1、DB23ICS 65.020.20CCS B 16黑 龙 江 省 地 方 标 准DB 23/T 2989 2021玉 米 线 虫 矮 化 病 病 原 长 岭 发 垫 刃 线 虫 鉴 定技 术 规 程 黑 龙 江 省 市 场 监 督 管 理 局 发 布2021 - 09 - 08 发 布 2021 - 10 - 07 实 施 DB23/T 2989 2021 I 前 言本 文 件 按 照 GB/T 1.12020 标 准 化 工 作 导 则 第 1部 分 ： 标 准 化 文 件 的 结 构 和 起 草 规 则 的 规 定起 草 。请 注 意 本 文 件 的 某 些 内 容 可 能 涉 及 专 利
2、 。 本 文 件 的 发 布 机 构 不 承 担 识 别 这 些 专 利 的 责 任 。本 文 件 由 黑 龙 江 省 农 业 农 村 厅 提 出 。本 文 件 起 草 单 位 ： 中 国 科 学 院 东 北 地 理 与 农 业 生 态 研 究 所 、 先 正 达 （ 中 国 ） 投 资 有 限 公 司 。本 文 件 主 要 起 草 人 ： 潘 凤 娟 、 李 峰 、 胡 岩 峰 、 刘 聃 、 陆 欣 春 、 严 君 、 邹 文 秀 。 DB23/T 2989 2021 1 玉 米 线 虫 矮 化 病 病 原 长 岭 发 垫 刃 线 虫 鉴 定 技 术 规 程1 范 围本 文 件 规 定 了
3、 玉 米 长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ Trichotylenchus changlingensis） 鉴 定 的 取 样 时 期 、取 样 方 法 、 仪 器 使 用 、 线 虫 分 离 、 线 虫 鉴 定 和 管 理 档 案 。本 文 件 适 用 于 玉 米 田 的 玉 米 线 虫 性 矮 化 病 病 原 玉 米 长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ T. changlingensis）的 鉴 定 。2 规 范 性 引 用 文 件下 列 文 件 中 的 内 容 通 过 文 中 的 规 范 性 引 用 而 构 成 本 文 件 必 不 可 少 的 条 款 。 其 中 ， 注 日 期 的 引 用 文
4、 件 ， 仅 该 日 期 对 应 的 版 本 适 用 于 本 文 件 ； 不 注 日 期 的 引 用 文 件 ， 其 最 新 版 本 （ 包 括所 有 的 修 改 单 ） 适 用 于 本 文 件 。GB/T295772013 腐 烂 茎 线 虫 检 疫 鉴 定 方 法SN/T1141 鳞 球 茎 茎 线 虫 检 疫 鉴 定 方 法3 术 语 和 定 义下 列 术 语 和 定 义 适 用 于 本 文 件 。3.1 长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ T. changlingensis）属 于 线 虫 门 （ Nematoda） 、 侧 尾 腺 纲 （ Secernentea） 、 垫 刃 目 （ T
5、ylenchida） 、 锥 科（ Dolichodoridae） 、 发 垫 刃 属 （ Trichotylenchus） 。3.2 玉 米 线 虫 矮 化 病由 线 虫 侵 染 玉 米 根 部 引 起 的 一 种 玉 米 苗 期 病 害 。 玉 米 4 5叶 期 症 状 明 显 ， 沿 着 叶 脉 方 向出 现 黄 色 或 白 色 失 绿 条 纹 ， 茎 基 部 组 织 纵 向 或 横 向 开 裂 、 呈 “虫 道 ”状 ， 大 部 分 植 株 茎 节 缩 短膨 大 ， 矮 缩 或 丛 生 ， 不 结 果 穗 或 果 穗 发 育 不 良 。4 取 样 时 期在 玉 米 4 5 叶 期 ，
6、玉 米 出 现 矮 化 症 状 时 取 样 。5 取 样 方 法采 用 对 角 线 五 点 取 样 法 ， 用 土 壤 取 样 器 采 集 疑 似 发 病 植 株 根 围 离 土 表 5 cm 15 cm的 土壤 约 500 g， 放 入 塑 料 袋 中 ， 检 测 前 土 样 保 存 在 4 8 条 件 ， 最 长 14 d。 取 样 应 在 土 壤 湿润 时 进 行 ， 避 免 在 土 壤 过 干 或 浸 水 时 取 样 。 取 样 调 查 参 见 附 录 A。 6 仪 器 用 具6.1 仪 器 DB23/T 2989 2021 2 正 置 显 微 镜 、 体 式 显 微 镜 、 PCR仪
7、 、 电 泳 仪 、 凝 胶 成 像 系 统 、 高 速 离 心 机 、 制 冰 机 、 纯水 仪 、 -80 冰 箱 、 移 液 枪 和 水 浴 锅 。6.2 用 具500目 土 样 筛 、 挑 针 和 玻 片 。7 线 虫 分 离线 虫 分 离 应 按 照 SN/T1141中 的 规 定 执 行 。8 线 虫 鉴 定8.1 形 态 学 鉴 定 8.1.1 标 本 制 作按 照 SN/T1141中 的 附 录 C的 要 求 执 行 。8.1.2 线 虫 形 态 观 察在 显 微 镜 下 观 察 ， 雌 虫 虫 体 较 长 ， 呈 圆 筒 状 ， 固 定 后 呈 C状 ； 唇 区 高 ， 缢
8、缩 明 显 ； 口 针细 长 ， 口 针 基 部 球 略 向 后 倾 斜 ， 侧 区 3 条 侧 线 ， 尾 亚 圆 柱 形 ， 末 端 光 滑 无 环 纹 。 雄 虫 虫 体 略小 于 雌 虫 ， 交 合 刺 发 达 ， 略 弯 曲 ， 引 带 发 达 ， 交 合 伞 起 始 于 交 合 刺 基 部 前 ， 包 至 尾 尖 。 对 线虫 标 本 的 形 态 观 察 ， 应 严 格 按 照 GB/T29577规 定 执 行 。 参 见 附 录 B。8.2 分 子 生 物 学 鉴 定依 据 形 态 学 鉴 定 结 果 ， 再 采 用 分 子 生 物 学 技 术 进 行 鉴 定 。 8.2.1 线
9、 虫 DNA 提 取将 线 虫 置 于 灭 菌 去 离 子 水 中 清 洗 ， 挑 取 单 条 线 虫 ， 切 成 2段 放 入 10 L裂 解 缓 冲 液 1PCRBuffer（ Mg2+） 和 6 g蛋 白 酶 K中 ， 液 氮 冷 冻 2 min， 反 复 冻 融 2 3 次 ， 60 水 浴 30 min，95 10 min， 12000 r/min离 心 10 min， 取 上 清 DNA提 取 液 ， -20 保 存 备 用 。8.2.2 线 虫 28S rDNA 测 序采 用 线 虫 通 用 引 物 D2A（ 5-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3） 和 D3B（
10、 D3B（ 5-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3） 扩 增 线 虫 的 28S rDNA序 列 ， 扩 增 产 物 约 900 bp。 PCR反 应 体 系 ： 44 L PCR Mix， 上 游 引 物 和 下 游 引 物 各 2 L， DNA模 板 约 10 ng。 反 应 条 件 95 4 min； 一 个 循 环 包 括 94 30 s， 55 45 s， 72 45 s， 共 40个 循 环 ， 最 后 72 10 min。PCR扩 增 产 物 经 回 收 克 隆 后 送 生 物 公 司 测 序 。 测 序 结 果 与 NCBI上 已 知 的 结 果 进 行 BLAST比
11、对 ， 与 长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ T. changlingensis） 序 列 相 似 度 应 在 99%以 上 。 参 见 附 录 C。 9 管 理 档 案内 容 包 括 土 样 取 样 时 间 和 方 法 、 土 壤 线 虫 分 离 方 法 、 长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ T. changlingensis）形 态 学 鉴 定 和 分 子 生 物 学 鉴 定 。 档 案 保 存 3年 以 上 。 DB23/T 2989 2021 3 附 录 A（ 资 料 性 ）玉 米 线 虫 矮 化 病 病 原 田 间 取 样 调 查 表A.1 玉 米 线 虫 矮 化 病 病 原 田 间 取
12、 样 调 查 表 参 见 表 A.1。表 A.1 玉 米 线 虫 矮 化 病 病 原 田 间 取 样 调 查 表时 间 样 品 编 号 取 样 地 点 玉 米 植 株 状 况 （ 1矮 化 、2叶 片 失 绿 、 3茎 基 部开 裂 ） 备 注 DB23/T 2989 2021 4 附 录 B（ 资 料 性 ）线 虫 形 态 特 征 测 计 值B.1 线 虫 形 态 特 征 测 计 值 参 见 表 B.1。表 B.1 线 虫 形 态 特 征 测 计 值测 量 指 标 雌 虫 雄 虫n 13 13L（ m） 861.4 1032.9 820.5 993.1a 33.2 38.1 31.8 38.
13、6 b 5.7 6.9 5.3 5.8c 13.1 16.2 11.3 15.9c 2.9 3.5 3.1 4.3V 43.5 58.2St（ m） 26.1 28.9 25.4 28.1DGO（ m） 2.0 4.9T（ m） 57. 2 73.8 55.6 77.1R 30 40SL（ m） 24.1 31.0GL（ m） 9.0 16.1 DB23/T 2989 2021 5 附 录 C（ 资 料 性 ）长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ T. changlingensis） 进 化 树C.1 长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ T. changlingensis） 进 化 树 示 意 图 参 见 图 C.1。 图 C. 1 长 岭 发 垫 刃 线 虫 （ T. changlingensis） 进 化 树
