1、 ICS 65.020 CCS B 33 35 福建省地方标准 DB35/T 1993 2021 果蔗脱毒种苗质量与技术 Quality and technical requirements for pathogen-free plant of chewing cane 2021 - 08 - 17 发布 2021 - 11 - 17 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 1993 2021 I 目次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2 规范性引 用文件 . . 1 3 术语和定 义 . . 1 4 种苗脱毒 与繁殖 . . 2 5 质量要求 . . 2 6 有害生物 检测
2、对象 . . 4 7 检测方法 . . 5 8 抽样 . . 9 9 包装、标 签、存储及运输 . . 9 DB35/T 19932021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心、农业农村部甘蔗及制品质量监督检验 测试中心、福建省标准化研究院。 本文件主要起草人：高三基、傅华英、黄美婷、郑海梅、黄国强、王锦达、张慧丽、邓祖湖。 DB35/T 1993 20
3、21 1 果蔗脱毒种苗质量与技术 1 范围 本文件规定了果蔗种苗脱毒与繁殖、 质量要求、 有害生物检测对象、 检测方法、 抽样和包装、 标签、 存储及运输。 本文件适用于福建省内果蔗脱毒种苗的繁殖与质量检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1488 农作物种质资源鉴定技术规程 甘蔗 NY/T 1796 甘蔗种苗 NY/T 2724 甘蔗脱毒种苗生产技术规程 NY/T 3172 甘蔗种苗脱毒技术规范 NY
4、/T 3754 甘蔗品种真实性鉴定 SSR分子标记法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 瓶苗 bottle plantlet 将果蔗茎尖和腋芽的顶端分生组织作为外植体，在无菌操作条件下接种于无菌培养基上，并在一定 的光照和温度条件下进行培养，经过丛芽增殖和壮苗继代培养、诱导生根等过程，最终发育成根、茎、 叶俱全的果蔗植株种苗。 3.2 穴盘苗 plug p lantlet 将瓶苗假植于装有营养土的塑料穴盘或育苗袋中，并置于具有防虫网（适宜目数为4060目）隔离 条件下的温室或网室内，经过水肥精细管理，培育成可供大田定植的果蔗植株种苗。 3.3 种茎 seedcane 果蔗顶
5、端生长点以下带有健康、可萌发芽的蔗茎或蔗茎段，可作为大田生产种植用的果蔗种苗（简 称蔗种）。 3.4 遗传变异株 abnormal plantlet 在组织培养过程中果蔗植株的遗传特性发生了 改变，其形态或DNA指纹图谱表现出有别于原品种特 征的植株。 DB35/T 1993 2021 2 3.5 目标有害生物 targe ted pests 为害果蔗种苗的目标病原（病毒和细菌）、病原真菌和昆虫。 4 种苗脱毒与繁殖 4.1 无目标病原苗的获得 4.1.1 茎尖培养脱毒苗 按照NY/T 2724和NY/T 3172的规定， 经茎尖培养方法获得无目标病原的瓶苗、 无琼脂苗和穴盘苗等。 4.1.2
6、 腋芽培养脱毒苗 蔗茎取回并清洗后， 在52 热水处理30 min（内含25%多菌灵可湿性粉剂400倍液） ， 然后在38 42 温度下催芽6 d10 d后，取腋芽的茎尖培养、繁殖成苗。 4.1.3 无毒苗圃组培苗 采用经检测不携带目标病原的种苗，在隔离网室的环境下长成的植株。 4.2 脱毒种苗繁殖与管理 4.2.1 繁殖基地选择 原种、基础种繁殖基地选择排灌方便、水旱轮作、自然隔离条件较好的基地。生产用种繁殖选择在 有一定灌溉条件和隔离条件的繁育基地。 4.2.2 田间病原控制 无目标病原的脱毒种苗在69个月生长期间做好病虫害防治。 在果蔗生长各生育期和采收前进行田 间巡查，发现有目标病原和
7、其它病原侵染的病株及时清除。 5 质量要求 5.1 整体要求 种苗植株健壮、完整，叶色正常、根系发达，无污染、无病虫为害，无遗传变异。 5.2 脱毒瓶苗 按照NY/T 1796和NY/T 2724的规定，要求根系有分叉，有主根及侧根，叶色浅绿，生长正常，无遗 传变异，无污染。脱毒瓶苗质量分为一级、二级两个等级，见表1。 表1 果蔗脱毒瓶苗等级划分 项目 指标 等级 一级 二级 假茎 有（+） 有（+） DB35/T 1993 2021 3 表1 果蔗脱毒瓶苗等级划分 （续） 项目 指标 完全展开叶 片 4 3，4 株高 cm 5.0 3.5，5.0 1.0 cm以上白色根 条 4 2，4 目标
8、病原检出率 % 不得检出 不得检出 遗传变异率 % 不得检出 不得检出 5.3 脱毒穴盘苗 按照NY/T 1796和NY/T 2724的规定，要求植株健壮，叶色正常，根系生长良好，无病虫为害，无遗 传变异株。脱毒穴盘苗质量分为一级、二级两个等级，见表2。 表2 果蔗脱毒穴盘苗等级划分 项目 指标 等级 一级 二级 新出叶 片 6 4，6 假茎株高 cm 12.0 8.0，12.0 假茎茎粗 cm 0.3 0.2，0.3 3.0 cm以上白色根 条 4 2，4 目标病原检出率 % 不得检出 不得检出 遗传变异率 % 不得检出 不得检出 5.4 脱毒种茎 按照NY/T 1796的规定，要求蔗茎新鲜
9、、蔗芽饱满、蔗茎节上根点无萌发，大田种植后无遗传变异 株。脱毒种茎质量分为一级、二级两个等级，见表3。 DB35/T 1993 2021 4 表3 果蔗脱毒种茎等级划分 项目 指标 等级 一级 二级 品种纯度 % 100 100 夹杂物率 % 1.0 1.0 种茎茎径 cm 2.5 2.0，2.5 含水量 % 7080 7080 发芽率 % 80.0 75.0，80.0 螟害节率 % 1.0 1.0，3.0 目标病原检出率 % 1.0 1.0，3.0 其他主要病害发病株率 % 3.0 3.0，5.0 注： 其他主要病害指为害果蔗的黑穗病和梢腐病。 5.5 不合格种苗处理 脱毒瓶苗、穴盘苗目标病
10、原检测不合格的，脱毒瓶苗经121 、101 kPa高压灭菌20 min30 min 后再废弃；穴盘苗采用焚烧或填埋方式处理。 6 有害生物检测对象 6.1 病毒 本文件检测病毒包括甘蔗花叶病毒（sugarca ne mosaic virus，SCMV）、高粱花叶病毒（sorghum mosaic virus，SrMV）、甘蔗条纹花叶病毒（sugarcan e streak mosaic virus，SCSMV ）和甘蔗黄叶病 毒（sugarcane yellow leaf virus，SCYLV）。 6.2 细菌 本文件检测细菌包括甘蔗宿根矮化病菌（ Leifsonia xyli subsp.
11、 Xyli， Lxx）和甘蔗白条病菌 （ Xanthomonas albilineans， Xa）。 6.3 真菌 本文件诊断的真菌性病害包括由黑穗病菌（ Sporisorium scitamineum）引起的黑穗病和由梢腐病 菌（ Fusarium spp.）引起的梢腐病。 DB35/T 1993 2021 5 6.4 昆虫 本文件鉴定的昆虫包括二点螟（ Chilo infuscatellus Snellen）、条螟（ Chilo sacchariphagus Bojer）、黄螟（ Argyroploce schistaceana Snellen）、红尾白螟（ Tryporyza intac
12、ta Snellen）、 大螟（ Sesamia inferens Walker）、台湾稻螟（ Chilo auricilius Dudgeno）等为害果蔗茎部的钻蛀 性害虫。 7 检测方法 7.1 形态指标测定 7.1.1 瓶苗株高 用标尺测量脱毒瓶苗根基位置至最新完整展开叶肥厚带处，结果以平均值表示，精确到0.1 cm。 7.1.2 瓶苗白色根长 用标尺测量脱毒瓶苗白色根的长度，记录大于或等于1.0 cm长的白色根条数。 7.1.3 瓶苗完全展开叶片数 目测并统计脱毒瓶苗植株完全展开的叶片数。 7.1.4 穴盘苗新出叶片数 目测并统计瓶苗移栽假植到穴盘期间新长出的完全展开绿叶数。 7.1.
13、5 穴盘苗假茎茎粗 用游标卡尺测量植株假茎中部直径，结果以平均值表示，精确到0.1 cm。 7.1.6 穴盘苗假茎株高 用标尺测量植株根基位置至最新完整展开叶肥厚带处，结果以平均值表示，精确到0.1 cm。 7.1.7 穴盘苗白色根长 用标尺测量植株白色根的长度，记录大于或等于3.0 cm长的白色根条数。 7.1.8 种茎品种纯度 按照NY/T 1488的规定，观察果蔗茎形、节间形状、根点排列、芽形状、芽位、芽沟、叶鞘被（57 号）毛群、内外叶耳形状等品种植物学特征特性，依公式（1）计算品种纯度。 VP=N1/N0100% （1） 式中： VP 种茎品种纯度，%； N1 正确无误的种茎数； N
14、0 种茎总数。 7.1.9 种茎含水量 种茎切断后劈成4份，于105 烘箱内烘干至恒重，依公式（2）计算含水量。 DB35/T 1993 2021 6 W=(M0-M1)/M0100% （ 2） 式中： W 种茎含水量，%； M0 烘干前重量，单位为克（g）； M1 烘干后重量，单位为克（g）。 7.1.10 种茎发芽率 脱毒种茎通过沙培，在28 30 条件下催芽，依公式（3）计算发芽率。 B=B1/B0100% （3） 式中： B 种茎发芽率，%； B1 萌芽数，单位为个； B0 总芽数，单位为个。 7.1.11 种茎茎径 用游标卡尺测量脱毒植株中部蔗茎节间的直径，结果以平均值表示，精确到0
15、.1 cm。 7.1.12 种茎夹杂物率 随机采集以2025根为一捆的脱毒种茎，称重后，依公式（4）计算夹杂物率。 T=W1/W0100% （4） 式中： T 种茎夹杂物率，%； W1 夹杂物重量，单位为克（g）； W0 种茎重量，单位为克（g）。 7.2 病原物检测 7.2.1 检测目标病原种类 本文件检测的目标病原包括甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗条纹花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、甘 蔗宿根矮化病菌和甘蔗白条病菌，依公式（5）计算目标病原检出率。 P=P1/P0100% （5） 式中： P 目标病原检出率，%； P1 检测出病毒或病菌的株数，单位为株； P0 总检测株数，单位为株。 7.2.2
16、 病原检测方法 7.2.2.1 核酸提取 样品叶片总核糖核酸（RNA）、总脱氧核糖核酸（DNA）提取分别采用异硫氰酸胍/酚法（Trizol法） 和十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl tr imethyl ammonium bromide，简称CTAB）法。 DB35/T 1993 2021 7 7.2.2.2 RNA 病毒互补脱氧核糖核酸链（cDNA）合成 cDNA合成反应体系和程序参照常规实验方法或试剂盒说明书完成。 7.2.2.3 检测引物 目标病原的聚合酶链式反应（PCR）检测引物序列见表4。 表4 果蔗脱毒种苗病原检测引物序列 病原名称 引物序列 53 目的条带大小 bp SCM
17、V SCMV-F4:GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC SCMV-R3:AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC 900 SrMV SrMV-F:ACAGCAGAWGCAACRGCACAAGC SrMV-R:CTCWCCGACATTCCCATCCAAGCC 850 SCSMV SCSMV-CPF2:TCATMTCTTCATCRGCCGC SCSMV-CPR2:ATCTTCYCTACGCAGGTCCG 572 SCYLV YLS111:TCTCACTTTCACGGTTGACG YLS462:GTCTCCATTCCCTTTGTACAGC 352 Lxx Lxx-F1:CCGA
18、AGTGAGCAGATTGACCAATGAT Lxx-R1:ACCCTGTGTTGTTTTCAACGCAGAG 439 Xa XAF1:CCTGGTGATGACGCTGGGTT XAR1:CGATCAGCGATGCACGCAGT 608 注： M=A/C，R=A/G，W=T/A，Y=C/T。 7.2.2.4 PCR 反应 PCR反应体系参数见表5，反应总体为25 L。PCR反应程序参数见表6，实验操作参照常规实验方法 或试剂盒说明书完成。反应设置阳性对照、阴性对照和空白对照，空白对照为用无菌水替代样品模板进 行PCR扩增反应。 表5 果蔗脱毒种苗病原检测 PCR 反应体系 单位：微升（L） 病
19、原名称 10PCR缓冲液 脱氧核糖核苷三磷 酸混合液 （ dNTPs） 2.5 mmol/L 上游引物 10 mol/L 下游引物 10 mol/L Taq DNA聚合酶 5 U/L 样品模板 无菌水 SCMV 2.5 2.5 1.0 1.0 0.125 1.0 16.875 SrMV 2.5 2.5 1.0 1.0 0.125 1.0 16.875 SCSMV 2.5 2.5 1.0 1.0 0.125 1.0 16.875 SCYLV 2.5 2.5 1.0 1.0 0.125 1.0 16.875 Lxx 2.5 2.0 1.0 1.0 0.250 1.0 17.250 Xa 2.5 2
20、.5 1.0 1.0 0.125 1.0 16.875 DB35/T 1993 2021 8 表6 果蔗脱毒种苗病原检测 PCR 反应程序 病原名称 PCR反应程序 SCMV 94 预热2 min；94 变性30 s，65 退火30 s，72 延伸1 min，35次扩增循环；再72 延伸10 min SrMV 94 预热2 min；94 变性30 s，52 退火30 s，72 延伸1 min，35次扩增循环；再72 延伸10 min SCSMV 94 预热2 min；94 变性30 s，55 退火30 s，72 延伸1 min，35次扩增循环；再7 2 延伸10 min SCYLV 94 预热
21、2 min；94 变性30 s，56 退火45 s，72 延伸1 min，35次扩增循环；再72 延伸10 min Lxx 94 预热3 min；94 变性30 s，62 退火30 s，72 延伸1 min，35次扩增循环；再72 延伸1 0 min Xa 94 预热1 min；94 变性30 s，56 退火1 min，72 延伸30 s，35次扩增循环；再72 延伸5 min 7.3 真菌性病害调查 根据典型病害症状对甘蔗黑穗病和甘蔗梢腐病进行鉴定，依公式（6）计算病害发病株率。 D=D1/D0100% （6） 式中： D 病害发病株率，%； D1 发生病害株数，单位为株； D0 总调查株数
22、，单位为株。 7.4 螟害节率调查 在果蔗生长中后期螟虫幼虫入侵蔗茎，造成螟害节，依公式（7）计算螟害节率。 S=S1/S0100% （7） 式中： S 螟害节率，%； S1 种茎螟害节数，单位为节； S0 种茎总节数，单位为节。 7.5 遗传变异率检测 7.5.1 检测引物及检测方法 按照NY/T 3754中规定的检测引物和检测方法检测果蔗脱毒种苗遗传变异率。 7.5.2 结果判定 通过扩增条带数量及其分子量大小计算等位基因频率， 若供检样品和标准样品出现相同的指纹图谱， 则判定为无遗传变异；否则，判定为有遗传变异。依公式（8）计算遗传变异率。 G=G1/G0100% （8） 式中： G 遗
23、传变异率，%； G1 变异株数，单位为株； G0 总检测样本数，单位为株。 DB35/T 1993 2021 9 8 抽样 按照NY/T 1796的规定，各类脱毒种苗的抽样数量见表7。瓶苗或穴盘苗采用随机抽样。种茎苗采用 五点取样法，各取样点的抽样数量按五点平均的数量进行连续取样，直至达到所需的抽样数量。 表7 抽样数量 种苗种类 种苗（N）或面积（S）总量 抽样数量 瓶苗 N1 000瓶 20瓶 1 000瓶N5 000瓶 40瓶 5 000瓶N10 000瓶 60瓶 N10 000瓶 80瓶 穴盘苗 N1 000株 20株 1 000株N5 000株 40株 5 000株N10 000株
24、60株 N10 000株 80株 种茎苗 S0.4 hm 2 40株 0.4 hm 2 S1.0 hm 2 8 S1.0 hm 2 150株 9 包装、标签、存储及运输 9.1 包装 一般情况下，脱毒瓶苗、穴盘苗均应妥善包装，需保湿，防挤压、防倒置，保持正常生长状态。脱 毒种茎以2025根为一捆，用包装线捆扎好，并挂上标签。 9.2 标签 包装箱上应贴有标签，注明品种名称、等级、规格、数量、产地、出圃日期、目的地、联系人、联 系方式、注意事项等，还应附上出圃检验合格证明。 9.3 存储 脱毒种茎存放在保湿保温（注意不可受寒受冻或高温发酵）且无病虫鼠为害的场所。 9.4 运输 脱毒瓶苗、穴盘苗应在3 d内运输到达目的地，脱毒种茎应在5 d内运输 到达目的地，并尽早定植。
