1、 ICS 11.220 CCS B 42 DB42 湖北省 地方 标准 DB42/T 1679 2021 副猪嗜血杆菌对替米考星的敏感性检测 Susceptibility test of Glaesserella parasuis to tilmicosin 2021-05-12 发布 2021-07-12 实施 湖北省市场监督管理 局 发 布 DB42/T 1679 2021 I 目 次 前言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 仪器和设备 . 1 5 试剂或材料 . 1 6 细菌分离培养和鉴定 . 2 7 体外敏感性检测 . 2 8 质控菌
2、和质控药 . 3 9 结果判定 . 3 附录 A（资料性） 微量肉汤稀释法 96 微孔板加样操作示意图 . 4 DB42/T 1679 2021 III 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：华中农业大学、武汉科维安检测科技有限公司。 本文件主要起草人：郝海红、袁宗辉、赵俊龙、黄玲利、王玉莲、陈冬梅、陶燕飞、彭大鹏、王旭、 潘源虎、贺兰、谢书宇、程古月、瞿玮、蔡
3、旭旺、徐小娟、张朋。 本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话： 027-87665821， 邮箱 ； 本文件的有关修改意见建议请反馈至 华中农业大学动物科技 -动物医学学院 ，联系电 话 027-87287140-8115，邮箱： 。 DB42/T 1679 2021 1 副猪嗜血杆菌对替米考星的敏感性检测 1 范围 本文件规定了副猪嗜血杆菌对替米考星的体外敏感性检测方法。 本文件适用于检测和判断兽医临床分离的副猪嗜血杆菌对替米考星的敏感性，合理应用替米考星 治疗副猪嗜血杆菌感染。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日
4、期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 34750 副猪嗜血杆菌 检测方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 仪器和设备 冰箱： 2 4 和 -20 。 恒温培养箱： 37 1 。 电子天平：感量 0.00001 g， 0.001 g， 0.1 g。 微量加样器： 1 L 1000 L。 显微镜。 台式冷冻离心机。 细菌多位点接种仪。 生物安全柜： II 级及以上。 5 试剂或材料 替米考星标准品 。 无支原体胎牛血清。 无菌 96 孔微孔板 ： 带盖。 微孔滤膜： 0.22 m。 无菌加
5、样槽 。 麦氏比浊管 ： 0.5 麦氏浊度 。 1%辅酶 I(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸， NAD):准确称取 0.01 g NAD， 用灭菌去离子水溶解并定容至 10 mL， 0.22 m 滤膜过滤 ， 配 制 成 1% NAD。 胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA)培养基 : 准确称取胰蛋白胨大豆琼脂 8 g，加 188 mL 去离子水，摇匀 ,121 高压灭 菌 15 min，冷至 45 左右 ， 加入 10 mL 无支原体胎牛血清和 2 mL 1%NAD，混匀 ，配 制 成 200 mL DB42/T 1679 2021 2 TSA 培养基。 生物安全柜 中，取 20 mL倾入无菌平皿， 晾干 。
6、4 保存备用。 其他 体积 TSA 培养基 可 按 此 比例 调整 配 制 。 胰 蛋白胨大豆肉汤 (TSB)培养基 : 准确称取胰蛋白胨大豆肉汤 6 g，加 188 mL 去离子水，摇匀 ， 121 高压灭菌 15 min，冷至 45 左右时加入 10 mL 无支原体胎牛血清和 2 mL 1% NAD， 配 制 成 200 mL TSB 培养基 。 现配 现 用。 其他 体积 TSB 培养基 ，可 按此比例 调整 配 制 。 替米考星标准储备液 : 按替米考星标准品纯度和比例准确称取替米考星标准品，放置于 10 mL 容量 瓶中，添加甲醇并定容至 10 mL， -20 避光保存。推荐替米考星
7、储备液的范围为 256 g/mL 2560 g/mL。 6 细菌分离培养和鉴定 副猪嗜血杆菌的分离、鉴定和检测 按照 GB/T 34750确定的方法和流程。 7 体外敏感性检测 方法选择说明 副猪嗜血杆菌对替米考星的 敏感性 试验方法 :琼脂稀释法（ 参见本文件 7.2）和微量肉汤稀释法（ 参 见本文件 7.3） 。 操作时任选其一 即可 。 琼脂稀释 法 7.2.1 菌悬液制备 细菌复苏 于 TSA培养基中 ， 传代 二 次，挑 取 单菌落至 TSB肉汤 ， 振荡培养 16 h 24 h至对数生长期。 将菌液用 TSB肉汤稀释至 0.5麦氏浊度 ，菌液浓度约为 110 8 CFU/mL。 用
8、 TSB肉汤进行 10倍稀释，使细菌 浓度达到 110 7 CFU/mL。 7.2.2 替米考星的倍比稀释 将 2560 g/mL替米考星 标准 储 备 液 ， 用 TSB肉汤依次 两倍系列 稀释为 0.62 g/mL 1280 g/mL， 配制 成含 12个浓度梯度 的倍比稀释液 。 7.2.3 含药 TSA 平板的制备 取 18 mL灭菌未凝固 TSA培养基， 冷却至 45 左右 ，加 1 mL无 支原体 胎牛血清 （ 5%）、 200 L NAD（ 1%） 和 2 mL替米考星倍比稀释液（参见本文件 7.2.2）， 涡旋混匀，倾入培养皿， 制备成替米考星 TSA平板， 晾干 后置于 -4
9、 备用。 7.2.4 替米考星 TSA 平板浓度范围 替米考星 TSA平板浓度范围为 0.06 g/mL 128 g/mL，含 12个浓度梯度 。 根据临床条件，替米考星 TSA平板的浓度范围可适当缩小至 0.06 g/mL 32 g/mL，含 10个浓度梯度。 7.2.5 药敏试验细菌点样 在生物安全柜 中 ，吸取 1 mL菌悬液（浓度为 110 7 CFU/mL）至细菌多位点接种仪 中；将 接种仪的 点 样针置于点样孔中，蘸取 1 L 2 L菌悬液，使平板上的点菌量在 104 CFU 105 CFU, 于 37 、 5% CO2培 养箱中培养 24 h 32 h。 DB42/T 1679
10、2021 3 7.2.6 最小抑菌浓度（ MIC）结果记录 确定无菌无药 平板中无菌生长 ，含菌无药 平板中菌株生长 。以替米考星含药平板上 无细菌生长的最 低 药物浓度为 其 MIC。 微量肉汤稀释法 7.3.1 菌悬液制备 采用 7.2.1的方法制备菌悬液 ， 用 TSB肉汤稀释，制备 105 CFU/mL菌悬液。 7.3.2 替米考星浓度稀释 微孔板每孔加 TSB 100 L。 A-F排第一孔加 256 g/mL替米考星储备液（参见本文件 5.10） 100 L，移 液 器 吹打混匀 ；从第一孔 吸取 100 L加入第二孔 ， 移液 器 吹打混匀 ；以此 重复进行二倍稀释 ， 直至第 1
11、2 列 最后一孔， 吸出 100 L弃 掉。 操作示意图见附录 A。 7.3.3 加菌液 微孔板 A-C三排 每孔加 同一株菌的 菌 悬 液 （参见本文件 7.3.1） 100 L，即同一株菌设 3个平行 重复。 D-F三排加另一株菌的菌悬液。 G排 每孔加 200 L TSB肉汤，作为 阴性对照 ； H排 每孔加 100 L菌液 和 100 L TSB肉汤，作为 阳性对照。 微 孔板 于 37 、 5% CO2培养箱中 培养 18 h 24 h。 操作示意图见附录 A。 7.3.4 微孔板中替米考星浓度范围 微孔板中替米考星浓度范围是 0.03 g/mL 64 g/mL，含 12个倍比浓度梯
12、度 。 据临床条件， 替米考 星浓度范围可适当缩小至 0.06 g/mL 32 g/mL，含 10个浓度梯度。 7.3.5 最小抑菌浓度（ MIC）结果记录 确定无菌 无药孔 中无菌生长 ，无药 含菌对照 孔 中菌株生长。 以孔内 无 细菌生长的最低药物浓度为 MIC。当出现单一跳孔时， 需 记录抑制细菌生长的最高药物浓度；当出现多处跳孔，需重复试验。 8 质控菌和质控药 粪肠球菌 ATCC 29212为药敏试验质控菌。替米考星为药敏试验质控药。 粪肠球菌 ATCC 29212对替米 考星的最小抑菌浓度（ MIC）的质控范围为 8 g/mL 32 g/mL。 每次 药敏试验 需保证质控 药 对
13、质控菌的 MIC在质控范围中。 9 结果判定 副猪嗜血杆菌对替米考星 的 敏感性 和耐药性 折点 宜 为 1 g/mL和 16 g/mL。 当体外敏感性实验测定的替米考星对临床副猪嗜血杆菌的 MIC 1 g/mL时，该菌对替米考星敏感 ， 结果记录为 S； 当 MIC 1 6 g/mL时，该菌对替米考星耐药 ，结果记录为 R；当 MIC在 1 g/mL 16 g/mL之 间，则为非敏感中介状态 ，结果记录为 I。 DB42/T 1679 2021 4 A A 附录 A （资料性） 微量肉汤稀释法 96 微孔板加样操作示意图 图 A.1 给出了微量肉汤稀释法 中， 在 96微孔板 中倍比稀释替米考星和添加菌悬液的操作方法 。 图 A.1 微量肉汤稀释法 96 微孔板加样操作示意图
