1、ICS 65.020.20 CCS B 22 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/ T 4056 2021 优良食味半糯粳稻品质 Quality of semi-glutinous japonica rice with good taste 2021 - 06 - 03 发布 2021 - 07 - 03 实施 江苏省市场监督管理局 发布 DB32/ T 4056-2021 I 前 言 本 文件 按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草 。 本 文件 由江苏省农业科学院提出。 本文件由江苏省农作物标准化技术委员会归口。 本
2、文件 起草单位：江苏省 农业科学院 、扬州大学、江南大学、江苏里下河地区农业科学研究所、江 苏省种子管理站、 江苏省农业技术推广总站。 本 文件 主要起草人： 王才林 、 张亚东 、 张洪程 、 刘巧泉 、 王莉 、 李爱宏 、 何金龙、管永祥 、 朱镇、 宋锦花、魏海燕 、 赵春芳 、 魏晓东 、 陈涛 、赵庆勇 、 赵凌 、 姚姝 、 周丽慧 、 路凯 、梁文化 。 DB32/ T 4056-2021 1 优良食味半糯粳稻品质 1 范围 本 文件 规定了 优良食味 半糯 粳 稻 品质 的 术语和 定义、质量 要求 、检验方法 、 检验 规 则及 判定规则 。 本 文件 适用于半糯 粳稻 品
3、种的选育、鉴定 、 评价 和 推广 ，适用于商品半糯粳稻的收购、加工和销售 。 2 规范性引用文件 下列文件中 的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 1350 稻谷 GB/T 1354 大米 GB/T 5490 粮食检验 一般规则 GB/T 5491 粮食、油料检验 扦样、分样法 GB/T 15682 粮油检验 稻谷、大米蒸煮食用品质感官评价方法 GB/T 17891 2017 优质稻谷 GB/T 21719 稻谷整精米率检验法 GB/T 2229
4、4 粮油检 验 大米胶稠度的测定 NY/T 83 米质测定方法 NY/T 593 食用稻品种品质 NY/T 2639 稻米直链淀粉的测定 分光光度法 3 术语和定义 GB 1350、 GB/T 1354、 GB/T 17891 和 NY/T 593 界 定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 半糯粳稻 semi-glutinous japonica rice 稻米 直链淀粉含量 在 2%13%之间， 含有低直链淀粉含量的 Wx 等位 基因 （ 如 Wxmp、 Wxmq、 Wxmw 等 ）的 粳 稻。 3.2 优良食味半糯粳稻 semi-glutinous japonica rice wi
5、th good taste 品质达到 本标准 4 规定 的 质量要求、 品质等级 三级及 以上 的 半糯 粳 稻 。 DB32/ T 4056-2021 2 3.3 鉴 别 标记 identification molecular marker 用于鉴别 低直链淀粉含量基因 （ 如 Wxmp、 Wxmq、 Wxmw等 ） 、经 PCR 反应扩增 出的特征性条带 或 序列， 详见附录 A。 4 质量 要求 4.1 基本质量要求 杂质含量、水分含量、黄粒米 含量、 谷外糙米 含量、 色泽气味 等 基本质量指标应符合 GB 1350 粳 稻谷要求，不完善粒含量 应 3%，异品种 率 应 2%。 4.2
6、 定等质量 指标 在符合 GB 1350 的基础上，优良食味半糯粳稻的定等质量指标见 表 1。 表 1 优良食味半糯粳稻品质等级 注 1： 等级评定 须在相同的水分条件下进 行 。 5 检验方法 5.1 低直链淀粉含量 基因 Wxmp、 Wxmq、 Wxmw的 检验 按照附录 A 执行。 5.2 不完善粒 含量 检验：按 GB/T 17891 2017， 6.5执行 。 5.3 异品种 率 检验：按 照 GB/T 17891 2017，附录 B执行 。 5.4 整精米率检验：按 照 GB/T 21719执行。 5.5 透明度检验：按照 NY /T 83 执行。 5.6 直链淀粉（干基）含量检验
7、：按照 NY/T 2639 执行。 5.7 胶稠度检验：按照 GB/T 22294 执行。 5.8 食味值 检验：按照 GB/T 15682 执行。 指标 等级 一 二 三 整精米率 /% 67.0 61.0 55.0 透明度 /级 1 2 3 直链淀粉 （ 干基 ） 含量 /% 8.013.0 胶稠度 /mm 90 80 70 食味值 /分 90 85 80 DB32/ T 4056-2021 3 6 检验规则 6.1 扦样、分样按照 GB /T 5491 执行。 6.2 检验的一般规则按照 GB /T 5490 执行。 7 判定规则 7.1 类型判定 含有低直链淀粉含量 基因 （如 Wxm
8、p、 Wxmq、 Wxmw等） 的，判定为半糯粳稻。 7.2 等级判定 达到 本标准 4.1 规定的 基本质量要求， 表 1 中 5 项 定 级 指标 全部达到该等级 要求 的 ， 则判定为该等 级 半糯 粳 稻 。 5 项 定 级 指标中有 1 项达不到该等级质量要求的， 逐级降至符合的等级 ； 不符合 最低等级 指标 要求 的，为非等级产品。 基本质量要求 有 1 项 及以上 不 符合的，为非等级产品。 7.3 等级分类 品 质 等级达三级 及 以上 的判定 为 优良食味 半糯 粳 稻，低于三 级 的 判定 为普通半糯 粳 稻。 DB32/ T 4056-2021 1 附 录 A （规范性
9、） 低直链淀粉含量基因 Wxmp、 Wxmq和 Wxmw分子标记检测方法 A.1 原理 低直链淀粉含量突变基因 Wxmp、 Wxmq和 Wxmw是 在 Wxb基因的第 4、第 5和第 6外显子发生了单碱基突 变 （图 A.1） 。仅在第 4外显子第 53位碱基发生 G-A突变的为 Wxmp基因，同时在第 4外显子第 53位碱基发 生 G-A突变和第 5外显子第 52位碱基发生 T-C突变的为 Wxmq基因， 仅在第 6外显子第 62位碱基发生 A/C突 变的为 Wxmw基因。利用四引物扩增受阻突变体系 PCR技术可针对第 4和第 6外显子的变异位点进行分子 标记检测；利用成对引物可针对第 5外
10、显子的变异位点进行 PCR扩增和序列分析，根据突变位点的有无 和类型，来判断是否含有突变基因 Wxmp、 Wxmq和 Wxmw。 图 A.1 Wx基因的 结构及 Wxmp、 Wxmq和 Wxmp基因 突变位点 示意图 A.2 仪器设备 高速冷冻离心机、 PCR扩增仪、超纯水系统、组织研磨仪、琼脂糖凝胶电泳系统及制胶附件、凝胶 成像系统、微量可调移液器（ 2 uL、 10 uL、 100 uL、 1000 uL）。 A.3 试剂与溶液 A.3.1 DNA提取试剂 十六烷基三甲基溴化铵、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐 酸、氢氧化钠、氯化钠。 A.3.2 PCR扩增
11、试剂 DNA、引物、 dNTP、 Taq酶、 10PCR缓冲液、超纯水。 A.3.3 电泳试剂 DB32/ T 4056-2021 2 6上样缓冲液、 DNA分子量标准、 1TAE电泳缓冲液、核酸染料 。 A.3.4 DNA回收试剂 凝胶回收试剂盒。 A.4 DNA 提取 稻谷出苗后在三叶期按单株取水稻叶片，提取基因组 DNA。 DNA 提取方法及试剂配制方法按 NT/T 1433 执行。 A.5 分子标记序列 A.5.1 用于鉴定 Wxmq或 Wxmp的分子标记序列 利用四引物扩增受阻突变体系 PCR 技术可对 Wxmq或 Wxmp第 4 外显子第 53 位碱基发生的 G-A 突 变进行分子
12、标记鉴定，四引物序列为： 正向外引物（ Wxmq/Wxmp-O-F）序列为 5-ATGTTGTGTTCTTGTGTTCTTTGCAGGC-3， 反向外引物（ Wxmq/Wxmp-O-R）序列为 5-GTAGATCTTCTCACCGGTCTTTCCCCAA-3， 正向内引物（ Wxmq/Wxmp-I-F）序列为 5-GGGTGAGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3， 反向内引物（ Wxmq/Wxmp-I-R）序列为 5-GTCGATGAACACACGGTCGACTCAAT-3。 利用成对引物 PCR 扩增法可对 Wxmq第 5 外显子第 52 位碱基发生的 T-C 突变进行分子标记鉴
13、定， 成对引物序列为： 正向引物（ Wxmq-F）序列为 5-GGCTTCACGCAACGGCGCTACAAATAG-3， 反向引物（ Wxmq-R）序列为 5-CCATTCGCCTGCAAAGAACACAAGAAC-3。 A.5.2 用于鉴定 Wxmw的分子标记序列 利用四引物扩增受阻突变体系 PCR 技术可对 Wxmw第 6 外显子第 62 位碱基发生的 A/C 突变进行分 子标记鉴定，四引物序列为： 正向外引物（ Wxmw-O-F）序列为 5- GCTTAGCTTCCACTGGTGATTTCA-3， 反向外引物（ Wxmw-O-R）序列为 5- GTAGATGCCATTGGGCTGGTA
14、GT-3， 正向内引物（ Wxmw-I-F）序列为 5- AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3， 反向内引物（ Wxmw-I-R）序列为 5- TCTTGAGATCAATTGTAACTCCCCAT-3。 A.6 PCR 反应体系 20 L PCR 反应体系，包括 2.0 L 样品 DNA (10 ng/L)， 2.0 L 引物等摩尔混合液 (4 pmol/L/每条 )， 2.0 L 10PCR 缓冲液 (含 MgCl2)， 0.4 L dNTP (2.5 mmol/L)， 0.5 L Taq 酶 (5U/L)， 13.1 L 超纯水。 DB32/ T 4056-2021 3
15、 A.7 PCR 反应程序 A.7.1 Wxmq或 Wxmp 第 4 外显子分子标记的 PCR 反应程序 95 下预变性 3 min； 95 下变性 30 s， 65 退火 30 s， 72 下延伸 1 min，共 33 个循环； 72 延 伸 5 min， 4 保存。反应在 PCR 扩增仪（热循环仪）上进行。 A.7.2 Wxmq 第 5 外显子分子标记的 PCR 反应程序 95 下预变性 3 min； 95 下变性 30 s， 58 退火 30 s， 72 下延伸 2 min，共 33 个循环； 72 延 伸 5 min， 4 保存。反应在 PCR 扩增仪（热循环仪）上进行。 A.7.3
16、Wxmw 分子标 记的 PCR 反应程序 95 下预变性 3 min； 95 下变性 30 s， 55 退火 30 s， 72 下延伸 1 min，共 33 个循环； 72 延 伸 5 min， 4 保存。反应在 PCR 扩增仪（热循环仪）上进行。 A.8 PCR 产物检测 A.8.1 琼脂糖凝胶制备 在三角瓶中将琼脂糖与 1TAE 缓冲液按 1.5%质量比混合，煮沸至琼脂糖颗粒完全溶解，按 1： 10000 （体积比）加入核酸染料，摇匀后倒入制胶槽托盘板上，插上样品梳，冷却凝固后拔出样品梳，备用。 A.8.2 上样样品制备 在 20 uL 的 PCR 扩增产物中加入 4 uL 6上样缓冲液，
17、混匀。 A.8.3 电泳 将琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入 1TAE 缓冲液至刚没过凝胶，每个样品孔加入 5 uL 上样样品，以 20 V/cm 的电压进行电泳，电泳 20 min。 A.8.4 凝胶成像 将电泳后的琼脂糖凝胶放于凝胶成像系统的紫外光源下进行 PCR 扩增产物观察，拍照备用。用成 对引物 Wxmq-F/R 扩增得到的 PCR 条带需 割胶回收、回收试剂盒纯化后，送测序公司进行序列分析。 A.9 结果分析 A.9.1 分子标记检测结果分析 利用四引物 Wxmq/Wxmp-O-F/O-R/I-F/I-R 分子标记可扩增得到三种类型的 DNA 特征条带（图 A.2） ， 扩增得到 439
18、bp 和 292bp DNA 条带的样品，证明含第 4 外显子突变位点；扩增得到 439bp 和 200bp DNA 条带的样品，证明不含此突变位点 ，同时扩增得到 439bp、 292bp 和 200bp DNA 条带的样品，证明此突 变位点为杂合位点。 利用成对引物 Wxmq-F/R 分别作为测序引物，可 获得 DNA 条带的 核苷酸序列（图 A.3），如第 5 外 DB32/ T 4056-2021 4 显子第 52 位为 C 碱基，证明含此突变位点，如为 T 碱基，证明不含此突变位点，如为 T/C 碱基叠加， 证明此突变位点为杂合位点 。 利用四引物 Wxmw-O-F/O-R/I-F/
19、I-R 可扩增得到三种类型的 DNA 特征条带（图 A.4）：扩增得到 459bp 和 301bp DNA 条带的样品，证明含 Wxmw突变位点；扩增得到 459bp 和 209bp DNA 条带的样品，证明 不含此突变位点 ，同时扩增得到 459bp、 301bp 和 209bp DNA 条带的样品，证明此突变位点为杂合位点。 （ M：分子量标准； 1, 7-10为含第 4外显子突变位点的特征条带， 2-6为不含第 4外显子突变位点的特征 条带， 11-12为杂合位点的特征条带） 图 A.2 Wxmp或 Wxmq第 4外显子 突变位点的 分子标记检测 电泳图谱 （ 2, 4为含第 5外显子突
20、变位点的特征序列， 1, 3, 5-10为不含第 5外显子突变位点的特征序列， 11-12为杂 合位点的 特征 序列） 图 A.3 Wxmq第 5外显子突变位点的核苷酸序列 分析 DB32/ T 4056-2021 5 （ M：分子量标准； 1, 4, 8, 9为含第 5外显子突变位点的特征条带， 2, 6-7为不含第 5外显子突变位点的特 征条带， 3, 5为杂合位点的特征条带） 图 A.4 Wxmw第 6外显子 分子标记检测的 电泳图谱 A.9.2 判定原则 用 A.5.1 中所述两种分子标记 Wxmq/Wxmp-O-F/O-R/I-F/I-R 和 Wxmq-F/R 分别对第 4 和第 5
21、 外显子突 变位点进行 PCR 扩增，仅可扩增得到含第 4 外显子突变位点的 DNA 特征条带，则判定为携带 Wxmp的 半糯粳稻，可扩增得到含第 4 和第 5 外显子两个突变位点的 DNA 特征条带，则判定为携带 Wxmq的半 糯粳稻，不能扩增得到含第 4 外显子突变位点的 DNA 特征条带，则判定待检样品中不含 Wxmq和 Wxmp 基因。 如用 A.5.2 中所述分子标记 Wxmw-O-F/O-R/I-F/I-R 对第 6 外显子突变位点进行 PCR 扩增，可扩增得 到含突变位点的 DNA 特征 条带，则判定为携带 Wxmw的半糯粳稻，不能扩增得到含突变位点的 DNA 特 征条带，则判定待检样品中不含 Wxmw基因。 _
