1、 ICS 65.020.30 CCS B41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 21952021 规模化牛场牛病毒性腹泻-黏膜病净化技术 规范 Technical Regulation of Eradication of Bovine viral diarrhea in Cattle Farms 2021-05-25发布 2021-06-25实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发布 DB15/T 21952021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020 标准化工作导则 第1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（ SAM/TC
2、19）归口。 本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、内蒙古农业大学、内蒙古蒙 牛乳业（集团）股份有限公司研究院、华威特（江苏）生物制药有限公司、赤峰圣泉生态牧业有限公司。 本文件主要起草人：王炜、王永杰、徐晓静、赵杰军、程晓飞、贺永强、张福隆、田茂、葛旭升、 李庆东、王洪、闫喜军、王潇、李光鹏、胡薇。 DB15/T 21952021 1 规模化牛场牛病毒性腹泻-黏膜病净化技术规范 1 范围 本文件规定了规模化牛场牛病毒性腹泻 -黏膜病净化的检测方法，无疫场群的建立、维持及综合生 物安全措施。 本文件适用于规模化牛场牛病毒性腹泻- 黏膜病的检测及免疫无疫场的建立。 2 规
3、范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18637-2018 牛病毒性腹泻 /粘膜病诊断技术规范 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 农医发2017 25号 病死及病害动物无害化处理技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛病毒性腹泻-黏膜病 Bovine viral diarrhea-mucosal disease 由牛病毒性腹泻病毒引
4、起的牛的传染病。 3.2 净化 Eradication 对规模化牛场采取一系列措施，达到清除牛病毒性腹泻- 黏膜病的过程。在某一限定的牛场内，根 据牛病毒性腹泻病毒的监测结果，及时发现并淘汰持续性感染（Persistent infection， PI）牛，使规 模化牛场中牛病毒性腹泻- 黏膜病逐渐被清除的疫病控制方法。 4 材料与方法 4.1 仪器 PCR仪、凝胶成像系统、高速台式冷冻离心机、组织研磨器或者研钵、普通冰箱、微量移液器、酶 标仪、恒温箱、高压灭菌锅。 4.2 试剂 DB15/T 21952021 2 RNA提取试剂盒；反转录酶、聚合酶，-20 保存，避免反复冻融；除非另有说明，在
5、检测中使用 的试剂均为分析纯；实验室用水应符合GB/T 6682 的要求。 4.3 检测方法 4.3.1 抗原检测 根据情况，选择下列之一或组合方法进行检测。 4.3.1.1 荧光定量PCR 参照GB T 18637-2018， 6.3 荧光 RT-PCR检测方法。 4.3.1.2 RT-PCR检测 采用附录A RT-PCR 检测方法进行检测。 4.3.1.3 ELISA检测 采用商品化抗原捕捉 ELISA方法。 4.3.2 血清学检测 参照GB/T 18637 -2018，6.2 病毒中和试验部分或 6.4部分 BVDV 抗体间接ELISA 试验方法进行检测。 4.3.3 合格免疫抗体判定标
6、准 4.3.3.1 个体免疫抗体合格标准，采用病毒中和试验，参照 GB/T 18637-2018，6.2 病毒中和试验部 分或 6.4 部分 BVDV 抗体间接 ELISA 试验方法进行检测。血清 BVDV 效价不低于 1:256。 4.3.3.2 群体免疫抗体合格标准，抗体效价不低于 1:256 的群体阳性率不低于 90 %。 5 净化群的建立 5.1 净化策略 5.1.1 采用 BVDV 疫苗免疫结合检测、淘汰持续性感染牛的净化策略。 5.1.2 做好引种监测，引进的牛应为抗原抗体阴性。 5.1.3 综合生物安全措施保障到位。 5.2 感染状况普查阶段 5.2.1 采样方法 5.2.1.1
7、 采血 颈静脉或尾根分别采集抗凝血和促凝血，集中采集，每样不少于 5 mL，标记清晰。抗凝血用于抗原 检测；促凝血分离血清用于抗体检测。送检时需提供样品清单，包括样品供体的日龄、编号、免疫情况、 临床健康状况等。 用猪耳断屑器从每头牛的耳廊腹部采取三角形的皮肤活组织样品，大小约为 125 mm2，然后用裹 有医用纱布的回形针压在取样部位止血。 DB15/T 21952021 3 5.2.2 采样数量 首次全群采样普查。之后新生犊牛、 1月龄犊牛全部采样，免疫牛按5 % 10 %抽样比例采样。 5.2.3 净化方案 5.2.3.1 群体血清样品抗体阳性率不超过 20 %，采用全群普查筛查、淘汰
8、PI 牛的策略。 18 月龄以下 牛定期进行抗原、抗体监测，评估 BVDV 感染风险。新生犊牛用商品化 ELISA 法或 PCR 法进行抗原检测， 淘汰 PI 牛。 5.2.3.2 群体血清样品抗体阳性率超过 20 %， 全群普查筛查、淘汰 PI 牛，并进行全群免疫接种、监 测。 5.3 免疫间断 5.3.1 疫苗 商品化灭活疫苗或亚单位疫苗。 5.3.2 免疫程序 根据疫苗免疫后抗体监测情况确定免疫程序。可以参考如下免疫程序：群体抗体阳性率20 %的牛 场，进行春秋两季普免；3 4月龄犊牛免疫；青年母牛在配种前6 8周首免，配种前2 4周进行二免， 以后每年在配种前2 4周免疫 1次。 5.
9、3.3 检测评估 二免后 28日检测抗体。如果 90 %的样品抗体不低于 1:256，即可认为群体免疫合格。 5.4 检测与淘汰阶 5.4.1 首次检测 5.4.1.1 疫苗二免后 28 日，采用 ELISA 方法逐个检验，了解全群 BVDV 免疫状况，结合 ELISA 或 PCR 法检测疑似 PI 牛。对检测的抗原、抗体均为阴性的牛隔离饲养，以备复检。 5.4.1.2 对步骤 5.4.1.1报告的抗原抗体阴性牛只复查，采用 ELISA或 PCR法检测抗原，与步骤 5.4.1.1 间隔时间 35 周，确保潜在 PI 牛不遗漏，淘汰复检抗原阳性的牛。 5.4.2 定期检测 5.4.2.1 新生犊
10、牛，逐个检验，采集耳朵皮肤组织用 ELISA 方法或 RT-PCR 检测抗原，抗原阳性者淘汰。 5.4.2.2 1 月龄犊牛，按照上述方法复检，逐个检验，淘汰抗原阳性牛。 5.4.2.3 疫苗免疫后 30 日左右，按 5 %10 %抽查抗体，每年二次，常规检验。 5.5 净化场的评估阶段 5.5.1 评估时间 在进入“假定健康阶段”后，按照免疫无疫标准、净化标准进行净化场评估。 5.5.2 免疫无疫标准 DB15/T 21952021 4 5.5.2.1 免疫后每年检测 1 次，抗体阳性率不低于 90 %。 5.5.2.2 每年随机按 5 %10 %抽检一次， ELISA 抗原初筛和 3 周后
11、复检，确保连续两年以上无 PI 牛。 5.5.3 净化标准 5.5.3.1 BVDV PCR 或 ELISA 抗原检测阴性。 5.5.3.2 停止免疫两年以上，无牛病毒性腹泻 -黏膜病抗原阳性牛。 6 净化场的维持阶段 6.1 免疫 制定并实施合理的免疫程序。 6.2 监测 6.2.1 每年随机按 5 %10 %抽检一次，抗体不低于 1:256，群体阳性率不低于 90 %。 6.2.2 出生犊牛抗原检测阴性。 6.2.3 严格检疫引进牛只，逐头检测，确保抗原阴性。 6.2.4 建立专门隔离饲养舍，引进后隔离饲养 45 日 以上经检测合格后才可混群饲养。 7 综合生物安全措施 7.1 合理的牛场
12、选址 根据国家和内蒙古自治区动物防疫合格证有关条件要求进行。 7.2 生产模式 坚持自繁自养，如必须从场外引进，做好隔离检疫。 7.3 饲养管理 加强饲养管理，减少应激。做好通风、保温、适宜的饲养密度。 7.4 消毒措施 严格做好人员、物品、用具、车辆、内外环境以及粪便排泄物和污水的消毒。定期进行消毒，在出 入口设置消毒池。 7.5 无害化处理措施 7.5.1 粪便处理按 NY/T 1168 的规定执行。 7.5.2 病死畜无害化处理按农业农村部发布的病死及病害动物无害化处理技术规范执行。 7.6 有害生物防治措施 禁止在场内饲养犬、猫等其它易感动物。每6 个月至少开展 1次 全方位彻底灭鼠。
13、定期杀虫、防蝇。 DB15/T 21952021 5 7.7 其他生物安全措施 7.7.1 设立隔离区和隔离屏障。 7.7.2 严禁抗原阳性牛的引入。 7.7.3 病牛隔离区设于牛舍的下风口。 7.8 档案管理 7.8.1 做好生产记录、饲料和饲料添加剂购进和使用记录、兽药购进和使用记录、免疫记录、消毒记 录、病死牛无害化处理记录、防疫监测记录、疾病诊疗记录、运输车辆记录、粪便及污物无害化处理记 录、人员车辆物品出入登记记录和销售记录等。 7.8.2 记录保存不少于 2 年。 DB15/T 21952021 6 附录A （规范性） BVDV RT-PCR检测方法 A.1 引物序列 BVDV病毒
14、核酸 RT-PCR检测方法所用引物序列见表A.1。 表A.1 引物序列 引物名称 引物序列 扩增长度/bp BVDV F 5-CATGCCCATAGTAGGAC-3 288 BVDV R 5-CCATGTGCCATGTACAG-3 A.2 RT-PCR 提取RNA ，取每份样品的 RNA 5.0L，置 0.2 mL灭菌离心管中，加入下游引物 1.0L ，混匀， 70 作用5 分钟，取出，冰浴2 3分钟。然后加入下列反转录体系。反转录反应条件：混匀后置于 42作用1 小时，70 作用 10分钟。反转录获得的 cDNA用于 PCR扩增或置 15 以下保存备用。 BVDV病毒核酸反 转录反应液配方见
15、表 A.2。 RT-PCR反应液配方见表 A.3。RT-PCR 反应参数见表 A.4。 表A.2 反转录反应液配方 反应液组分 体积 dNTP（2.5mmol/L ） 5.0 L 5反转录缓冲液 5.0 L RNA 酶抑制剂 1.0 L M-MLV 反转录酶 1.0 L DEPC 处理水 2.0 L 总体积 14.0L 表A.3 RT-PCR反应液配方 反应液组分 体积 cDNA 1.0 L 10PCR 缓冲液 5.0 L 2.5mmol/L dNTP 3.0 L 20pmol/ L 上游引物 0.5 L 20pmol/ L 下游引物 0.5L DNA 聚合酶 0.5 L DEPC 处理水 39.5L 总体积 50.0L DB15/T 21952021 7 表A.4 RT-PCR反应参数 预变形 扩增 循环数 延伸 95，1min 94，30s ； 53 -58，30s ； 72，1min 30 72，10min
