1、 ICS 65.020 CCS B 40 35 福建省地方标准 DB35/T 1992 2021 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光 定量 PCR 鉴别诊断技术 Diagnostic technique of duplex real-time fluorescent PCR for the detection of muscovy duck parvovirus and goose parvovirus 2021 - 08 - 17 发布 2021 - 11 - 17 实施 福建省市场监督管理局 发布 DB35/T 1992 2021 I 目次 前言 . . II 1 范围 . . 1 2
2、规范性引 用文件 . . 1 3 术语和定 义 . . 1 4 原理 . . 1 5 试剂与材 料 . . 2 6 仪器设备及耗材 . 2 7 操作方法 . . 2 8 结果判定 . . 3 附录 A（规范性） 0.01 mol/L （pH 7.2）磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 . 5 附录 B（规范性） MDPV 和 GPV 双 重实时荧光定量 PCR 鉴 别检测方法所用引物 . 6 附录 C（规范性） MDPV 和 GPV 双 重实时荧光定量 PCR 鉴 别检测反应体系组分 . 7 附录 D（资料性） MDPV 和 GPV 双 重实时荧光定量 PCR 鉴 别检测标准扩增曲线 . 8 附录
3、E（资料性） MDPV 和 GPV 双 重实时荧光定量 PCR 鉴 别检测融解曲线 . 9 DB35/T 19922021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由福建省农业科学院提出。 本文件由福建省农业农村厅归口。 本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所。 本文件主要起草人：林甦、王劭、陈少莺、陈秀琴、黄梅清、程晓霞、肖世峰、陈仕龙、林锋强。 DB35/T 1992 2021 1 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量 PC
4、R 鉴别诊断技术 1 范围 本文件规定了鉴别检测番鸭细小病毒（ Muscovy duck parvovirus,MDPV）和鹅细小病毒（ Goose parvovirus，GPV）双重实时荧光定量聚合酶链式反应（polymera se chain reaction，PCR）方法的原 理、试剂与材料、仪器设备及耗材、操作方法、结果判定。 本文件适用于番鸭细小病毒、鹅细小病毒的核酸检测和鉴别。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本
5、文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数。 融解（解链）温度 melting te mperature；Tm 值 核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值的50%时 的温度称为核酸的解链温度，由于这一现 象和结晶的融解相类似，又称融解温度。 注： 基于产物长度和G/C含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。 4 原理 MDPV与GPV全基因
6、序列在核苷酸水平上同源性约为81.9%。 基于两种水禽细小病毒基因核苷酸序列上 的差异， 分别设计两对特异性PCR引物， 分别扩增两种病毒VP基因序列上的一段300 bp左右特异性片段， 并在PCR反应体系中加入过量双链嵌合荧光染料，荧光染料非特异性地掺入脱氧核糖核酸 （Deoxyribonuc leic acid，DNA）双链后发射荧光信号，而不掺入链中的荧光染料分子不会发射任何荧 光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同 步，呈现正向对应关系。当PCR反应结束后， 通过重新加热扩增产物（反应温度逐渐升高），使结合了荧光染料分子的双链DNA解离或“融解”成单 链DNA，荧光强度
7、发生显著变化，形成一幅融解曲线图。由于上述两个特异性片段的Tm值不同，造成不 同的PCR产物融解曲线特性不一样（出现峰值所 对应的温度不同），通过分析扩增后融解曲线，可以简 单、直接地判断实时荧光定量PCR反应产物的目的基因片段，以此来鉴别MDPV和GPV。 DB35/T 1992 2021 2 5 试剂与材料 除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯。 PBS（磷酸盐缓冲溶液）：0.01 mol/L（pH 7.2）PBS 的配制方法按照附录 A 要求，4 保存。试 验用水应符合 GB/T 6682 的规定。 核糖核酸酶（20 mg/mL）。 10%SDS（十二烷基硫酸钠溶液）。 蛋白酶 K（10
8、 mg/mL）。 Tris-盐酸饱和酚（pH 7.6）。 酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1）：在一灭菌棕色瓶中按 25：24：1 比例分别加入酚、氯仿、 异戊醇。 乙酸钠：3 mol/L，pH5.4。 荧光定量 PCR 试剂盒：市售商品化双链嵌合荧光染料（如 SYBR Green）荧光定量 PCR 试剂盒或其 他等效产品，于20 保存。 无 DNA 酶/RNA 酶（DNase/RNa se-Free）去离子水：4 保存。 阳性对照：经灭活的 MDPV 或 GPV 阳性尿囊液。 阴性对照：MDPV 和 GPV 阴性尿囊液。 MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 检测用上、下游引物
9、序列：按照附录 B 的要求。 MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 检测反应体系组分：按照附录 C 的要求。 6 仪器设备及耗材 荧光定量 PCR 检测仪。 高速冷冻离心机：可控温至 4 ，最大离心速度可达 12 000 r/min 以上。 生物安全柜。 微量移液器。 组织匀浆器。 7 操作方法 样品采集与核酸的提取 7.1.1 样品采集与处理 在实验室操作过程中首先应严格遵守GB 19489和NY/T 541的要求。 在采样区无菌采集发病或病死雏番鸭肝、脾、胰腺等组织，剪碎研磨，按体积比1:4加入PBS制成组 织匀浆，反复冻融3次，经2 000 r/min离 心20 min，取上清
10、液分装，于20冻存待检。 对于活禽样品，采取病鸭或鹅口咽拭子、泄殖腔拭子等，将样品放入盛有1.0 mL PBS的1.5 mL灭菌 离心管中，振荡器上充分振荡30 s，然后将样品悬液转入新的1.5 mL灭菌离心管中，于20冻存待 检。 采样过程中样本不应交叉污染，采样和样品处理过程中应穿戴一次性手套和口罩。 DB35/T 1992 2021 3 7.1.2 样品 DNA 提取 按下列步骤完成DNA的提取，也可选择市售商品化DNA提取试剂盒或全自动核酸抽提仪及配套核酸 提取试剂，按其说明书完成DNA的提取： a) 取 1.5 mL 灭菌离心管， 加入 7.1.1 处理样品上清液或棉拭子悬液 400
11、 L和30 L（20 mg/mL） 核糖核酸酶，混匀后，室温下作用 20 min； b) 加入 43 L 10%的 SDS 溶液和 5 L 蛋白酶 K，42 水浴温育过夜（或 55 30 min 以上）； c) 加入等量的 Tris-盐酸饱和酚，充分混匀，12 000 r/min 离心 5 min，小心吸出上层水相于新 的 1.5 mL 灭菌离心管中； d) 加等量的酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），充分混匀，12 00 0 r/min 离心 5 min，小心吸出上层 水相至新的 1.5 mL 灭菌离心管中； e) 加 1/10 体积 3 mol/L 的乙酸钠（pH5.4），2.5 倍体积预
12、冷的无水乙醇，12 000 r/min 离心 20 min，弃去乙醇，75%的乙醇洗涤沉淀一次后真空干燥。用 20 L DNase/RNase-Free 去离子 水溶解沉淀，20保存备用。 荧光定量 PCR 检测 7.2.1 加样 在检测区使用荧光定量PCR试剂盒配制MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR检测反应体系n管（n为待检 样品数量+阳性管数+阴性管数，反应体系按照附录C要求），向每管中分别加入7.1.2中待检样品、阳性 对照或阴性对照的DNA提取物各1 L，盖紧管盖后充分混匀、除气泡、离心，然后放入荧光定量PCR检测 仪内并记录样本摆放顺序。 7.2.2 反应参数设置 第一阶段，预变
13、性95 /5 min。 第二阶段，扩增95 /15 s，60 /10 s，72 /15 s，30个循环，在每个循环的延伸阶段进行荧 光信号采集。 第三阶段，融解60 95 ，在扩增反应结束后，添加融解步骤，生成融解曲线。 8 结果判定 阈值设定 试验结束后读取检测结果，Ct值的阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的 最高点为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。 质控标准 阳性对照的Ct值25.0， 并出现典型的扩增曲线 （参见附录D） ， 融解曲线于85.4 0.23 （MDPV） 和87.3 0.26 （GPV）出现明显的特异性峰值（参见附录E）。 阴性对照无Ct值， 且
14、无典型扩增曲线； 或阴性对照Ct值29.0， 出现扩增曲线， 但融解曲线于85.4 0.23 （MDPV）和87.3 0.26 （GPV）未出现明显的特异性峰值。 阳性对照和阴性对照同时成立可判断试验有效，否则试验无效。 DB35/T 1992 2021 4 结果描述及判定 8.3.1 阳性 检测样品Ct值27.0，出现典型的扩增曲线，如融解曲线于85.4 0.23 出现明显的特异性峰 值，则判定为MDPV阳性；如融解曲线于87.3 0.26 出现明显的特异性峰值，则判定为GPV阳性； 如融解曲线于85.4 0.23 和87.3 0 .26 出现特异性双峰，则判定为MDPV和GPV双阳性。 8
15、.3.2 阴性 检测样品Ct值29.0或无， 无典型扩增曲线， 并且融解曲线未出现明显的特异性峰， 则判定为阴性。 8.3.3 可疑 若检测样品27.0Ct值29.0，出现扩增曲线，则判定为可疑，应重新检测。重新检测结果为阳性 或可疑的判定为阳性，结果为阴性的判定为阴性。 DB35/T 1992 2021 5 A A 附录A （规范性） 0.01 mol/L（pH 7.2）磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1 A 液（0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液） 磷酸二氢钠水溶液（NaH 2PO4H2O）27.6 g，用适量蒸馏水融解，定容至1 000 mL。 A.2 B 液（0.2 mol/L 磷
16、酸氢二钠水溶液） 磷酸氢二钠水溶液（Na 2HPO412H2O）71.6 g，用适量蒸馏水融解，定容至1 000 mL。 A.3 0.01 mol/L PBS 的配制 A液14 mL，B液36 mL，加氯化钠（NaCl）8.5 g，用蒸馏水定容至1 000 mL；121 高压灭菌15 min ， 4 保存备用。 DB35/T 1992 2021 6 B B 附录B （规范性） MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测方法所用引物 MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测方法所用引物见表B.1。 表B.1 MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测方法所用引物
17、 引物名称 引物浓度 引物序列 MDPV上游引物M3-P1 10 mol/L 5- TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC -3 MDPV下游引物M3-P2 10 mol/L 5- TGTTACCATGATGTCTGAAAT -3 GPV上游引物G5-P1 10 mol/L 5- GAGGTAGACAGCAACAGAAA -3 GPV下游引物G5-P2 10 mol/L 5- GCTCGTCCGTGACCATA -3 DB35/T 1992 2021 7 C C 附录C （规范性） MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测反应体系组分 MDPV和GPV双重实时荧光定
18、量PCR鉴别检测反应体系组分见表C.1。 表C.1 MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测反应体系组分 体系组分 用量 SYBR Green荧光定量PCR酶混合物（2） a 10 L 上游引物M3-P1 0.5 L 下游引物M3-P2 0.5 L 上游引物G5-P1 0.5 L 下游引物G5-P2 0.5 L DNase/RNase-Free去离子水 7 L 总量 19 L a SYBR Green荧光定量PCR试剂盒内提供，内含DNA聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）混合物，镁离子（Mg2+），SYBR
19、 Green荧光染料等。 DB35/T 1992 2021 8 D D 附录D （资料性） MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测标准扩增曲线 MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测标准扩增曲线见图D.1。 标引序号说明： 1MDPV扩增曲线； 2GPV扩增曲线； 3MDPV+GPV扩增曲线； 4，5阴性对照。 图D.1 MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测标准扩增曲线 DB35/T 1992 2021 9 E E 附录E （资料性） MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测融解曲线 MDPV和GPV双重实时荧光定量PCR鉴别检测融解曲线见图E.1。 标引序号说明： 1MDPV融解曲线特异性单峰； 2GPV融解曲线特异性单峰； 3MDPV+GPV融解曲线特异性双峰； 4，5阴性对照。 图E.1 MDPV 和 GPV 双重实时荧光定量 PCR 鉴别检测融解曲线
