1、ICS 11.220 B 41 DB36 江 西 省 地 方 标 准 DB36/T 14532021 种鸡禽白血病净化技术规范 Echnical specifications for leukemia purification of breeding chickens 2021 - 09 - 03发布 2022 - 03 - 01实施 江西省市场监督管理局 发布 DB36/T 14532021 I 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由江西省农业
2、农村厅提出并归口。 本文件起草单位：江西省农业科学院畜牧兽医研究所。 本文件主要起草人：李海琴、康昭风、季华员、谭美芳、曾艳兵、刘林秀、唐维国。 DB36/T 14532021 1 种鸡禽白血病净化技术规范 1 范围 本文件规定了净化检测程序、净化周期与终止和净化状态维持等阶段的技术要求。 本文件适用于有禽白血病净化需求的种鸡场，其他类型鸡群也可参照执行。所列禽白血病净化状态 维持技术适用于已实现禽白血病净化的鸡群。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件
3、。 GB/T 26436 禽白血病诊断技术 GB/T 36873 原种鸡群禽白血病净化技术检测规程 NY/T 680 禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法 中国兽药典（2020年版） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 禽白血病病毒 Avian leukosis virus, ALV 禽白血病病毒归属于反转录病毒科反转录病毒属。病毒粒子为一直径为80nm120nm，平均是 90nm的球状物，其外周是囊膜糖蛋白，其中gp85基因是囊膜蛋白表面的主要成分，内部病毒子核心有 一主要的群特异性抗原p27蛋白，其为核衣壳蛋白。 3.2 禽白血病 Avian leukosis ,
4、AL 由禽白血病/肉瘤病毒群病毒引起的以造血细胞恶性增生为主的禽类多种肿瘤性疾病的总称。禽白 血病既可通过种蛋垂直感染，也可以水平传播，严重危害种鸡场的健康发展。 3.3 动物疫病净化 Animal disease eradication 在一个养殖场或指定区域内，通过持续检测或监测发现患病动物或带毒动物，并通过淘汰带毒动物 以实现根除某种动物疫病的过程。 4 净化检测程序 DB36/T 14532021 2 4.1 雏鸡胎粪检测与淘汰 4.1.1 将每只母鸡的种蛋作好标记，置于经清洗和消毒的孵化器中孵化，孵化至18d，转移至经清洗 消毒的出雏器中出雏，每只母鸡的胚蛋置于相互隔离的小盒中出雏，
5、并作好标记。 4.1.2 胎粪样品的收集、样品的处理与检测按照GB/T 36873操作。 4.1.3 检测到禽白血病抗原阳性的雏鸡，连同同一母鸡的雏鸡一起淘汰，如同一公鸡有2只或以上母 鸡的后代禽白血病抗原阳性雏鸡，则该公鸡及与其配种的所有母鸡的后代一同淘汰，经上述淘汰后留下 的阴性雏鸡则维持小群隔离饲养。 4.2 育成期的检测与淘汰 4.2.1 对每只鸡分别无菌采集血清0.5mL ，用PCR-HRM方法检测外源性禽白血病病毒（PCR-HRM 方法见附录A），或者对每只鸡分别无菌采集静脉血1mL，加入肝素钠抗凝，按照GB/T 26436规定方 法，12小时内用血浆分别接种DF-1细胞，培养7d
6、9d后取细胞培养上清，按照NY/T 680方法检测禽 白血病病毒p27抗原。 4.2.2 任何一只鸡只要有一个样品用任何一种方法检测为阳性立即淘汰，不再作为留种选育个体。对 检测为阴性的鸡，转移至另一经清洗消毒的鸡舍继续维持小群隔离饲养。 4.3 开产初期的检测与淘汰 4.3.1 对每只母鸡分别取其初产蛋23个，每个分别采集稀蛋清约1mL，经反复冻融三次，按照 NY/T 680规定方法逐个检测禽白血病病毒p27抗原。或者对每只母鸡分别无菌采集血清0.5mL ，用 PCR-HRM方法检测外源性禽白血病病毒，或者对每只母鸡分别无菌采集静脉血1mL，加入肝素钠抗凝， 按照GB/T 26436规定方法
7、，12h内用血浆分别接种DF-1细胞，培养7d9d后取细胞培养上清，按照 NY/T 680规定方法检测禽白血病病毒p27抗原。 4.3.2 无菌采集每只公鸡血清0.5mL或精液，用PCR-HRM方法检测外源性禽白血病病毒，或者对每 只公鸡分别无菌采集抗凝血或精液接种DF-1细胞，按照GB/T 26436规定方法进行禽白血病病毒分离 鉴定。精液病毒分离鉴定具体操作见附录B。 4.3.3 检测后的淘汰和留种方法同4.2.2。 4.4 留种前的检测与淘汰 4.4.1 分别取每只母鸡所产种蛋1个采集蛋清，或血清、静脉血，检测方法同4.3.1。 4.4.2 公鸡的采样和检测方法同4.3.2。 4.4.3
8、 检测后的淘汰和留种方法同4.2.2 4.5 种蛋的选留和孵化 4.5.1 经4.14.4检测后为阴性的鸡方可留作种用，每只母鸡只与一只公鸡的精液进行人工授精。收 集的种蛋应及时消毒并作好标记，标记应标示与配公鸡号及母鸡号。 4.5.2 种蛋的孵化按4.1.1操作。 5 净化周期与终止 5.1 净化周期确定 5.1.1 净化时可根据种鸡所处育种时期，对照本文件4.14.4的任何一个环节启动净化程序。不同种 鸡场可根据其技术条件分别选择本文件4.14.4的任何一个环节进行检测。经一个净化周期检测阴性种 DB36/T 14532021 3 鸡群的后代作为净化后下一个世代鸡，继续按照本文件4.14.
9、4规定的程序实施下一世代的检测和净 化。后续世代按此程序继续循环进行，在30周龄左右检测净化鸡群血清中禽白血病J-亚型和A/B亚型 抗体，直至抗体阳性率低于1%且达到附录C所列禽白血病净化评估标准。 5.2 净化效果评估 净化效果评估应按照国家农业行业行政主管部门制定的禽白血病净化评估程序和净化评估标准进 行。净化评估标准见附录C。 5.3 达到净化鸡群的检测比例调整 对按照5.2评估达到净化标准的原种场无需再按照本文件4.14.4要求进行普遍性检测，可按照5.2 或不低于10%的比例进行抽样监测。检测结果不符合5.2所要求标准，则按照本文件4.14.4所列检测规 程重新进入检测净化程序。 6
10、 已净化鸡群的净化状态维持措施 6.1 禽白血病净化维持监测 种鸡群在饲养过程中应进行禽白血病定期监测，以了解鸡群禽白血病病毒的感染状态。可在种鸡 30周龄左右，采集500份左右血清样品，用PCR-HRM方法检测外源性禽白血病病毒或用ELISA方法 检测禽白血病病毒A/B亚群及J亚群抗体。同时，采集种蛋用ELISA方法检测蛋清中的禽白血病p27 抗原。如果血清禽白血病抗原阳性、抗体阳性率或蛋清p27抗原阳性率超过1%时，应对鸡群全群分别 采集抗凝血按照GB/T 26436规定方法检测。 6.2 种鸡场生物安全措施 6.2.1 种鸡场的选址应符合动物防疫条件，场区要有明确和合理的功能分区，生产区
11、内污道净道不交 叉，栋舍之间要有5m以上的间距；圈舍地面、墙壁和顶棚应当选用适宜材料，以便于清洗消毒，要有 与生产规模相适应的病死畜禽无害化处理、粪污收集处理、防疫等垃圾收集等设施设备，或是通过委托 协议由第三方进行无害化处理。种鸡场要有完善的防疫制度和养殖档案制度。 6.2.2 运送物品车辆以及人员出入，均应执行严格消毒制度，同时应尽可能降低种鸡场所需物品与外 界的交流。接触核心群的工作人员应相对固定，避免其他鸡群的饲养员进入实施净化的鸡群中工作。种 鸡场应在鸡舍安装防鸟网或其他防鸟设施，并定期检查维护。种鸡场应执行全进全出制度。饲养已经净 化的品系时，应避免不同来源的种鸡在同一鸡场饲养。不
12、同来源的种蛋在孵化和出雏之前应分开，避免 与其他鸡群（特别是非净化鸡群）同时孵化和出壳。 6.3 疫苗的管理和使用 净化鸡群使用各种弱毒疫苗，应是经过中国兽药典规定程序检测合格的疫苗，必要时可对疫苗 进行抽样检测。鸡用弱毒活疫苗中禽白血病病毒污染检测操作程序可参考附录B。 DB36/T 14532021 4 A A 附录A （规范性） PCR-HRM检测外源性ALV A.1 引物序列 用于扩增外源性ALV的引物见表A.1。 表A.1 用于扩增外源性ALV的引物 A.2 核酸提取及PCR-HRM检测 A.2.1 核酸提取 核酸提取步骤如下： 1) 样品中加入TRIZOL后反复吹打几次，使样品充分
13、裂解。室温放置5min； 2) 向以上溶液中加入氯仿，每使用1mL TRIZOL加入0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室 温放置2min3min； 3) 4 12000rpm离心15min，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主 要在水相中，把水相（约600uL）转移到一个新的RNase-Free离心管中； 4) 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10 min； 5) 4 12000rpm离心10 min，弃上清； 6) 加入75%乙醇洗涤沉淀。每使用1mL TRIZOL用1mL 75%乙醇对沉淀进行洗涤； 7) 4 12000rpm离心3 m
14、in，小心吸弃上清，注意不要吸弃RNA沉淀； 8) 室温放置2 min3min，晾干。加入30uL50uL无RNA的水，充分溶解RNA保存在-70，防 止裂解。 A.2.2 扩增检测 A.2.2.1 扩增试剂准备 病毒名称 碱基序列(5-3) GGATGAGGTGACTAAGAAAG ALV-J CGAACCAAAGGTAACACACG GCCAAACGGATTTCTGCCTT ALV-A AACCCAGATACCAAGGAACC GCCAAACGGATTTCTGCCTT ALV-B GCCTCTGGTGGGAGAATCGT TCCAGGCCGCAACTCAC ALV-K CATACCACCA
15、CCCACGTACT DB36/T 14532021 5 初次使用，将所有试剂室温平衡10min，然后轻轻颠倒混匀，瞬时离心后使用；如需一段时间内经 常取用，试剂可于28储存2周；饱和染料LC Green第一次使用后，28避光存放。每个反应 体系按表A.2所示用量配制反应混合液。将以上反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀。 表A.2 PCR-HRM反应体系 试剂 用量 2One Step Buffer 12.5L PrimeScript OneStep Enzyme Mix 1 L 上游引物 1 L 上游引物 1 L ddH2O 6.5 L LC Green 1 L 模板RNA/DNA
16、 2 L A.2.2.2 反应条件 反应条件如下： a) 第一步：25 5min，50 45min，85 2min； b) 第二步：945min；94 30sec，55 30sec，72 30sec，35个循环； c) 第三步： 72 8min；7595，0.3/sec收集荧光信号。 A.3 结果判定 A.3.1 有效性判断 A.3.1.1 ALV-J阳性对照熔解曲线为1个熔解峰，熔解峰TM值为（86.21.5）； A.3.1.2 ALV-A阳性对照熔解曲线为3个熔解峰，主熔解峰Tm为（86.51.5），低温区熔解峰Tm值 为（84.21.5)，并在高温区形成熔解肩峰； A.3.1.3 ALV
17、-B阳性对照熔解曲线为2个熔解峰，其中低温区熔解峰的峰高明显高于高温区熔解峰，熔 解峰Tm值分别为（85.61.5）和（87.81.5）； A.3.1.4 ALV-K阳性对照熔解曲线为2个熔解峰，熔解峰Tm值分别为（86.61.5）和（89.01.5）； A.3.1.5 若阴性对照在8088出现熔解峰，可能存在污染，建议更换实验环境后重复实验。 A.3.2 样品判定标准 A.3.2.1 ALV-J亚型单独感染：熔解曲线为单一峰，熔解峰TM值为（86.21.5）； A.3.2.2 ALV-A亚型单独感染：熔解峰有3个，主熔解峰Tm为（86.51.5），低温区熔解峰Tm值为 （84.241.5），
18、并在高温区形成熔解肩峰； A.3.2.3 ALV-B亚型单独感染：熔解峰有2个，Tm值分别为（85.61.5）和（87.81.5），其中低 温区熔解峰的峰高明显高于高温区熔解峰； A.3.2.4 ALV-K亚型单独感染：熔解峰有2个，Tm值分别为（86.61.5）和（89.01.5）； A.3.2.5 外源性ALV混合感染：参考上述单独感染的熔解峰； A.3.2.6 其他情况：ALV外源性阴性。 DB36/T 14532021 6 附 录 B （规范性） ALV 的分离和分离培养物的检测 B.1 分离病毒用细胞 在分离外源性ALV 时，考虑到E亚型的内源ALV的干扰，必须选用C/E细胞对内源性
19、ALV-E 有抵 抗力的细胞，如0系SPF的鸡胚成纤维细胞（CEF）或来自0系鸡胚成纤维细胞（CEF）的传代细胞系DF-1 细胞。如果不使用C/E细胞来分离培养ALV 就不能排除内源性ALV-E的干扰，就不能得出分离到外源 性ALV 的结论。 B.2 样品采集和处理 B.2.1 血浆 p27 抗原检测阳性率降低到1%以下时，选取400600只鸡的小群，全群无菌采集抗凝血（用肝素 钠做抗凝剂），1500 rpm离心15min后，取上清接种于DF-1细胞。 B.2.2 精液 使用75%乙醇将泄殖腔周围擦拭干净，将公鸡精液采集到1.5 mL已灭菌的离心管中，一只公鸡的精 液对应一个离心管，编号后放入
20、冰盒中暂存。采集的精液，用含有青链霉素（青霉素100 U/mL， 链霉 素0.1 mg/mL）的细胞维持液，按照最终稀释度为（1:28）（1:56）充分混匀后接种DF-1细胞。 B.2.3 疑似ALV污染的活疫苗检测 马立克氏病细胞结合疫苗从液氮中取出后，在含有疫苗的细胞悬液中加入910倍的灭菌注射用水， 将细胞悬液移至小试管混匀，4放置10min让细胞在低渗下裂解死亡然后接种于DF-1细胞。 B.3 病毒接种细胞的方法 本规定推荐使用来自0系CEF的传代细胞系DF-1，具体步骤如下： 1）在37 水浴中提前预热消化液（0.25%胰酶）和DMEM high-glucose； 2）弃去细胞瓶中长
21、满的细胞培养液上清； 3）加入PBS清洗两遍后，于25cm2的培养瓶中加入5mL胰酶。加入胰酶2分钟后消化完全后，再加 入10mL含有10%FBS的DMEM细胞培养液； 4）1200rpm离心5min后弃去上清，加入适量细胞培养液使细胞浓度达到（1104）（2104）个细 胞； 5）将细胞悬液加入到24孔板中，每孔0.5 mL，培养24h36h后待细胞长满； 6）每孔加入分离好的50uL血浆样品以及阴阳性对照； 7）于细胞培养箱37 ，5% CO2 中培养细胞24 h； 8）24 h后将细胞培养液更换为细胞维持液含有2% FBS的DMEM培养7d9d； 9）7d9d后将细胞反复冻融3次，最后一
22、次冻融后，收集每一个样品培养物。 DB36/T 14532021 7 B B 附 录 C （规范性） 禽白血病净化评估标准 C.1 净化评估标准 同时满足以下要求，视为达到净化标准。 a) 种鸡群抽检，禽白血病病原学检测均为阴性； b) 连续两年以上无临床病例； c) 现场综合审查通过。 C.2 抽样检测方法 净化评估抽样检测方法见表C.1。 表C.1 净化评估抽样检测方法 检测项目 检测方法 抽样总群 抽样数量 样本类型 p27 ELISA检测 产蛋鸡群 500个种蛋（随机抽样，覆盖不同 栋鸡群） 种蛋 病原学检测 病原分离（DF-1细胞） 种鸡群 单系50份（随机抽样，覆盖不同栋 鸡群） 血样 注：p27抗原检测全部为阴性，实验室检测通过；p27抗原检测阳性率高于1%，实验室检测不通过。检出p27抗原阳性且 阳性率1%以内，采用病毒分离进行复测，病毒分离全部为阴性，实验室检测通过；病毒分离出现阳性，实验室检测不通 过。 _
