1、ICS 65.020.30 CCS B 43 DB32 江苏省 地 方 标 准 DB 32/ T 4016 2021 羊李斯特菌病诊断 技术 Diagnosis for goat and sheep listeriosis 2021 - 03 - 04 发布 2021 - 04 - 04 实施 江苏省 市场 监督 管理 局 发布 DB32/T 4016-2021 前 言 本 文件按照 GB/T 1.12020标准化工作 导 则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起 草 。 本 文件 由 扬州大学提出 。 本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口 。 本 文件 起草单位： 扬州 大学
2、、 江苏省动 物疫 病 预防 控制中心 。 本 文件 主要起草人： 殷月兰 、 焦新安 、 董永毅 、 陈祥 、 黄金林 。 DB32/T 4016-2021 羊李斯特菌病 诊断 技术 1 范围 本文件 规定了羊李斯特菌病的临床诊断、病理学诊断和实验室诊断的技术要求。 本 文件 适用于羊李斯特菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件 中的内容通过文中的规范性引用而构成文件 必不可少的 条款 。 其中， 凡是注日期的引用文 件，仅 该 日期对应的版本 适用于本文件 ； 不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验
3、单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB 19489 实验室生物安全通用要求。 3 术语 和 定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 李斯特菌病 listeriosis 由 李斯特 菌引起 人和动物的一种重要的 人兽共患 传染病 ，呈散发或暴发发生 ， 主要表现为 脑膜炎、 败血症 和怀孕母羊流产 。 3.2 李斯特菌溶血素 O listeriolysin O, LLO 单核细胞增生李斯特菌 和 伊氏李斯特菌 的主要毒力因子，对 真核细胞膜 具有裂解活性。 4 临床 诊断 单核细胞增生李斯特菌引起羊 李斯特菌病 的 临床 症状为 脑膜脑炎、 败血症和流产 。 发病初期 ，羊体 温升高 1 2 ，
4、采食、咀嚼、吞咽困难， 头颈呈一侧性麻痹，弯向对侧，做转 圈运动。 角弓反张，昏 迷卧于一侧，直至死亡 。病程短的 2 d 3 d，长的 1至 3周或更长时间 。 妊娠母羊流产， 羔羊常发生急性 败血症而很快死亡。 伊 氏 李斯特 菌 引起 羊李斯特菌病 的临床症状为胃肠炎、新生羊败血症和怀孕母羊流产， 罕见 病例呈 脑膜 脑 炎 相关的临床 表现 。 5 病理诊断 5.1 眼观病变 DB32/T 4016-2021 眼观病变 表现如下： a） 神经症状的病羊 ： 脑及脑膜充血、水肿，脑脊液增多，稍浑浊 ； b） 败血症型的 病羊 ： 肝脏 呈 多灶性坏死， 脾脏肿大，心外膜下出血 ； c）
5、流产母羊 ： 有胎盘炎，子宫内膜和胎盘充血及广泛坏死。 5.2 组织 病理学变化 血液中白细胞总数升高， 单核细胞增多， 炎性细胞灶 及 其邻近的血管周围 呈 套袖现象，占主导的细 胞是淋巴细胞 、 组织细胞 、 浆细胞； 脑干 嗜中性粒细胞 液化。 6 实验 室 诊断 6.1 细菌学诊断 6.1.1 细菌 分离和培养 无菌采取病羊的脑脊髓液、脑、肝、脾、心 、肺 和肾组织，置于放有冰袋的采样箱 中（温度低于 10 ） 于 24 h 之内运回实验室， 直接 涂片镜检， 取 样品直接 接种到 科玛嘉 平板上于 37 培养 24 h，同 时按 照附录 A 的方法进行增菌和鉴定；或按照 GB 478
6、9.30 推荐 的方法 进行增菌，转接到牛津琼脂平板 上，放置在 37 培养 ， 培养至 24 h 和 48 h 检查细菌 培养 情况。 6.1.2 菌落形态及 革兰氏染色 菌落形态： 李斯特菌在脑心浸液平板上培养 24 h后，形成直径约 为 1 mm 2 mm的乳白色菌落，边 缘整齐、表面光滑、隆起度高，粘稠、易挑起 （附录 A中 图 A.1） 。 在科 玛嘉培养基上形成的菌落呈蓝 绿 色 ，菌落周围有白色晕环 （ 见 附录 A中 图 A.2） 。 在含七叶苷的琼脂培养基（如 MOX平板 ）上 形成的 菌 落呈黑色 （ 见附录 A中 A.3） 。 革兰氏染色镜检： 革兰氏染色阳性 的小 杆菌
7、， 两端钝圆， 排 列 成 “V”型 或并列排成栅栏状 。 6.1.3 生化特性 根据 菌落特征选取 5个菌落 ， 观察细菌 形态 及 在血琼脂上 培养后 的溶血 活 性 ， 测定细菌 发酵葡萄糖、 麦芽糖、甘露醇、 鼠李糖 和木糖及水解 七叶苷的 能力 。 单核细胞增 生李斯特菌 和伊氏李斯特菌的生化特征如表 1所示。 表 1 李斯特菌的生化特 征 菌种 葡萄糖 麦芽糖 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷 -溶血 反应 协同溶血 反应 单核细胞增 生李斯特菌 + + - + * - + + -* 伊氏李斯特 菌 + + - - - + + + * *血清型 4h的单核细胞增生李斯特菌不能利用鼠李糖
8、 *血清型 4h的单核细胞增生李斯特菌协同溶血反应 呈 阳性 *在划线有马红球菌的血平板上 呈 铲型溶血 （ 见附录 A中 图 A.4） 6.1.4 毒力鉴定 将强毒 菌株 以 1106 CFU腹腔注射 小鼠 后 ，小鼠 14天 内 死亡 。小鼠 脾脏、 肝脏、 淋巴结、肺脏、肾 上腺、心肌、胃肠道中 有 较小的坏死灶 。 取心血、肝、脾直接做 涂 片， 镜检出 现大量呈 “V”型 或 栅栏状 DB32/T 4016-2021 的革兰氏阳性杆菌。 6.2 分子 生物学诊断 挑取细菌的菌落 作为 PCR 的 模板 ， 用 属 特异性 引物 PCR 扩增出 370 bp 的 条 带判定为李斯特菌属
9、； 用 单核细胞增生李斯特菌 特异性 引物 PCR 扩增出 660 bp 的 条 带判定为单核细胞增生李斯特菌；用 伊氏 李斯特 菌 特异性 引物 PCR 扩增 出 1100 bp 的 条 带判定为 伊氏李斯特 菌 （附录 B） 。 6.3 血清学 诊断 以 李斯特菌溶血素 O 作为 包被抗原、羊血清样品作为 第一 抗 体 、 酶标兔抗羊 IgG 作为 第二 抗 体 ， 建立 间接 ELISA 检测的 血清学方法 ，应用于 流行病学调查 ，具体操作和判定方法见附录 C。 7 结果 判定 综合临床诊断、病理学诊断及实验室诊断结果，报告羊是否发生李斯特菌病。 患病动物 表现神经症 状、败血症或流产
10、 、 体温升高 ， 血液中单核细胞增多 ，可疑为李斯特菌病。进一步 从病死羊中 分离鉴定 出单核细胞增生李斯特菌或伊氏李斯特菌， 可以确诊；若未分离到李斯特菌，但 患病一周后 的羊血清 间 接 ELISA测定结果阳性， 也 判定羊患有李斯特菌病。 8 安全措施 按照 GB 19489执行。 DB32/T 4016-2021 附 录 A （规范性） 李斯特菌的 分离与 鉴定 取 10 g 固体样品或 10 mL 液体样品（包括血液样品）放入 90 mL LEB 增菌液中（纱布、棉签直接 放入）， 30 培养 16 h。然后用接种环取培养液在 科玛嘉 显色 平板 上划线， 37 培养 24 h。选
11、取带白色 晕环的蓝绿色菌落在 脑心 浸 液培养基（ BHI） 平板上纯化培养，单菌落用于后期的进一步鉴定。 图 A.1 脑心浸液培养基（ BHI）上的单核细胞增生李斯特菌菌落 图 A.2 科玛嘉平板上的单核细胞增生 李斯特菌 菌落 DB32/T 4016-2021 图 A.3 MOX 平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落 图 A.4 血平板上的李斯特菌与马红球菌的协同溶血 试验 （ 图 A1、 A.3 和 A.4 为 伊氏李斯特菌； 图 A.2 为 单核细胞增生李斯特菌） DB32/T 4016-2021 附 录 B （规范性） PCR 方法 鉴定李斯特菌 B.1 PCR引物 B.1.1 李斯特菌
12、属鉴定引物： PseF： 5-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3 PseR： 5-CAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3 扩增 产物 长度为 370 bp B.2 PCR扩增 B.2.1 以 细菌 的 基因组为模板， 利用引物 PseF 和 PseR 首先对分离 菌株进行李斯特菌属的鉴定。 PCR 反 应体系 （ 50 L）：超纯水 34.6 L， 10Buffer（ 含 Mg2+） 5 L， dNTP 4 L， rTaq 酶 0.4 L，上下游引 物各 2 L， 模板 2 L； PCR 反应条件 ： 94 5 min； 94 50 s， 55 1 min， 72 1
13、min， 30 个循环 ； 72 10 min。 B.2.2 反应结束后， 扩增 产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，分离株鉴定为李斯特菌属后，继续用 2 种引物（ MonoA 和 LisB）和（ Ival 和 LisB）分别进行种鉴定， PCR 反应体系如下： 超纯水 27.75 L 10PCR 缓冲液 5 L dNTP (2.5 mM) 5 L MonoA、 Iva1 各 2 L LisB 4 L rTaq DNA 聚合酶 0.25 L DNA 模板 4 L 总的反应体系 50 L B.2.3 在 对 李斯特菌 进行 PCR的过程中， 若以菌落 为模板 做 PCR，则 DNA 模板体积为
14、0，以超纯水补齐 不足部分的反应体系 。细菌的加入方法为：用灭菌牙签挑取 菌落 ，转移至加有 50L 反应混合液的 PCR B.1.2单核细胞增生李斯特菌鉴定引物 ： LisB： 5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3 MonoA： 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 扩增 产物 长度为 660 bp B.1.3伊氏李斯特菌 鉴定 引物 : LisB： 5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3 Iva1： 5-CTACTCAAGCGCAAGCGGCAC-3 扩增 产物 长度为 1100 bp DB32/T 4016-2021 管中与管壁轻轻摩擦和搅动。 P
15、CR 反应条 件为： 94 5 min； 94 50 s， 58 1 min， 72 1 min， 30 个循环； 72 10 min。 B.2.4 反应结束后，产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。 反应的体系与条件参照李斯特菌属鉴定，其 中退火反应设为 58 ， 1 min。 用属鉴定引物 PCR 扩增出 370 bp 的 条 带判定为李斯特菌属；用单核细 胞增生李斯特菌鉴定引物 PCR 扩增出 660 bp 的带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌 鉴定 引物 PCR 扩增出 1100 bp 的 条 带判定为伊氏李斯特菌。 B.3 结果判定 若扩增出 370 bp 左右的条带，则对应
16、菌株 鉴定为 李斯特菌属 的细菌 ，如图 B.1 泳道 1 和 2 所示。 在扩增出李斯特菌属特异性条带的前提下，若扩增出 660 bp 的条带，如图 B.2 第 1 泳道所示，则为单 核细胞增生李斯特菌；若扩增出 1100 bp 的条带， 如图 B.2 第 2 泳道所示， 则为伊氏李斯特菌 。 图 B.1 李斯特菌属鉴定 PCR 扩增结果 图 B.2 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌种 PCR 扩增结果 DB32/T 4016-2021 附 录 C （规范性） 间接 ELISA 方法检测抗 LLO 的血清抗体 C.1 用 0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液将 LLO 蛋白稀释
17、，包被于 96 孔板中，包被量为 0.5 g/孔，于 4 过夜吸附。 C.2 次日用 PBST 洗涤 3 次 5 次，每次 5 min，拍干。 C.3 然后用 1% BSA 封闭，每孔 200 L， 37 作用 2 h，洗板同上。 C.4 加入待检血清（用 PBST 1:400 稀释），每孔 100 L，同时设立阴、阳性对照孔， 37 作用 2 h，洗 板同上。 C.5 加入 1:10000 稀释的酶标 第二抗体（ 兔抗羊 IgG） ， 37 作用 2 h，洗板同上。 C.6 加入 TMB 显色液，每孔 100 L， 37 避光显色 10 min；再加入 2 M 硫酸终止液终止反应，每孔 50 L。 C.7 用酶标仪检测 OD450值，计算 P/N 值 （ P 为待测血清的 OD450、 N 为阴性血清的 OD450） ，以 P/N2.1 判为阳性。 _
