1、ICS 65.020.01 CCS B 60 DB21 辽 宁 省 地 方 标 准 DB21/T 3429 2021 蒙古栎 SSR 分析技术规程 Technical Regulations of SSR analysis in Quercus mongolica 2021- 05 - 22 发布 2021 - 06 - 22 实施 辽宁省市场 监督 管理 局 发布 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 仪器设备及试剂 . 1 5 引物 . 2 6 溶液配制 . 2 7 分析程序 . 2 附 录 A （资料性） . 5 附 录
2、B （资料性） . 6 附 录 C （资料性） . 7 附 录 D （资料性） . 8 DB21/T 3429 2021 I I 前 言 本 文件 按照 GB/T 1.1的规则起草。 本 文件 由辽宁省林业和草原管理局提出并归口管理。 本 文件 起草单位：辽宁省林业科学研究院。 本 文件 起草人：陈罡 、 于世河 、 卜鹏图 、 郑颖 、 陆爱君 、 王占伟 、 王敬贤 、 庞忠义 、 赫亮 、 刘怡菲 、 高旭 、 李昀峰 、 扈延 伍 、 曹颖 、 刘金义 、 庞家举 、 许家铭 、 翟金凤 、 赵济川 、 战金伟 。 本 文件 发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电
3、和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省林业和草原局（ 辽宁省 沈阳市和平区太原北街 2号） ， 联系电话： 024-23448927。 文件 起草单位通讯地址： 辽宁省林业科学研究院 （辽宁省沈阳市 皇姑区 鸭绿江街 12号），联系电话： 024-82241813。 DB21/T 3429 2021 1 蒙古栎 SSR 分析技术规程 1 范围 本 文件 规定了蒙古栎 SRR分析技 术的定义和术语、仪器设备、溶液配制、引物和 分析 程序 。 本 文件 适用于 辽宁地区 蒙古栎的 SSR分析 。 2 规范性引用文件 下列文件
4、中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 28660 马铃薯种薯真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记 LY/T 2426 枣品种鉴定技术规 程 SSR 分 子标记法 LY/T 2756 白蜡品种分子鉴定方法 SRAP 分子标记法 3 术语和定义 下 列术语和定义适用于本 文件 。 3.1 简单重复序列 又称微卫星 DNA，是一类由 1 6个核苷酸为重复单位的长达几十至几百个核苷酸的串联重复序列。 3.2 聚合酶链式反应 在耐热 DNA 聚合酶作用下
5、，于体外快速大量特意扩增待定 DNA 序列的方法 。 3.3 引物 一条互补结合在模板 DNA 链上的短的单链，提供 3 -OH 末端作为 DNA 合成的起点，延伸合成模板 DNA 的互补链。 3.4 引物扩增 多态性 一对 引物在两个或两个以上不同材料基因组 DNA 之间 扩增，得到数目不同或长度不同的 DNA 片 段。 4 仪器设 备及试剂 DB21/T 3429 2021 2 仪器设备及试剂见附录 B。 5 引物 引物相关信息见附录 C。 6 溶液配制 溶液配制方法见附录 D。 7 分析程序 7.1 分析材料 采集 蒙古栎新鲜 幼嫩 叶片为材料提取基因组 DNA。选取适量样品装入冻存管，
6、液氮速冻 后 置于 -80 超低温冰箱保存备用。 7.2 DNA 的提取 a) 采用 CTAB 法提取 蒙古栎 基因组 DNA。将干净研钵、研杵、小匙、无水乙醇预先放入冰箱中 -20 预冷，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面， 再 用滤纸吸干水分。 b) 取 510 g 叶片在液氮中迅速研磨成粉状，迅速转至灭过菌的 1.5 mL 离心管中，加入 500 L 预热过（ 60 ）的 CTAB 提取液、 5 L 0.2% -巯基乙醇和 5 L RNase A(10 mg/mL) ，充分混匀后 放入 65 水浴 30 min。其间每隔 10 min 轻轻摇动混匀 2 次 3 次。 c) 取出离心管加 入 等
7、体积的氯仿 /异戊醇（ 24:1），轻轻颠倒混匀 10 min， 再 于台式冷冻离心机 上 10 000 g 离心 10 min。 d) 将上清液转入另一 新的 1.5 mL 离心管中，重复 c)步骤 12 次。 e) 移取上清液至另一已加入 2 倍体积预冷（ 0 以下）无水乙醇 的 1.5 mL 离心管中，轻轻颠倒混 匀，使 DNA 沉淀成絮状， -20 放置 30 min 以上。 f) 用钩状玻璃棒 轻轻挑 出絮状沉淀 并 置于 新的 1.5 mL 离心管中 。 如果样品 未 出现云雾状沉淀或 看不 清 沉淀， 10 000 g 离心 10 min， 再 收集沉淀。 g) 加入 1 mL1
8、.5 mL 70%无水乙醇浸泡洗涤沉淀，轻摇几分钟， 10 000 g 离心 10 min，收集沉 淀，重复 1 次。然后将离心管 水平放置 在清洁场所晾干或在超净工作台上吹干。 h) 风干后加入 100 L 灭菌的 TE 缓冲液溶解沉淀。 7.3 DNA 浓度的 检测和定量 用 TE 缓冲液配制 l g/mL 、 2.5 g/mL 、 5 g/mL 、 7.5 g/mL 和 10 g/mL 的 -DNA 分子 量标准溶液，各取 3 L -DNA分子量标准溶液和 3 L 步骤 7.2中提取的未知浓度 DNA溶液，在 1%琼脂 糖凝胶上电泳 15 min20 min，稳压 90 V，电泳缓冲液为
9、 1TBE ， 325 nm紫外灯下观察，照相， 检测提 取 DNA的质量 。 按照 GB/T 28660要求的方法，计算提取 DNA溶液的浓度。 7.4 PCR 反应 7.4.1 PCR 反应体系 DB21/T 3429 2021 3 在 4 条件 下进行操作。 15 L 反应总体系中，含有 10PCR 缓冲液 1.5 mmol/L， Mg2+ 1.5 mmol/L， dNTPs 0.3 mmol/L，正向、反向引物各 0.4 mol/L ， Taq DNA聚合酶 0.75 U， 模板 DNA 50 ng/L 。 7.4.2 PCR 反应程序 扩增程序首先 94 预变性 5 min；随后的
10、35个循环为 ： 94 变性 30 s，复性 30 s(不同 SSR引物所需 的退火温度见附录 C)， 72 延伸 30 s；最后 72 延伸 8 min， 4 保存 。 7.4.3 PCR 产物 的处理 PCR扩增反应结束后， 在 15 L 的反应体系中加入 5 L 的上样缓冲液， 充分 混匀后，备用。 7.5 PCR 产物检测 7.5.1 非变性 聚丙烯酰胺凝胶 电泳与银染检测 7.5.1.1 玻璃板的清洗 用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗 2次，再用无 屑纸巾沾取无水乙醇擦拭 2遍，置于通风橱内垂直晾干待用。 7.5.1.2 胶 槽 装配 a)
11、玻璃板的固定 将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭 干净 后置于 长板 玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地 压盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封 胶框中并用夹子固定在制胶板上。 b) 封胶 配制 1%的琼脂糖凝胶，煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现 气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注， 放置于温室下待其 凝固后 再 进行下一步操作。 7.5.1.3 丙烯酰胺胶的配制 在 30 mL 8%聚丙烯酰胺贮备液中加入 100 L 10% 过硫酸铵和 200 L 四甲基乙二胺，迅速轻轻混 匀。 7.5.1.4 灌胶 按照 LY/T 2756要求的方法进
12、行灌胶。灌胶后， 将梳子轻轻插入灌胶口中，室温凝固 30 min。 7.5.1.5 上 样和电泳 待凝胶完全凝固后，将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下，灌胶口向内用夹子固定在电泳槽 上，使用 1TBE 缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂 直缓慢将梳子从灌胶口中拔出，并用 1TBE 缓冲溶液清洗和整理样品槽。使用 200 L 移液器从左至右 逐个对点样孔进行吹打，直至点样孔内无碎胶、气泡以及其他杂质。取 5 L 步骤 7.4.3处理后的 PCR扩 增产物上样，并在胶板的一侧或适当位置的点样孔中加入 4 L 的 DNA Marker (DL2000 Mar
13、ker)作为对 照，电泳在 200 V稳压，电流 100 mA条件下进行，电泳时间约为 1.5 2 h。 7.5.1.6 卸胶 DB21/T 3429 2021 4 电泳结束，关闭电源，将上槽中 1TBE 缓冲液放出，取下固定的夹子， 去掉 下部琼脂糖，取 下 玻 璃板。将玻璃板水平放置， 用 起胶铲沿灌胶 口一侧 边缘 将玻璃板 缓慢撬起，将紧贴有凝胶的玻璃板放 入装有双蒸水的洗胶盘中 轻轻 摇晃，待凝胶与玻璃板 完全 分离 后 ，取出玻璃板，放净双蒸水。 7.5.1.7 银染 按照 LY/T 2426 要求的方法，对电泳样品进行银染检测。 7.5.1.8 谱带记录 参照 DNA Marke
14、r 电泳结果 或扫描结果，根据每对 SSR 引物从检测样品中扩增出的条带数以及分子 量大小，按 “ 有 ” 带 记录为 “1” 、 “ 无 ” 带 记录为 “0” 的方法 ， 仔细记录 每对 SSR引物的 PCR结果。 建立 SSR 引物、检测样品及有无（ 1/0）对应扩增条带数据库。 7.5.1.9 SSR 标记结果分析 利用相关统计分析软件，根据 Nei（ 1973）的遗传相似系数（ Genetic Similarity, GS）按式（ 1） 计算检测样品间的遗传相似性水平。采用非加权组平均法（ unweighted pair-group method with arithmetic me
15、ans, UPGMA）进行聚类分析；绘制聚类分析结果图，显示 SSR 标记的直观结果。 （ 1） 式中： GS 遗传相似系数， %； Ni 第 i 个样品的扩增条带数； Nj 第 j 个样品的扩增条带数； Nij 第 i 个样品和第 j 个样品共有的扩增条带数。 7.5.2 毛细管电泳荧光检测 7.5.2.1 样品准备 对 6-FAM和 HEX荧光标记的 PCR产物用超纯水稀释 30倍（注：不同荧光标记的扩增产物他的最适稀释 度通过预实验确定）。分别取等体积 的上述 2种稀释液混合，从中吸取 1 L 加入到 基因 分析仪专 用 96 孔板中，在各孔分别加入 0.5 L 的 ROX-500分子量
16、内标和 8.5 L 去离子甲酰胺，置于离心机中 1 000 g 下离心 10 s。将样品在 PCR仪上 95 变性 3 min后上机测序。 7.5.2.2 收集数据 启动 基因 分析仪，检查仪器工作状态后更换缓冲液。将装有样品的 96孔板置于样品架基座上，打开 数据收集软件。将电泳板信息等录入后，启动运行程序， 基因 分析仪自动收集毛细管电泳数据。将检测 得到的原始数据文件导入到分析软件 GeneMapper 3.2中 进行 自动分析。 8 分析和鉴定 用多对 SSR引物组合进行检测，将 不同种源或家系 待测样品的电泳结果 进行统计 ， 据 SSR位点的多 态 性， 从而 分析 不同 种源或家
17、系 间的 遗传组成差异 。 DB21/T 3429 2021 5 附 录 A （资料性） 原理 A.1 原理 SSR广泛分布于蒙古栎基因组中，不同蒙古栎种源 或 家系间每个 SSR位点重复单位的数量可能不 同。针对两侧序列高度保守的特点，设计一对特异引物。利用 PCR技术对重复序列进行扩增。在电泳过 程中，由于 SSR位点重复单位的数量不同引起的不同长度 PCR扩增片段在电场作用下得到分离，经硝酸 银染色或者荧光染料标 记加以区分。因此，根据 SSR位点的多态性，利用 PCR扩增和电泳技术，可以对 蒙古栎种源 或 家系间遗传组成差异进行分析。 DB21/T 3429 2021 6 附 录 B
18、（资料性） 仪器设备及试剂 B.1 主要仪器设备 PCR仪 、基因分析仪、 凝胶成像系统 、水平电泳槽及配套的制胶配件、垂直电泳槽及配套的制胶配 件、台式 低温高速冷冻离心机 、 超微量紫外 /可见分光光度计 、高压 灭菌锅 、液氮罐、超低温 冰箱 、高 压 电泳仪 、移液器、 超纯水 系统、水平摇床、电子天平、制冰机。 B.2 试剂 三羟甲基氨基甲烷（ Tris）、乙二胺四乙酸二钠（ EDTA-2Na）、十六烷基三乙基溴化铵（ CTAB）、 RNase A、氯仿、异戊醇、 -巯基乙醇 、硼酸、氢氧化钠、浓盐酸、溴化乙锭（ EB）、琼脂糖、 SSR引 物、 Taq DNA聚合酶 、四种脱氧核苷
19、酸（ dNTPs）、 10PCR 缓冲液 （含 Mg2+）、 -DNA分子量标准液 、 DNA Marker、丙烯酰胺、过硫酸铵（ APS）、 四甲基乙二胺（ TEMED)、甲醛、硝酸银、冰乙酸、无水乙醇、 甲叉双丙烯酰胺 、 ROX-500分子量内标、 离子甲酰胺 、溴酚蓝、二甲苯青、 DNA分析用光谱校 准基质（包 括 FAX、 HEX荧光标记 DNA片段）、 DNA分析仪专用电泳缓冲液。 DB21/T 3429 2021 7 附 录 C （资料性） SSR（简单重复序列） 标记 引物序列 表 C.1 SSR（简单重复序列） 标记 引物序列 位点 引物序列 （ 5 -3 ） 重复单元 片段
20、长度 (bp) 荧光 退火温度（） N1010265 F: AGACTCTCCGGATGCTCCTT (CAA)9 180-192 5 6-FAM 51 R: ATGCCGAACCCTAACCTCTT N1014482 F: GCCAATGTTGCTGAATTTCC (AAT)6 171-202 5 6-FAM 50 R: TCTAGCATGGACTGACGTGC N1105306 F: TCTTCTTCCAAACCTCGTCG (TTC)7 150-168 5 6-FAM 50 R: GGTTAGAACGGCATCATCGT N1110207 F: GTTCTGTACGAAGGCCGAAG
21、(CAA)8 164-183 5 6-FAM 52 R: CGGTGTTGGAGACACGTAAG N1345390 F: TTAGGAGGCGTGATCGTACC (GAC)7 135-153 5 6-FAM 50 R: AGACGAGCATTTCACAATCG N12361 F: GACACGTCACGACCACTCAC (CAAA)5 139-152 5 HEX 53 R: TTACGCAGAATGCCACTGTC N1247890 F: AGGGACACGTGCTCATTAGG (CTTT)6 185-205 5 HEX 54 R:CTCTACTCCGATCACTCCGC N14570
22、47 F: AGCACAAGCCAATGTAGAAGC (AAAT)5 156-171 5 HEX 50 R:TTTGGACAGCAACAACAACC N4544558 F: TTCTACTCTTGCCCTGGACG (AAT)6 168-182 5 HEX 52 R: TAAGGCCTGCAGAGTTGGAC N4529840 F: CCAGCTAAGACGCTCAATCC (TTC)5 200-215 5 HEX 51 R: AATCGAAACTCACTCCGTGG DB21/T 3429 2021 8 附 录 D （资料性） 主要试剂的配制 D.1 常用贮备液 D.1.1 0.5 mol
23、/L EDTA-二钠（ pH8.0）溶液 将 18.61 g 乙二胺四乙酸二钠溶于 80 mL H2O中，加入氢氧化钠（ NaOH）调节 pH至 8.0，用超纯水定 容至 100 mL，高压灭菌， 4 保存。 D.1.2 1 mol/L Tris-HCl（ pH8.0）溶液 将 24.22 g三羟甲基氨 基甲烷溶解于 160 mL水中，用浓盐酸（ HCl）调 节 pH至 8.0，用 超纯 水定容至 200 mL，高压灭菌， 4 保存 。 D.1.3 5 mol/L NaCl 溶液 将 58.44 g氯化钠（ NaCl）溶于 160 mL水中，定容至 200 mL，高压灭菌， 4 保存 。 D.
24、1.4 CTAB 提取缓冲液 缓冲 液成分为 2%（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺、 100 mmol/L Tris-HCl（ 1 mol/L pH8.0） 、 20 mmol/L EDTA（ 0.5 mol/L， pH8.0） 和 1.4 mol/L NaCl（ 5 mol/L）。在 500 mL超纯 水中加入 20 gCTAB， 搅动溶解后 ， 加入 100 mL 1 mol/L Tris-HCl（ pH8.0） 、 40 mL 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0） 和 280 mL 5 mol/L NaCl， 定容至 1 L， 高 压 灭菌 ， 4 保存。 D.1.5 TE（ pH
25、8.0）缓冲液 取 1 mol/L Tris-HCl（ pH8.0） 1 mL， 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0） 0.2 mL，用水定容至 100 mL，高压 灭菌， 4 保存。 D.1.6 10 mol/L NaOH 溶液 称取 80 g氢氧化钠（ NaOH），先用 160 mL水溶解后，在加水定容至 200 mL，高压灭菌，室温保存。 D.1.7 EB（ 1 mg/mL）溶液 取 0.05 g溴化乙锭（ EB）用 50 mL水溶解，用铝箔或黑纸包裹容器，室温保存，工作浓度为 1 mg/mL。 D.1.8 6DNA 上样电泳缓冲液 (DNA Lording Buffer) 6D
26、NA Lording Buffer ，其中含 0.05%（质量分数）溴酚蓝、 0.05%（质量分数）二甲苯青、 30 mmol/LEDTA、 36% （质量分数）甘油和 ddH2O。使用时按照每 5 L DNA 样品加入 1 L DNA 上样缓冲 液的比例，混 匀 DNA 样品和 DNA 上样缓冲液 后 ，直接加到点样孔即可。 D.2 琼脂糖凝胶 电泳溶液 的配制 称取 1 g电泳级琼脂糖 置 于 200 mL三角瓶中，加入 100 mL 1TBE 电泳缓冲液，在微波炉中熔化至溶 液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至 50 60 ，加入 EB（ 1 mg/mL）溶液使其终浓度 为 0
27、.5 g/mL ，混匀后倒入放好梳子（距底板约 1 mm）的载 板 上，凝胶厚度为 3 mm5 mm，待凝胶完全 凝固后放入电泳 槽中，然后向槽内加入 1TBE 稀释缓冲液至液面刚好没过胶 板 上表面。 DB21/T 3429 2021 9 D.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 D.3.1 40%丙烯酰胺贮备液 分别称取丙烯酰 胺 380g 和甲叉双丙烯酰胺 20 g， 用 灭菌双蒸水定容至 1000 mL, 混匀，过滤。于 棕色瓶中室温保存 。 D.3.2 10%过硫酸铵溶液 称取过硫酸铵 1 g, 用 灭菌双蒸水定容至 10 mL， 4冰箱 保存 （ 现用现配 ）。 D.3.3 10
28、 倍 三羟甲基氨基甲烷 -硼酸 -乙二胺四乙酸缓冲液（ 10 TBE 缓冲液 ） 分别称取 Tris 碱 108 g 和 硼酸 55 g，再加入 0.5 mol/L EDTA（ pH8.0） 40 mL，用灭菌双蒸水 定容 至 1000 mL，混匀，室温保存。 D.3.4 8%非变性聚丙烯酰胺工作液 分别量取 40%丙烯酰胺贮备液 10 mL， 10TBE 5 mL ， 10%过硫酸铵 100 L ， 四甲基乙二酸 200 L 和 双蒸水 35 mL，混匀后 4 保存备用。 D.4 银染试剂配制 D.4.1 固定 /脱色液 量取 100 mL 冰乙酸 ，加灭菌双蒸水定容至 1000 mL（ 现用现配 ）。 D.4.2 硝酸银染色液 称取 3 g 硝酸银，加灭菌双蒸水定容至 500 mL，加入 1.6 mL 37%甲醛 ，混匀。 D.4.3 氢氧化钠显影液 称取 10 g 氢氧化钠，加入 500 mL 灭菌双蒸水， 在 4 冰箱预冷 30 min 后，加入 2 mL 37%甲醛 ， 混匀（ 现用现配 ）。 _
