1、 ICS 65.020.30 CCS B43 21 辽宁省 地方标准 DB21/T 3493 2021 牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术 操作规程 2021-08-30 发布 2021-09-30 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 DB21/T 3493 2021 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 起草单位： 辽宁省农业发展服务中心、辽宁省牧经种牛繁育中心有限公司 。 主要起草人： 李宁、刘
2、海军、刘全、黄承俊、杜学海、李傲楠、张文军、张丽君、赵刚、周成利、 唐学成、安辉。 本 文件 发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街 2号），联系电话： 024-23447862 起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市皇姑区辽河街 60号），联系电话： 024-81845035 DB21/T 3493 2021 1 牛体外受精胚胎生产及非手术法移植技术操作规程 1 范围 本文件规定了牛体外胚胎生产的卵母细胞采集、体外成熟
3、、体外受精、体外培养、胚胎质量鉴定、 胚胎冷冻、胚胎解冻和胚胎移植的技术要求。 本文件适用于牛体外胚胎生产及移植的技术操作。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4143 牛冷冻精液 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 25881 牛胚胎 NY/T 1572 牛胚胎移植技 术规程 DB21/T 1648 牛胚胎移植技术操作规程 3 术语和定义 没有需要界定的术语和定义 。 4 仪器与溶液 4.1 仪器设备 4
4、.1.1 二氧化碳培养箱 使用前在 38.5 、 5%CO2、饱和湿度条件下平衡 24 h 以上。 4.1.2 超净台 使用前 20 min，打开风机和紫外线灯对操作台面和在超净台中使用的器材进行表面灭菌，液体操 作时应点燃酒精灯。 4.1.3 恒温加热板，水浴锅 恒温加热 板、水浴锅的使用温度为 37 ，水浴锅中液体为蒸馏水 。 4.1.4 液氮罐 液氮含量不得低于容积的 1/3。 4.2 溶液 4.2.1 常用溶液 DB21/T 3493 2021 2 抗菌 生 理盐水（含青霉素和链霉素各 0.075 g/L）、采卵液、 成熟液（ M199）、精子洗涤液、受精 液（ BO液）、胚胎培养液（
5、 CR1aa） 、胚胎冷冻液、胚胎解冻液。 4.2.2 溶液配方 溶液的配方见附录 A。 4.2.3 溶液的制备 4.2.3.1 基础溶液配制 按所配制溶液的配方称量药品，然后用超纯水逐一进行溶解。配制完成后调节 pH值与渗透压， 用 0.22 m孔径滤膜除菌，在无菌环境下装瓶封口备用。各类溶液应按要求存放及保存，不应使用变质或过期的 溶液。 4.2.3.2 成品溶液配制 根据要求或试验设计，称量好所有药品后用基础溶液进行一次性溶解，然后用 0.22 m孔径滤膜除 菌备用。不用添加任何药品的成品溶液可直接使用。 5 卵母细胞的采集 5.1 活体采卵 5.1.1 供体牛的选择 卵巢发育良好的空怀
6、经产母牛。 5.1.2 供体牛的饲养管理 供体牛应摄入足够的优质干草、青贮或多汁饲料、精料以及清洁的饮水，保证日粮营养全面、均衡。 5.1.3 采卵频率 两个月采卵一次。 采卵前 48 h肌注 FSH进行卵泡的诱导发育。 5.1.4 采卵方法 于尾椎和荐椎结合处或第一与第二尾椎结合处注射 2.5 mL 5盐酸利多卡因进行硬膜外腔麻醉。将 带有超声波探头和采卵针（ 18 G或 21 G的一次性短针头）的采卵器插入到阴道穹隆处，通过直肠把握法 将卵巢贴在探头上，在 40 mmHg（ 18G）或 120 mmHg（ 21G）负压下，根据 B超屏幕上所显示的卵泡位置进 行穿刺。穿刺卵泡的表面直径为 2
7、 mm 8 mm。每头牛应单独采集，并标注好信息。采集后用采卵液洗管 3次，将收集的液体在 37 环境下，于 4 h内运回实验室。所用采卵液配方见附录 A中 A.1。 5.2 离体采卵 5.2.1 卵 巢的摘取 牛屠宰后 30 min内摘取卵巢，置于盛 37 抗菌生理盐水的保温杯中，在 4 h内运回实验室。如果时 间超过 4 h，可在 4 低温保存环境中运回实验室。 5.2.2 卵母细胞的采集 DB21/T 3493 2021 3 去除卵巢周围多余的组织，用 37 的抗菌生理盐水洗涤 5次 6次。将洗涤好的卵巢与抗菌生理盐 水一起置于 37 的恒温加热板上备用。采卵时，用消毒的纱布包裹住卵巢，
8、用配有 18号针头的 10 mL 注射器从侧面穿刺，吸取表面直径 2 mm 8 mm卵泡内的液体。可一次性将所有卵巢的卵泡液抽出，集中 捡卵；也可以每 5个 6个卵巢捡卵一次。 6 卵母细胞的体外成熟 6.1 成熟液的预平衡 取卵前 2 h，制备好成熟盘与洗涤盘（ 1 mL 2 mL成熟液 /次），于二氧化碳培养箱中预平衡，成熟 液配方见附录 A中 A.2。 6.2 卵母细胞的挑选 在室温下，选择形态正常、胞质均匀、周围带有致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合体，在成熟液中 洗涤 3次 5次，备用。 6.3 卵母细胞的培养 在室温下，将洗涤好的卵丘卵母细胞复合体置于预平衡的成熟液中，密度为 1枚 /
9、2.5 L或 50枚 /mL 100枚 /mL，在二氧化碳培养箱中培养 20 h 24 h。 7 卵母细胞的体外受精 7.1 受精用液的预平 衡 体外受精前 2 h，制备好受精微滴（ 50 L/滴，石蜡油覆盖）、 精子洗涤液 (6 mL)、受精液（ 8 mL） 、 卵子洗涤盘（ 1 mL 2 mL受精液 /次），于二氧化碳培养箱中预平衡。精子洗涤液配方见附录 A中 A.3 7.2 精子的体外获能 冷冻精液质量应符合 GB 4143的规定。将细管冻精在 37 水中解冻 10 s， 检查活力与密度后， 把精 液置于精子洗涤液中，以 45倾斜方式在二氧化碳培养箱中孵浴 1 h。 7.3 卵母细胞的处
10、理 将体外培养 20 h 24 h的卵母细胞在受精液中洗涤 3次 5次，洗涤过程中用 100 L的 移液枪 微量 去 除卵丘细胞，然后移入受精微滴中， 10枚 /滴 20枚 /滴。 7.4 精液的制备 孵浴后的精子取上 1/3 2/3液体，在 2000 r/min下离心 7 min，弃去上清液， 再用受精液洗涤 一次 ， 然后用受精液 调试 密度为 1106 6106个 /mL， 置于二氧化碳 培养箱中备用 。 7.5 体外受精 将制备好的精液用 100 L移液枪移入含有卵母细胞的微滴中（ 50 L/滴），于二氧化碳培养箱中培 养 6 h 8 h。 8 受精卵体外培养 DB21/T 3493
11、2021 4 8.1 培养液的预平衡 培养前 2 h，制备好培养微滴（ 100 L/滴，石蜡油覆盖）和洗涤盘（ 1 mL 2 mL培养液 /次）于二 氧化碳培养箱中预平衡。胚胎培养液配方见附录 A中 A.5。 8.2 体外培养 将体外受精 6 h 8 h后的假设合子置于培养液中洗涤 3次 5次，洗涤过程中用 100 L移液枪或吸卵 管吹打假设合子，去除周围残留的卵丘细胞和精子。将洗涤后的假设合子移入培养微滴中， 10枚 /滴， 置于二氧化碳培养箱中继续培养 6天 8天，中途可换液一次，也可不换，发育到桑囊胚阶段的胚胎，经 质量鉴定合格后，可进行鲜胚移植或冷冻保存。 9 胚胎质量鉴定 9.1 胚
12、胎发育阶段 胚胎发育阶段划分应符合 GB/T 25881中的规 定。 9.2 可用胚胎的判定 可用胚胎的判定应按照 DB21/T 1648中的要求。 9.3 胚胎等级评定 胚胎的等级评定应按照 GB/T 25881中的规定。胚胎质量分为 A、 B、 C、 D四个等级，其中 A、 B、 C级 为可用胚胎， A、 B级可用冷冻， C级只能鲜胚移植。 10 胚胎冷冻与贮存 10.1 胚胎冷冻保存所需溶液 胚胎冷冻保存所需溶液如下： a) 保存液：含有 0.4%牛血清白蛋白的 PBS液 b) 1.5 moL/L乙二醇冷冻液（含 0.1 moL/L蔗糖）：用保存液配制 c) 10%甘油冷冻液：用保存液配
13、制 10.2 胚胎洗涤 洗涤的胚胎应按照 DB21/T 1648中的规定。 10.3 胚胎平衡 胚胎的平衡应遵守 DB21/T 1648中的规定。 10.4 胚胎装管 将平衡后的胚胎装入 0.25 mL细管，装管顺序：冷冻液 气泡冷冻液加胚胎气泡 冷冻液。胚 胎装管的示意图见图 1。 DB21/T 3493 2021 5 标引序号说明： 1 棉塞； 2 冷冻液； 3 气泡； 4 冷冻液 +胚胎； 5 气泡； 6 冷冻液； 7 封口处； 8 标签 塞。 图 1 胚胎装管图 10.5 胚胎标记 在标签塞上或标签纸上依次标记生产单位、品种、供体牛号、公牛号、发育期、数量、质量和生产 日期等，乙二醇冷
14、冻的胚胎应标记直接移植“ DT”符号。如 1枚 A级桑椹胚表示为 1M1，其中 M表示发育期， M左侧 1表示数量，右下角数字 1表示质量。 10.6 胚胎冷冻 胚胎冷冻程序：冷冻仪（ 5 6） 放入胚胎细管 平衡 5 min 10 min 植冰 平衡 5 min 10 min 以 0.3 /min 0.5 /min的速率下降 30 35 平衡 5 min 10 min投 入液氮。 10.7 胚胎贮存 标记后的冷冻胚胎放入液氮罐的液氮中，液氮罐应符合 GB/T 5458的规定。 11 胚胎解冻 11.1 胚胎解冻所需溶液 11.1.1 保存液：含 0.4%牛血清白蛋白的 PBS液。 11.1.
15、2 解冻液： 1 moL/L蔗糖 /保存液。 11.2 胚胎解冻 不同冷冻液胚胎解冻方法。 a) 1.5moL/L乙二醇保存剂冷冻胚胎的解冻 胚胎细管空气浴（ 18 25 ） 8 s 10 s水浴（ 32 35 ） 10 s擦干细管剪去细 管塞装枪移植（胚胎解冻后 5 min内移入受体）。 b) 10%甘油保存剂冷 冻胚胎的解冻 胚胎细管空气浴（ 18 25 ） 8 s 10 s水浴 (32 35 )10 s擦干细管剪去细管 塞推出胚胎解冻液平衡 4 min 5 min保存液洗涤 5次 6次镜检装管装枪移植。 11.3 记录 牛胚胎冷冻解冻记录见附录 B中表 B.1。 12 移植胚胎 12.1
16、 受体牛的选择 12.1.1 良种牛胚胎受体牛的选择 受体牛的选择应按照 DB21/T 1648 中的规定。 12.1.2 商品用胚胎受体牛的选择 DB21/T 3493 2021 6 受体牛应达到体成熟，身体健康，繁殖性能正常。 12.2 受体牛的饲养管理 受体牛的饲养管理应按照 DB21/T 1648中的规定。 12.3 受体牛的同期发情和鉴定 受体牛同期发情的处理方法应符合 NY/T 1572中的规定。以受体稳定站立接受其他牛爬跨为发情。 对发情牛作进一步直肠检查以确认排卵时间（次日上午或晚上），如果发情 36 h以后排卵不能作受体。 12.4 受体牛的胚胎移植 12.4.1 移植前受体
17、牛的检查 12.4.1.1 对发情牛或发情处理的牛进行黄体直检，要求其直径在 11 mm 15 mm以上，手感弹性好，质 地软而充实。 12.4.1.2 对人工授精的牛进行授精记录核对，确保 移植当天处于人工授精后 6天 7天阶段。 12.4.2 胚胎发育周期与受体移植时间 胚胎发育周期与受体移植时间的对应关系见 NY/T 1572附录 F。 12.4.3 受体牛胚胎移植 受体牛胚胎移植的方法应按照 DB21/T 1648中的规定。 双胚移植时，两枚胚胎可以同时移植在黄体侧或黄体对侧，也可以分别移植在子宫角两侧，但应保 证有一枚胚胎移植在子宫角的深处（小弯）。 对人工授精后 6天 7天的牛进行
18、胚胎移植时，将胚胎移植在黄体对侧的子宫角深处（小弯）。 12.5 记录 受体牛胚胎移植记录见附录 B中表 B.2。 13 妊娠诊断 受体妊娠诊断的方法应符合 DB21/T 1648中的规定。 DB21/T 3493 2021 7 A A 附录 A （规范性） 溶液配方 A.1 采卵液配方见表 A.1。 A.1 采卵液配方 类别 成分 含量 基础液 M199 NaHCO3 2.200 g/L Pyruvic acid 0.110 g/L 青霉素 0.076 g/L 链霉素 0.050 g/L 采卵液 基础液 FBS 5% 肝素钠 30 g/mL Hepes 4.766 L 注 1： 液体 4保存
19、；基础液保存时间不超过 1个月；采卵液保存时间不超过 2个星期。 A.2 成熟液配方见表 A.2。 表 A.2 成熟液配方 类别 成分 含量 基础液 M199 NaHCO3 2.200 g/L Pyruvic acid 0.110 g/L 青霉素 0.076 g/L 链霉素 0.050 g/L 成熟液 基础液 FSH 10 g/mL LH 20 g/mL E2 1 g/mL 表 A.2 成熟液配方（续） DB21/T 3493 2021 8 类别 成分 含量 成熟液 FBS 10% 注： 液体 4保存； E2不需过滤；基础液保存时间不超过 1个月；成熟液保存时间不超过 1个星期。 A.3 精子
20、洗涤液配方见表 A.3。 表 A.3 精子洗涤液配方 类别 成分 含量 基础液 NaCl 6.550 g/L KCl 0.300 g/L CaCl2 2H2O 0.330 g/L NaH2PO4 H2O 0.113 g/L MgCl2 6H2O 0.106 g/L NaHCO3 3.104 g/L Glucose 2.500 g/L Pyruvic acid 0.137 g/L 青霉素 0.076 g/L 链霉素 0.050 g/L Phenol 100 l 精子洗涤液 基础液 不去脂 BSA 3 注：液体 4保存；基础液保存时间不超过 1 个月；精子洗涤液保存时间不超过 1 个星期；基础液
21、pH 7.8。 A.4 受精液配方见表 A.4。 表 A.4 受精液配方 类别 成分 含量 基础液 NaCl 6.550 g/L KCl 0.300 g/L CaCl2 2H2O 0.330 g/L 表 A.4 受精液配方（续） DB21/T 3493 2021 9 类别 成分 含量 基础液 NaH2PO4 H2O 0.113 g/L MgCl2 6H2O 0.106 g/L NaHCO3 3.104 g/L Glucose 2.500 g/L Pyruvic acid 0.137 g/L 青霉素 0.076 g/L 链霉素 0.050 g/L Phenol 100 l 受精液 基础液 肝素钠
22、 20 g/mL 去脂 BSA 6 注：液体 4保存；基础液保存时间不超过 1 个月；受精液保存时间不超过 1 个星期；基础液 pH 7.8。 A.5 胚胎培养液配方见表 A.5。 表 A.5 胚胎培养 液配方 类别 成分 含量 基础液 NaCl 6.700 g/L KCl 0.230 g/L NaHCO3 2.200 g/L L-乳酸半钙 0.550 g/L Pyruvic acid 0.020 g/L 青霉素 0.076 g/L 链霉素 0.050 g/L Phenol 100 l 胚胎培养液 基础液 去脂 BSA 3.000 mg/mL 必需氨基酸 2% DB21/T 3493 2021
23、 10 表 A.5 胚胎培养 液配方（续） 类别 成分 含量 胚胎培养液 非必需氨基酸 1% L-谷氨酰胺 0.150 mg/mL 注：液体 4保存；基础液保存时间不超过 1 个月；培养液保存时间不超过 2 个星期；基础液 pH 7.4。 DB21/T 3493 2021 11 B B 附录 B （资料性） 记录表 B.1 胚胎冷冻及解冻记录见表 B.1。 表 B.1 胚胎冷冻及解冻记录 供体号： 品种： 操作者： 冲卵结束时间： 冷冻时间： 防冻剂： 冷冻方法： 序 号 发育 阶段 级 别 特征 简图 Cane 号 码 简 号 解冻 温度 脱甘油 方 式 解冻后 形 态 培养 情况 用 途 备 注 B.2 受体牛胚胎移植记录见表 B.2。 表 B.2 受体牛胚胎移植记录 序 号 畜 主 受体牛 特 征 同期 发情 发情 日期 排卵 日期 黄体 发育 移植 时间 胚胎 等级 妊检 术者 移植 地点 备注
