1、 1 ICS 67.080.20 B 31 DB36 江西省地方标准 DB36/T 1395-2021 植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定 液相色谱 -串联质谱法 Determination of the content of hypericin in dried flowers and leaves of plants HPLC-MS/MS method 2021 - 04 - 23 发布 2021 - 11 - 01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 1395-2021 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 原理 . 1 4 试剂和材
2、料 . 1 5 仪器和设备 . 2 6 试样制备与保存 . 2 7 测定步骤 . 2 8 结果与计算 . 3 9 方法灵敏度、准确度和精密度 .4 附录 A（资料性） 丝桃苷标准溶液定量离子色谱图 .5 DB36/T 1395-2021 II 前 言 本文件是按照 GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本 文件 由 江西省农业农村厅 提出 并归口。 本 文件 起草单位 ：江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所 。 本 文件 主要起草人 ：胡丽芳、周军、周瑶
3、敏、徐俊、管珊红、范芳、聂根新、陈庆隆、张金艳。 DB36/T 1395-2021 1 植物干花和干叶中金丝桃苷含量的测定 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本文件规定了植物干花和干叶中金丝桃苷含量的液相色谱 -串联质谱测定方法。 本 文件 适用于 罗布麻、黄蜀葵、金花葵、金丝桃、玫瑰、金银花和贯叶连翘干花或干叶中金丝桃苷 含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规 格 和试
4、验方法 3 原理 试样 中金丝桃苷用 80%乙腈溶液超声 提取 ， 提取液浓缩 定容 后 ， 液相色谱 -串联质谱 测定 ， 外标法 定量 。 4 试剂和材料 除非另有规定 ， 以下试剂均为分析纯。 水 应 符合 GB/T 6682规定的 一 级水 要求。 4.1 甲醇： 色谱纯 。 4.2 乙腈： 色谱纯 。 4.3 氯化钠 :140烘烤 4 h。 4.4 10%甲醇溶液：量取 100 mL 甲醇，用水定容至 1000 mL。 4.5 80%乙腈溶液：量取 800 mL 乙腈，用水定容至 1000 mL。 4.6 标准品：金丝桃苷（ CAS 号： 482-36-0）含量 98%。 4.7 标
5、准储备液（ 1 mg/mL）：准确称取金丝桃苷标准品约 10 mg，于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并 稀释至刻度，配制成浓度为 1 mg/mL 的金丝桃苷标准储备液。于 -18 下保存，有效期 6 个月。 4.8 标准中间液（ 10 mg/L）：准确吸取上述标准储 备液 1 mL，于 100 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀 释至刻度，配制成浓度为 10 mg/L 的金丝桃苷标准中间液。于 4C 下保存，有效期 3 个月。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱 -串联质谱：配电喷雾离子源 。 5.2 分析天平：感量 0.00001 g 和 0.01 g。 5.3 超声清洗仪。 DB36/T 1
6、395-2021 2 5.4 离心机：转速不低于 5000 r/min。 5.5 氮吹仪。 5.6 微孔滤膜 ： 有机 相， 0.22 m。 6 试样制备与保存 将 罗布麻、黄蜀葵、金花葵、金丝桃、玫瑰、金银花和贯叶连翘七 种中草药研磨成细粉，样品全部 过 425 m 的标准网筛，混匀，制备好的试样均分成两份，装入清洁容器内，密封后 保存在干燥器中。 7 测定步骤 7.1 提取、净化 分别准确称取植物干叶或干花粉末两份平行试料各 1.00 g，加入 10 mL80%乙腈溶液 （ 4.5)于 50 mL 离心管中，加入氯化钠 2g,超声提取 30 min， 5000 r/min离心 5 min，
7、上清液转入另一个 50 mL离心管中， 残渣再加入 10 mL80%乙腈溶液 （ 4.5)，重复提取一次，合并上清液，于 60 下氮气吹至近干，用 10% 甲醇溶液 （ 4.4)定容至 1.0 mL，经 0.22 m滤膜过滤后，液相色谱 -串联质谱仪测定。 7.2 测定 7.2.1 液相色谱参考条件 如下： a） 色谱柱： C18 (100 mm 2.1 mm， 1.8 m)，或性能相当者 ； b） 流动相： A： 纯水， B： 甲醇， 梯度洗脱，洗脱条件见表 1； c） 流速 ： 0.25 mL/min； d） 进样量： 5.0 L。 表 1 液相色谱梯度洗脱参考条件 时间， min A，
8、% B， % 0 90 10 0.5 90 10 5.0 10 90 5.8 10 90 6.0 90 10 8.0 90 10 7.2.2 质谱参考条件 如下： a） 扫描方式：负离子扫描 （ ESI -)。 b） 离子源：电喷雾离子源。 c） 毛细管电压： 3000 V。 d）干燥气温度： 150 。 e）干燥气流量： 14 L/min。 f）雾化气压力： 35 psi。 g）鞘气温度： 300 。 h）鞘气流量： 11 L/min。 i）检测方式：多反应监测（ MRM），监测条件见表 2。 DB36/T 1395-2021 3 表 2 MRM监测模式下金丝桃苷质谱参考条件 7.3 标准曲
9、线绘制 准确量取金丝桃苷标准中间液适量，用甲醇溶液 （ 4.4)稀释配制成金丝桃苷浓度为 50 g/L、 100 g/L、 150 g/L、 200 g/L 、 400 g/L和 500 g/L的系列标准溶液，临用现配，供液相色谱 -串联质谱测 定。以目标物定量离子峰面积为纵坐标，目标物质标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。 7.4 定性测定 通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、各色谱峰的特征离子与相应浓度标 准溶液 各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于 2.5%；试样特征离子的相 对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表 3的
10、规定，则可判断试样中存在金 丝桃苷成分。 表 3 定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 50 % 20 % 50 % 10 % 20 % 10 % 允许的相对偏差 20 % 25 % 30 % 50 % 7.5 定量测定 采用标准曲线校准，外标法定量，标准溶液及试样溶液中金丝桃苷 响应值均应在仪器检测的线性范 围内。在上述 色谱 -质谱条件下， 金丝桃苷标准溶液定量 离子色谱图 参见附录 A。 7.6 试剂空白试验 除不加试样外，均按上述测定步骤进行。 8 结果计算 试样中金丝桃苷含量按式 (1)计算： 10001000 mVX （ 1） 式中： X 试样中金丝桃苷的含量，单位为
11、 微克每千克 (g/kg)； 标准曲线计算出试样提取溶液中金丝桃苷的浓度 ，单位为 微克每 升 (g/L)； V 样液最终定容体积 (mL)； m 所取试样的量，单位为克 (g)。 注： 计算结果保留三位有效数字。 化合物 母离子， m/z 子离子， m/z 碎裂电压， V 碰撞能量， eV 金丝桃苷 463 299.9* 130 22 270.8 120 36 254.9 120 36 注： *为定量离子。 DB36/T 1395-2021 4 9 方法灵敏度、准确度和精密度 9.1 灵敏度 本方法检测限 为 20 g/kg。 本方法 定量限 为 60 g/kg。 9.2 准确度 本方法在 60 g/kg500 g/kg 添加浓度水平上的回收率为 80%110%。 9.3 精密度 在重复性条件下， 2 次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算数平均值的 15%。 DB36/T 1395-2021 5 附 录 A （资料性） 金丝桃苷标准溶液定量离子色谱图 图 A.1 金丝桃苷标标准溶液 （ 50.0 g/L） 定量离子色谱图 _
