1、 ICS 65.020.20 CCS B 21 46 海南省 地方 标准 DB 46/T 536 2021 西番莲 (百 香果 )种苗 病毒检测技术规程 Technical regulations of detection for virus in passionfruit seedling 2021 - 08 - 02发布 2021 - 09 - 01实施 海南省 市场监督管理局 发 布 DB 46/T 536 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构
2、不承担识别这些专利的责任 。 本文件由 海南省农业农村厅提出并归口 。 本文件起草单位： 中国热带农业科学院热带生物技术研究所、农业农村部热带作物种子种苗质量监 督检验测试中心 。 本文件主要起草人： 王健华、 应东山、 尹慧祥、余乃通、刘志昕、 王军、 王辉 。 DB 46/T 536 2021 II 引言 西 番莲（百香果） 容易 被 多 种植物病毒 侵 染，以 马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus）为 主 ， 该属 侵 染西番 莲的 常见病毒有 东亚 西 番莲病毒（ East Asian passiflora virus， EAPV） 、西 番莲斑驳病毒（ Passion fruit
3、mottle virus， PaMV） 、西 番莲木质化病毒（ Passion fruit woodiness virus， PWV） 、夜 来香 花叶病毒 （ Telosma mosaic virus， TeMV） 等 。 为 提 高 检测效率， 简 化检测 流 程 ， 本 文件 不 针对 单个 种 进 行 逐一 检测，而 拟 采 用属 的通 用 检测 方法 ， 以 马铃薯 Y病毒属 （ Potyvirus） 为检测 对象， 同 时检出该属 内 的多种病毒 ， 以 期 满足 西番莲种苗生产 和 调运过程中 的 病毒 检测 基 本 需 求。 DB 46/T 536 2021 1 西番莲 (百香
4、果 )种苗病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了西番莲（ Passiflora sp.）种苗病毒检测的术语和定义、检测对象、抽样方法、检测 方法 、 质量要求和处理办法 。 本文件适用于西番莲 种苗 生产 及 调运过程中的病毒检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 401 2000 脱毒马铃薯种薯（苗）病毒检测技术规程 NY/T 3179 2018 甘蔗 脱毒种苗检测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义
5、适用于本文件。 3.1 原种 elit 用来 繁育 采穗母株 、且 未 检 出 本文件规定的检测对象 的 西番莲种苗 。 3.2 采穗 母 株 spike picking plant 用原种作种苗，在防虫网室、温室等严格隔离条件下保存或扩繁，专门为生产西番莲种苗提供嫁接 接穗和扦插枝条的西番莲植株 。 3.3 带 毒率 virus-carrying rate 西番莲 种 苗 中受 病毒侵染 的 植 株的比率。 3.4 病毒病显症率 virus-symptom rate 西番莲 种 苗 中 出现病毒病症状 的 植 株的比率 。 4 检测 对象 马铃薯 Y病毒属（ Potyvirus）。 DB 4
6、6/T 536 2021 2 5 抽样方法 5.1 原种 每株必检，每 3个月进行病毒检测 1次。 5.2 采穗 母株 采 穗圃 每半年检测 1次，每株一年内至少被抽检 1次。 5.3 商品 苗 同一批生产批次或同一调运批次的种苗为同一检验批。采用随机抽样方法 ,按同一检验批不小于 0.5% 的比例抽样，最低抽样数量为 20株 。 6 检测 方法 6.1 试纸条 检测法 6.1.1 适用情形 种苗生产 和 调运过程中 需要 在 现场快速 获 知 病毒 检测 结果 的情 形 。 6.1.2 采 样 方法及 样 品 保存 每 株 取淡 绿期 展 开 叶 片 1张 ， 单独 放 到 封 口 塑料 采
7、 样袋 里，挤 掉 袋 内 空气 ， 密封后 妥善 保存 。 样品 在 2 8 条件 下保存 ，保存期 不应超过 3 d； 若 需长期保存，需 放 置 -80 冰箱， 且 避免反复冻 融。 6.1.3 操作 方法 用 马铃薯 Y病毒 属的 通 用 检测试 纸条 进 行 现场 快速检测 。 具体操作方法 按 产品说明 执行 。 6.1.4 结果 判定 试纸 条 远 液端控制线 位置 出 现反应 条 带 时， 检测 结果方可信。 试纸 条插入反应液中 20 min左右 检测 线 位置 出现反应 条带的，样品 判定 为 Potyvirus阳性 ，未 出现反应 条带的，判定 为阴性。 6.2 酶联免疫
8、 吸附测定 （ ELISA）法 6.2.1 适用情形 样品数量较 多 （ 一般 40份以上 ），宜 用 ELISA检测 法 。适用 于 检测 采穗母株 。 6.2.2 采 样 方法及 样 品 保存 按 照 6.1.2给出 的要求执行。 6.2.3 操作 方法 用 马铃薯 Y病毒 属 的通用抗血清进行 ELISA检测。 用已知含 马铃薯 Y病毒 属 的西番莲样品做阳性对照 ， 用已知不含 马铃薯 Y病毒 属 的西番莲样品 做 阴性对照 ， 用无菌 水 替代样品做空白对照。 操作方法 按 NY/T 401 2000的附录 A规定 执行 。 6.2.4 结果 判定 DB 46/T 536 2021
9、3 阳 性 对照、 阴 性对照 和空白对照的检测结果均 与 预期相符时， 检测 结果 方可信。 被 检样品与阴性对 照之间的 OD405值比值 2时，样品判定为 Potyvirus阳性，比值 2时 ， 判定 为阴性。 6.3 逆 转录 聚 合酶链式反应（ RT-PCR）法 6.3.1 适用情形 检测样品数量较少（ 一般 少于 10份）、且对检测 精 度要求较高 时 ，宜用 RT-PCR检测 法 。 适用 于 检测 西 番莲 原种 。 6.3.2 采 样 方法及 样 品 保存 按 照 6.1.2给出 的要求执行。 6.3.3 操作 方法 用 马铃薯 Y病毒 属 通用引物进行 RT-PCR检测，其
10、中上游引物： 5-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3，下 游引物： 5-AYYTGYTYMTCHCCATCCATC-3，退火温度 45 ，目标片段： 680 bp。用含目标病毒扩增片段 的质粒做阳性对照 ， 用不含目标病毒扩增片段的质 粒 做阴性对照 ， 用无菌 水 替代样品做空白对照。 操作 方法 按 NY/T 3179 2018的附录 C规定执行。 6.3.4 结果 判定 阳 性 对照、 阴 性对照和空白对照的检测结果均 与 预期相符时， 检测 结果 方可信。 被检样 品电泳泳道 出现 约 680 bp大 小 的电泳条带， 样品判定为 Potyvirus阳性 ，否 则 判定
11、为阴性。 6.4 目测检查 6.4.1 适用情形 用 做 判断种 苗 是 否 带 毒的辅助手段， 可 做 为 种苗 生产 过程 中预防 病毒 病 、提高种苗质量的 日常 性 管 理措施 。 6.4.2 操作 方法 对抽 检 的西 番莲 种 苗 进 行 病毒 病目 测 检查， 西 番莲病毒 病 常见症状参 见 附录 A。 按 公 式（ 1） 计算病 毒 病显 症率 。 （ 1） 式 中， a 病毒 病 显 症 率 ， 以百分率表示， 结果 保留一位小数 ； v 出现疑似 病 毒 病 症状 的 样 品 数量 ， 单位为株 ； t 种 苗 样 品 总 数量 ， 单位为株 。 6.5 检测 记录 与检
12、测 报告 检测 应留 存试纸 条 显 色 结果照片 、酶 联板 的 OD405读 数 、凝 胶 电泳 图 、 病毒病症状图 等 原始 关键数据。 检测报告应 明确 以 阴性或阳性 标 明各 被 检样品的检测结果 ， 并 按 公 式 （ 2） 计算样 品的带毒率 。 （ 2） 式 中， DB 46/T 536 2021 4 b 带 毒率 ， 以百 分 率表示， 结果 保留一位小数 ； p 出现阳 性检测结果的 样 品数量 ， 单位 为株 ； t 种 苗 样 品 总 数量 ， 单位为株 。 7 质量 要求 西番莲种苗 质量 要求见表 1。 表 1 种 苗质量要求 项 目 原种 采 穗母株 商品苗
13、病毒 病 显 症 率 （ %） 0 2.0 5.0 带毒 率（ %） 0 0 3.0 8 处理 办法 出现 病毒 病 症状或检测为阳性的 原 种 和 采 穗 母株 ， 立即拔除 并 进行无害化处理 。 经 过 1次 无 害化处 理的 原 种 和 采 穗 母株 ， 按本 文件 规定 的 抽样 方法 进 行 第 2次检测 ， 仍未能达到 表 1要求的，不 可 再 用 于 繁 育 种 苗 。 病毒 病显症 率 和带毒率 未 能达到表 1要求的 商 品苗 ，可判定为不合格 。 DB 46/T 536 2021 5 附录 A （资料性） 西番莲 （百 香果） 常见病毒病症状 表 A.1给 出了 西 番莲（百香果） 常见 病毒病 的 症状 类型 、特 征 描述和图 示 。 表 A.1 西番莲（百 香果） 常见病毒病症状 症状 类型 特 征描述 症状 图示 花 叶 由形状不规则的深绿、浅绿、黄绿而形成的不规则杂色，不 同颜色部位的轮廓清楚 斑 驳 由形状不规则的深绿、浅绿、黄绿而形成的不规则杂色，但 变色部位的轮廓不清楚 畸形 植物整株或局部的形态异常， 常见的有矮化和矮缩，叶片的畸形主要表现为叶片变小、叶缺和叶面高低不平的皱缩 蚀纹 叶片表皮细胞死亡所形成的各种斑纹现象 _
