从 消 化 道 线 虫 实 验 室 检 测 技 术 的 试 验 原 理 、常 见 线 虫 形 态 特 征 、 试 验 条 件 、 仪 器 设 备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 、 试 验 数 据 处 理 等 方 面 制 定了 规 范 。 DB53/T 1064.12021 1 绿
10、孔 雀 检 疫 技 术第 1 部 分 ： 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 规 范重 要 提 示 ： 本 检 测 技 术 规 范 中 ， 氯 仿 有 中 等 毒 性 ， 操 作 时 应 在 通 风 条 件 下 进 行 并 戴 手 套 和 口 罩 ， 不小 心 接 触 皮 肤 应 立 即 冲 洗 ； 凝 胶 电 泳 若 使 用 溴 化 乙 啶 （ EB） 作 核 酸 染 色 剂 ， 操 作 时 应 戴 手 套 和 口 罩 ， 被EB污 染 的 物 品 要 进 行 无 害 化 处 理 ； 操 作 焦 碳 酸 二 乙 酯 （ DEPC） 应 戴 手 套 和 口 罩 并 在 通 风 条
11、件 下 ， 不 小 心接 触 皮 肤 应 立 即 冲 洗 。 由 于 新 城 疫 病 毒 可 引 起 人 一 过 性 结 膜 炎 ， 采 样 及 检 测 人 员 应 佩 戴 口 罩 和 防 护 眼 镜 ，并 采 取 必 要 的 消 毒 措 施 。 本 文 件 中 凡 接 触 病 毒 样 品 的 检 验 器 材 、 废 弃 物 及 其 包 装 物 均 应 做 消 毒 或 灭 菌 无害 化 处 理 ， 以 免 污 染 环 境 或 扩 散 病 毒 。1 范 围 本 文 件 规 定 了 绿 孔 雀 （ Pavo muticus） 检 疫 技 术 中 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 技 术 涉
12、及 的 总 则 、 仪 器 设备 和 试 剂 、 样 品 、 试 验 步 骤 和 试 验 数 据 处 理 。本 文 件 适 用 于 绿 孔 雀 检 疫 技 术 中 禽 副 黏 病 毒 实 验 室 检 测 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 标 注 日 期 的 引 用 文件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 标 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括 所 有 的 修 改 单 ） 适用 于 本 文
13、件 。NY/T 541 兽 医 诊 断 样 品 采 集 、 保 存 与 运 输 技 术 规 范NY/T 1948 兽 医 实 验 室 生 物 安 全 要 求 通 则3 术 语 和 定 义 下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 禽 副 黏 病 毒 avian paramyxoviruses一 类 感 染 家 禽 和 野 禽 的 单 链 负 股 RNA病 毒 ， 属 于 副 黏 病 毒 科 （ Paramyxoviridae） 、 副 黏 病 毒 亚 科（ Paramyxovirinae） 、 禽 腮 腺 炎 病 毒 属 （ Avulavirus） ， 包 括 至 少 禽
14、副 黏 病 毒 19血 清 型 ， 其 中 禽 副 黏 病毒 1型 又 称 作 新 城 疫 病 毒 （ Newcastle disease virus） ， 其 致 病 性 最 受 关 注 。3.2 F 蛋 白 酶 切 位 点 cleavage site of F protein新 城 疫 病 毒 融 合 蛋 白 （ F） 的 F2亚 基 （ 位 于 F氨 基 端 ） 与 F1亚 基 （ 位 于 F羧 基 端 ） 之 间 被 宿 主 细 胞 蛋白 内 切 酶 识 别 的 一 个 短 肽 ， 由 113 117位 氨 基 酸 残 基 组 成 ， 其 中 113 116位 可 能 含 多 个 碱
15、性 氨 基 酸 ， 如精 氨 酸 （ R） 或 赖 氨 酸 （ K） 。3.3 病 毒 血 凝 试 验 viral hemagglutination test DB53/T 1064.12021 2 利 用 有 血 凝 活 性 的 病 毒 与 特 定 动 物 的 红 细 胞 结 合 而 使 红 细 胞 凝 集 （ 即 红 细 胞 不 再 自 然 下 沉 汇 集 ） 的特 性 ， 测 定 病 毒 效 价 即 滴 度 的 方 法 。3.4 病 毒 血 凝 抑 制 试 验 viral hemagglutination inhibition test使 用 抗 体 阻 断 或 抑 制 病 毒 的 血
16、凝 活 性 ， 用 于 测 定 血 清 抗 体 效 价 或 病 毒 种 类 的 一 种 方 法 。4 缩 略 语下 列 缩 略 语 适 用 于 本 文 件 。AMV： 禽 成 髓 细 胞 瘤 病 毒 Avian myeloblastosis viruscDNA： 互 补 DNA complementary DNADEPC： 焦 碳 酸 二 乙 酯 DiethypyrocarbonatedNTP： 脱 氧 核 苷 酸 Deoxyribonucleotide triphosphate EB： 溴 化 乙 啶 Ethidium bromideF： 融 合 蛋 白 Fusion proteinHA：
17、血 凝 HemagglutinationHAU： 血 凝 单 位 Hemagglutination unitHI： 血 凝 抑 制 Hemagglutination inhibitionL： 大 聚 合 酶 蛋 白 Large polymerase proteinM： 基 质 蛋 白 Matrix proteinNDV： 新 城 疫 病 毒 Newcastle disease virusPBS： 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 Phosphate-buffered salinePCR： 聚 合 酶 链 式 反 应 Polymerase chain reactionRBCs： 红 细 胞 Red b
18、lood cellsRNA： 核 糖 核 酸 Ribonucleic acidRT-PCR： 反 转 录 -聚 合 酶 链 式 反 应 Reverse-transcription polymerase chain reaction SPF： 无 特 定 病 原 体 Specific pathogen free5 总 则5.1 采 用 鸡 胚 接 种 方 法 从 绿 孔 雀 检 测 样 品 分 离 禽 副 黏 病 毒 。5.2 取 5.1得 到 的 鸡 胚 尿 囊 液 做 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验 和 血 凝 抑 制 （ HI） 试 验 ， 确 定 分 离 毒 株 的 种 属 和血 清
19、 型 （ 亚 型 ） 。5.3 用 RT-PCR扩 增 分 离 毒 株 的 RNA聚 合 酶 （ L） 基 因 和 基 质 蛋 白 （ M） 基 因 ， 对 禽 副 黏 病 毒 及 其 第 1血 清 型 （ 新 城 疫 病 毒 ） 分 别 做 出 鉴 定 。5.4 对 5.2或 5.3确 定 的 新 城 疫 病 毒 分 离 株 ， 采 取 RT-PCR扩 增 其 融 合 蛋 白 （ F） 基 因 ， 再 做 测 序 分 析 ，对 新 城 疫 病 毒 分 离 株 做 出 毒 力 判 定 。6 仪 器 设 备 和 试 剂 6.1 实 验 室 设 备6.1.1 PCR 仪 ： 温 度 范 围 4.0
20、 99.9 ， 样 品 基 座 配 置 至 少 包 括 单 个 0.2 mL 孔 。 DB53/T 1064.12021 3 6.1.2 凝 胶 成 像 系 统 ： 对 EB 染 色 的 DNA 检 测 灵 敏 度 低 至 0.1 ng； 有 效 像 数 1 3601 024、 10 bit， 数据 线 接 口 USB 2.0。6.1.3 冷 冻 高 速 离 心 机 ： 最 高 离 心 力 20 000 g； 容 量 1.5 mL 12。6.1.4 电 泳 仪 ： 电 压 50 V 120 V， 电 流 10 mA 800 mA， 定 时 0min 999min。6.1.5 电 泳 槽 ： 耐
21、 高 温 、 耐 腐 蚀 、 不 漏 液 ； 缓 冲 液 新 鲜 且 容 量 充 足 。6.1.6 冰 箱 ： 具 有 冷 藏 和 冷 冻 功 能 分 区 （ 20 4 ） 。6.1.7 微 量 移 液 器 ： 单 道 可 调 ， 量 程 0.5 L 10 L、 2 L 20 L、 10 L 100 L 和 100 L 1 000 L。6.1.8 水 浴 锅 ： 温 度 范 围 20 100 。6.1.9 过 滤 器 ： 一 次 性 无 菌 用 品 ， 内 含 孔 径 0.45 m 的 滤 膜 。6.1.10 V 形 孔 血 凝 反 应 板 ： 一 次 性 或 可 重 复 使 用 的 血 凝
22、反 应 板 。6.2 试 剂6.2.1 阿 氏 液 （ Alsevers Solution） ， pH 7.2、 0.01 mol/L 磷 酸 缓 冲 盐 溶 液 （ PBS） 、 1%健 康 未 免 疫 鸡 红 细 胞 悬 液 、 标 准 新 城 疫 病 毒 抗 原 、 阳 性 对 照 血 清 和 阴 性 对 照 血 清 。6.2.2 RNA 提 取 试 剂 盒 、 氯 仿 、 异 丙 醇 、 75%乙 醇 、 1.0%琼 脂 糖 凝 胶 、 50TAE 缓 冲 液 、 10 g/L 溴化 乙 啶 （ EB） 或 其 他 可 替 代 的 核 酸 染 料 、 DNA 分 子 量 标 准 、 2
23、Taq Master Mix、 无 RNA 酶 灭 菌 超 纯 水（ DEPC 处 理 水 ） 、 10扩 增 反 应 缓 冲 液 、 dNTPs、 RNase 抑 制 剂 （ 40 U/L)、 AMV 反 转 录 酶 （ 5 U/L） 、胶 回 收 试 剂 盒 。6.2.3 试 剂 配 制 见 附 录 A。7 样 品7.1 采 样 要 求 与 原 则7.1.1 采 样 应 符 合 NY/T 541 的 要 求 。7.1.2 采 集 的 样 品 具 有 代 表 性 ， 应 从 濒 死 、 死 禽 和 处 于 急 性 发 病 期 的 绿 孔 雀 采 集 样 品 ， 对 暴 发 疫 病 的 群 体
24、 宜 采 集 多 只 发 病 或 死 亡 个 体 的 样 品 ， 采 样 过 程 应 无 菌 操 作 ， 容 器 应 密 封 ， 注 意 避 免 被 污 染 。7.2 采 集 工 具棉 拭 子 、 剪 刀 、 镊 子 、 1.5 mL离 心 管 、 研 钵 等 采 样 工 具 经 121 、 20min高 压 灭 菌 并 烘 干 。7.3 样 品 类 型 与 采 样 方 法7.3.1 组 织 样 品取 病 死 孔 雀 待 检 样 品 ， 采 集 肺 脏 （ 或 气 管 ） 、 脑 、 心 、 肝 、 脾 、 胃 、 肾 等 组 织 各 1份 ， 每 份 不 少 于3 g， 置 于 洁 净 样
25、品 袋 或 平 皿 内 。 将 样 品 封 口 贴 上 标 签 ， 做 好 标 记 。7.3.2 拭 子 样 品7.3.2.1 取 待 检 样 品 ， 采 集 喉 气 管 拭 子 和 泄 殖 腔 拭 子 （ 或 新 鲜 粪 样 ） 各 1 份 ， 将 拭 子 样 品 端 剪 下 或 折 断 ， 分 别 置 于 无 菌 试 管 或 器 皿 中 ， 加 1.0 mL 1.5 mL 含 抗 生 素 的 PBS。 将 样 品 封 口 ， 贴 上 标 签 ， 做 好标 记 。7.3.2.2 抗 生 素 含 量 视 具 体 情 况 而 定 ：a) 对 气 管 拭 子 ， PBS 应 含 青 霉 素 （ 1
26、 000 U/mL） 、 链 霉 素 （ 1 mg/mL） 或 卡 那 霉 素 （ 50 g/mL）和 制 菌 霉 素 （ 1 000 U/mL） ； DB53/T 1064.12021 4 b) 对 泄 殖 腔 拭 子 和 粪 便 PBS， 上 述 抗 生 素 浓 度 应 提 高 至 5 倍 。7.3.3 血 清 样 品采 集 静 脉 血 液 2 mL 3 mL于 无 菌 离 心 管 中 ， 自 然 放 置 析 出 血 清 ， 3 000 r/min离 心 10min， 将 血 清 转移 、 分 装 于 新 的 无 菌 试 管 中 ， 盖 紧 盖 子 ， 封 好 口 ， 贴 上 标 签 。
27、不 同 个 体 的 血 清 样 品 不 能 混 合 。7.3.4 整 只 采 样将 病 死 孔 雀 装 入 封 闭 的 无 毒 塑 料 袋 内 ， 至 少 用 两 层 塑 料 袋 包 装 ， 封 口 并 贴 上 标 签 ， 作 好 标 记 。7.4 采 样 登 记 表 的 填 写填 写 采 样 记 录 表 （ 见 附 录 B） ， 样 品 编 号 应 与 标 签 一 致 ， 随 样 品 送 至 符 合 NY/T 1948要 求 的 实 验 室 。7.5 样 品 的 保 存 和 运 输 7.5.1 样 品 应 置 于 加 干 冰 或 冰 袋 的 保 温 瓶 或 隔 热 泡 沫 盒 中 运 输 ，
28、 也 可 用 液 氮 罐 运 输 ， 保 温 容 器 应 密 封 ，防 止 渗 漏 。 保 温 容 器 外 贴 封 条 ， 封 条 有 贴 封 人 （ 单 位 ） 签 字 或 盖 章 ， 并 注 明 贴 封 日 期 。7.5.2 所 有 样 品 在 4 以 下 运 输 ， 拭 子 样 品 和 组 织 样 品 应 作 暂 时 的 冷 藏 （ 4 ） 或 冷 冻 （ 20 ） 处理 ， 随 即 送 至 实 验 室 。7.5.3 血 清 样 品 宜 单 独 存 放 。 若 24 h 内 可 运 达 实 验 室 ， 在 保 温 箱 内 加 冰 袋 冷 藏 运 输 ； 若 超 过 24 h， 应先 冷
29、冻 ， 其 后 在 保 温 箱 内 加 大 量 冰 袋 运 输 ， 途 中 不 能 超 过 48 h。7.5.4 各 种 样 品 到 达 实 验 室 后 ， 若 暂 时 不 进 行 处 理 ， 则 应 冷 冻 （ 20 以 下 ） 保 存 ， 不 应 反 复 冻 融 。8 试 验 步 骤8.1 鸡 胚 接 种 （ 病 毒 分 离 ）8.1.1 样 品 处 理 将 棉 拭 子 在 PBS中 充 分 混 匀 至 拭 子 上 没 有 肉 眼 可 见 的 样 品 ； 粪 便 、 研 碎 的 组 织 加 样 品 稀 释 液 充 分 研磨 ， 按 照 1 g 组 织 加 10 mL PBS的 比 例 混
30、成 悬 液 。 样 品 液 经 3 000 r/min离 心 10min， 取 上 清 液 用 滤 器 过 滤 ，再 取 滤 过 液 作 为 接 种 材 料 。8.1.2 样 品 接 种取 按 8.1.1处 理 完 毕 的 样 品 ， 以 0.2 mL/胚 的 量 经 尿 囊 腔 途 径 接 种 孵 化 9 d 11 d的 SPF鸡 胚 ， 每 个 样 品接 种 3 5枚 鸡 胚 ， 在 37 孵 化 箱 内 孵 育 ， 每 天 上 午 和 下 午 定 点 观 察 鸡 胚 死 亡 情 况 。 无 菌 收 集 24 h 96 h死 亡 鸡 胚 及 96 h仍 存 活 鸡 胚 的 尿 囊 液 ，
31、用 于 病 毒 血 凝 试 验 以 测 定 有 无 HA活 性 。8.2 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验 和 血 凝 抑 制 （ HI） 试 验8.2.1 病 毒 血 凝 （ HA） 试 验8.2.1.1 在 96 孔 V 型 微 量 反 应 板 ， 每 孔 预 先 加 25 L PBS。 8.2.1.2 向 第 1 孔 加 入 25 L 尿 囊 液 ， 反 复 吹 吸 3 次 5 次 混 匀 。8.2.1.3 从 第 1 孔 吸 取 25 L 溶 液 加 入 第 2 孔 ， 混 匀 后 吸 取 25 L 加 入 第 3 孔 ， 如 此 进 行 2 倍 连 续 稀释 至 第 11 孔 ，
32、从 第 11 孔 吸 取 25 L 溶 液 弃 去 ， 但 第 12 孔 加 入 25 L PBS 或 正 常 尿 囊 液 作 为 阴 性 对 照孔 。 DB53/T 1064.12021 5 8.2.1.4 每 孔 加 入 25 L PBS。8.2.1.5 每 孔 加 入 25 L 1%鸡 红 细 胞 悬 液 。8.2.1.6 轻 轻 振 荡 血 凝 反 应 板 以 混 匀 反 应 体 系 ， 室 温 （ 20 25 ） 静 置 40min， 或 4 静 置 60min，当 阴 性 对 照 孔 的 红 细 胞 在 孔 底 汇 集 成 原 点 时 判 定 结 果 。8.2.2 病 毒 血 凝
33、抑 制 （ HI） 试 验8.2.2.1 在 96 孔 血 凝 反 应 板 ， 每 孔 预 先 加 入 25 L PBS。8.2.2.2 向 第 一 孔 加 入 25 L 血 清 样 品 ， 混 匀 。8.2.2.3 在 血 凝 反 应 板 上 将 血 清 作 横 向 的 2 倍 连 续 稀 释 ， 但 第 12 孔 、 第 13 孔 、 第 14 孔 和 第 15 孔 分别 设 置 为 加 25 L PBS 的 红 细 胞 对 照 孔 、 加 未 做 任 何 免 疫 禽 血 清 的 阴 性 对 照 孔 、 加 禽 流 感 病 毒 抗 体 的 对照 孔 和 加 禽 腺 病 毒 抗 体 的 对
34、照 孔 （ 对 已 确 定 禽 副 黏 病 毒 血 清 型 的 分 离 毒 株 ， 还 可 设 置 阳 性 对 照 孔 ） 。8.2.2.4 每 孔 加 入 25 L 4 HAU 的 病 毒 抗 原 ， 室 温 （ 20 25 ） 静 置 不 少 于 30min， 或 4 静 置 不少 于 60min。 8.2.2.5 每 孔 加 入 25 L 1%RBCs， 轻 轻 振 荡 混 匀 ， 室 温 （ 20 25 ） 静 置 约 40min， 或 4 放 置约 60min， 当 红 细 胞 对 照 孔 呈 显 著 钮 扣 状 时 判 定 结 果 。8.3 禽 副 黏 病 毒 L 和 M 基 因
35、的 RT-PCR 扩 增8.3.1 病 毒 RNA 的 提 取可 用 商 品 化 RNA 提 取 试 剂 盒 提 取 待 检 样 品 （ 棉 拭 子 、 组 织 或 鸡 胚 尿 囊 液 ） 、 阳 性 对 照 样 品 及 阴 性对 照 样 品 的 病 毒 RNA。 也 可 用 RNA 提 取 试 剂 （ 如 Trizol） 提 取 ， 方 法 如 下 ：a) 将 经 过 预 处 理 的 250 L 待 检 样 品 加 入 750 L RNA 提 取 试 剂 （ 如 Trizol） 中 ， 振 荡 2min， 室温 放 置 5min；b) 加 入 250 L氯 仿 ， 在 微 量 振 荡 器 上
36、 振 荡 1min， 室 温 放 置 5min后 ， 4 、 12 000 r/min（ 约 14 000g）离 心 15min；c) 吸 取 上 层 水 相 转 入 一 新 的 离 心 管 中 ， 加 入 等 量 的 异 丙 醇 ， 混 匀 ， 室 温 放 置 15min， 4 、 12 000 r/min（ 约 14 000g） 离 心 15min；d) 小 心 吸 弃 上 清 ， 加 入 DEPC 处 理 的 75 %乙 醇 750 L， 4 、 12 000 r/min （ 约 14 000g） 离 心5min；e) 小 心 吸 弃 上 清 ， 将 沉 淀 自 然 风 干 或 于 50 干 燥 箱 中 晾 干 ， 加 适 量 的 DEPC 处 理 水 溶 解 ；f) 取 5 L 提 取 物 与 1 L 6核 酸 上 样 缓 冲 液 混 匀 ， 做 1%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 查 RNA 提 取 效 果 ，对 组 织 样 品 观 测 到 28S、 18S 及 5.8S rRNA 三 个 条 带 或 至 少 前 两 个 条 带 ， 提 示 RNA 提 取 合 格 ；g) 提 取 的 RNA 应 在 2 h 内 进 行 RT 或 RT-PCR 扩 增 ， 若 需 长 期 保 存 RNA， 应 置 于 80 冰 箱 或液 氮 内 。8.3.2 RT-PCR扩 增
