1、 ICS 65.100.01 CCS Z18 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 21122021 土壤中土 霉素、 四 环素、 金 霉素残留 量的测 定 高效液 相色谱法 Determination of oxytetracyline，tetracyline and chlortetracyline residuescontent inSoilHPLC method 2021-03-25 发布 2021-04-25 实施 内蒙古自 治区市 场 监督管理 局 发 布 DB15/T 21122021 I 前 言 本文件 按照GB/T 1.12020 标准 化工 作导则 第1 部分： 标准化
2、 文件 的结构 和起草 规则 的规 定 起草。 本文件 由赤 峰市 农牧 科学 研究院 提 出。 本文件 由内 蒙古 自治 区畜 牧业标 准化 技术 委员 会（SAM/TC19） 归 口。 本文件 起草 单位 ：赤峰 市农 牧 科学 研究 院。 本文件 主要 起草 人： 邓 宇、 文 辉、 王岩 、 乌 仁图 雅、 荣 迪、 李宝 栋、 王盛 男、 陈 琪、 赵剑 平、 娜日 娜、曲 颖超 、李 雯雯 、索 力墨、 红敏 、巴 图、 刘汉 宇、张 智勇 。 DB15/T 21122021 1 土 壤中土 霉素、四 环素、 金霉素残 留量的 测定 高效 液相色 谱法 1 范围 本文件 规定 了土
3、 壤中 土霉 素、四 环素 和金 霉素 残留 量的高 效液 相色 谱检 测方 法。 本文件 适用 于土 壤中 土霉 素、四 环素 和金 霉素 残留 量的测 定。 2 规范性 引用 文件 下列文 件中 的内 容通 过文 中的规 范性 引用 而构 成本 文件必 不可 少的 条款 。 其 中 ， 注日 期的 引用 文件 ， 仅该日 期对 应的 版本 适用 于本文 件； 不注 日期 的引 用文件 ， 其 最新 版本 （包 括所有 的修 改单 ） 适 用 于 本 文件。 GB/T 6682 分析 实验 室用水 规 格和 试验 方法 NY/T 395 农田 土壤 环境质 量 监测 技术 规范 3 术语和
4、定义 本文件 没有 需要 界定 的术 语和定 义。 4 原理 试样经Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇溶 液提取 定容 ，HLB 固相萃 取小柱 净化， 经高 效液相 色谱仪 测定 ， 外标法 定量 。 5 试剂和 材料 5.1 除另有 说明 外， 所用 试剂 均为分 析纯 ，水 为 GB/T 6682 中规 定的 一级 水。 5.2 乙腈（C2H3N ） ：色 谱纯 。 5.3 甲醇（CH4O ） ：色 谱纯 。 5.4 磷酸氢 二钠 （Na2HPO412H20） 。 5.5 乙二胺 四乙 酸二 钠（Na2EDTA2H20） 。 5.6 柠檬酸 （C6H807H20） 。 5.7 水合
5、草 酸（C2H2O42H20） 。 5.8 磷酸氢 二钠 溶液 （0.4 mol/L）： 称 取 143.26 g 磷酸 氢二钠 ，用 水溶 解， 定容 至 1000 mL 。 5.9 乙二胺 四乙 酸二 钠溶液 （0.1 mol/L）： 称 取 37.22 g 乙二胺 四乙 酸二 钠， 用水 溶解， 定容 至1000 mL。 DB15/T 21122021 2 5.10 柠檬酸 溶液 （0.2 mol/L）： 称 取 42.03 g 柠檬 酸， 用水溶 解， 定容 至1000 mL 。 5.11 磷酸氢 二钠- 柠 檬酸 （Mcllvaine ） 缓冲 液（pH=6.80.05）： 将 10
6、00 mL 0.4 mol/L 磷酸 氢二钠 溶液（5.8 ）与294 mL 0.2 mol/L 柠檬 酸溶 液（5.10 ）混 匀。 5.12 Na2EDTA-Mcllvaine- 甲醇 提取液 ： 取Na2EDTA2H20 （5.5 ） 、 磷 酸氢 二钠-柠 檬 酸（Mcllvaine）缓 冲液（5.11 ） 和甲 醇按 1+1+2 （体 积） 比例 混匀 ，必要 时用 NaOH 溶液 或HCl 溶液 调节 pH=7.200.05 。 5.13 草酸溶 液（0.01 mol/L）： 称 取 1.26 g 草酸 ，用 水溶解 ， 定容至 1000 mL 。 5.14 甲醇- 水（1+19）
7、： 量 取 5 mL 甲醇 与 95 mL 水混 匀。 5.15 草酸- 甲 醇溶 液（0.01 mol/L）： 称 取 1.30 g 草酸 ，用 甲 醇溶 解， 定容至 1000 mL。 5.16 土霉素 （oxytetracycline ）标准 物质 ：纯 度大 于等 于 96.5 % 、 四环 素（tetracycline）标 准物 质：纯 度大 于等 于 94.2 % 、金霉 素（chlortetracycline）标 准物 质： 纯度 大于 等于 99.5 % 。 5.17 土霉素 、四环 素、 金霉素 标准储 备溶液 （2.00 mg/mL） ：准确 称取 一定量 的土 霉素、 四
8、环素 、 金 霉素标 准物 质（5.16 ）于100 mL 容 量瓶 中， 分别 用 甲醇溶 解 定容 ，于 0 4 保存, 存储期 1 个月 。 5.18 土 霉 素、 四环 素、 金霉 素混 合 标准 溶液 （100 g/mL）： 分 别 取 5 mL 土霉 素、 四 环 素、 金霉 素标 准储备 液（5.17 ）至 100 mL 容量 瓶中 ，用 甲醇 稀释 至刻度 ，混 匀， 储存 于冰 箱0 4 保 存, 存 储期 1 个 月。 5.19 土霉素 、四环 素、 金霉素 混合标 准溶液 使用 液（20 g/mL） ：吸 取土霉 素、 四 环素、 金霉素 混 合 标准溶 液（5.18 ）
9、10 mL 至 50 mL 容量 瓶中 ，用 Na2EDTA-Mcllvaine-甲 醇提 取液（5.12 ） 稀释 至刻 度， 混匀， 储存 于冰 箱 0 4 保存,存储期 1 个月 。 5.20 固相萃 取柱 （N- 乙烯 基吡 咯烷酮 和二 乙烯 苯的 共聚 体-HLB 或相 当者 ） ：60 mg/3 mL 。 使用 前依次 使用5 mL 甲 醇及 5 mL 水 预处理 ，保 持柱 体湿 润。 5.21 针式过 滤头 ：0.22m（有机 相 ） 。 6 仪器和 设备 6.1 超高效 液相 色谱 仪： 配紫 外检测 器或 二极 管阵 列检 测器。 6.2 天 平 ：感量 0.01 g ，
10、0.00001 g 。 6.3 低温冷 冻离 心机 ：转 速大 于3500 r/min 。 6.4 恒温水 浴振 荡器 ：振 荡频 次不小 于 300 r/min 。 6.5 氮吹仪 。 6.6 固相萃 取装 置。 6.7 真空泵 。 6.8 pH 计： 测量 精度 0.02 。 6.9 容量瓶 ：玻 璃，10 mL，50 mL ，100 mL ，1000 mL。 DB15/T 21122021 3 6.10 具塞离 心管 ：50 mL 。 6.11 移液枪 ：量 程20 L ，100L，1000 L。 6.12 漩涡混 匀仪 ：振 荡频 率不 小于 2800 r/min。 6.13 样品筛
11、：0.5 mm 。 7 分析步 骤 7.1 样品采 集 土壤样 品采 集按 照NY/T 395 的规 定执 行。 7.2 样品制 备 土壤样 品采 集后 去除 杂质 ， 在 室温条 件下 自然 风干 ， 粉 碎， 全部通 过0.5 mm样 品 筛（6.13），密 封 保存。 7.3 提取 称取过筛样品1 g 2 g （精确至0.01 g ）于50mL 具塞离心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaine- 甲醇提 取液 （5.12），室 温 振荡20 min （6.4），于 3500 r/min 离心10 min， 取 上清液 至另 一离 心管 中。 残渣中 再依次 加入20 mL
12、、10 mL Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提 取液（5.12 ），重 复提取 两次， 合并 上 清 液并定 容至50 mL 。 7.4 净化 移取上 清液5 mL于 具塞离 心管中 ，置于 氮吹 仪上，40 浓 缩至原 体积 的一半 左右， 加适量 水稀 释 至体积约5 mL ，控制 流速 以1 mL/min 的速 度通过已 活化处理的HLB 固相 萃取柱 ，用5 mL 甲醇- 水(5.14) 淋洗固 相萃取 柱， 弃去全 部流出 液。真 空抽 干10 min ，用5 mL草酸-甲醇 （5.15 ）洗脱 液洗 脱，收 集洗 脱液并 在40 氮 吹浓 缩至近 干 ， 用2.00 mL
13、Na2EDTA-Mcllvaine- 甲 醇提 取液 （5.12） 涡旋 溶解 残渣 ， 过 0.22 m滤膜 （5.21 ）进 行 测定。 7.5 测定 7.5.1 液相色 谱仪 参考 条件 色谱柱 ：C18 色谱 柱， 柱长250 mm ， 内径4.6 mm ， 粒径5.0 m 。 流动相 及梯 度洗 脱条 件： 见表1 。 流速：1.0 mL/min。 检测波 长：355 nm。 柱温：30 。 进样量 ：20 L 。 DB15/T 21122021 4 表1 流动相 及梯 度洗 脱条 件 时间 min 流动相 乙腈（5.2 ） % 流动相0.01 mol/L 草酸(5.13) % 流动
14、相 甲醇(5.3) % 0 22 8 84 8 2223 15 70 15 2332 15 70 15 3233 8 84 8 3335 8 84 8 7.5.2 液相色 谱测 定 分别移 取不 同体 积20 g/mL 混 合标 准溶 液使 用液 （5.19）于10 mL 容量 瓶中， 用Na2EDTA-Mcllvaine- 甲醇提 取液 （5.12 ） 定容 至刻 度， 逐级 稀释 配制 成0.1g/mL 、1.0 g/mL 、2.0 g/mL 、5.0 g/mL 、10.0 g/mL 和20.0g/mL 的 系列 标 准工 作液， 进样 测定。 以 色 谱峰 面积 进行 外标 法定 量。
15、标准 工作 液及 试样 液 中 土霉 素、 四 环素、 金霉素 的 响应 值均 应在 仪器 检测 的 线性 范围 之内。 试样浓 度 不在 线性 范围 内时 将 样品稀 释后 进样 。标 准品 液相色 谱图 参见 附录A。 7.5.3 空白试 验 除不加 样品 外， 其余 均按 照上述 测定 步骤 进行 。 7.5.4 定性分 析 在仪器 最佳 工作 条件 下， 按照液 相色谱 条件 测定 样品 溶 液和 标准 溶液 ， 如 果样 品 溶液 中某 组分保留 时间与 标准 溶液 的某 一组 分保留 时间 相差 在0.5 % 以内， 可认 定相 同组 分。 8 结果计 算 样品中 被测 组分 的含
16、 量Xi ， 数值 用毫 克每 千克 （mg/kg）表 示 ，按 式（1）计 算 ，保 留2位有 效数 字： = V1000 1000 (1) 式中： Xi样品 中被 测组 分含 量， 单 位为 毫克 每千 克（mg/kg ）； Ci从 工作 曲线 得到 的被 测组分 溶液 浓度 的数 值， 单位为 微克 每毫 升（ g/mL ）； f稀 释倍 数； V样品 的稀 释液 定容 体积， 单 位为 毫升 （mL）； m样品 称样 量， 单位 为克（g）。 9 精密度 在重复 性条 件下 获得 的两 次独立 测定 结果 的绝 对差 值不得 超过 算术 平均 值的10 %。 DB15/T 211220
17、21 5 10 检出限 、定 量限 和回 收率 10.1 本 方 法的 检出 限： 土霉素0.54 mg/kg ， 四环素 0.66 mg/kg ， 金霉素 0.84 mg/kg。 10.2 本 方 法的 定量 限： 土霉素1.61 mg/kg ， 四环素 1.99 mg/kg ， 金霉素 2.51 mg/kg。 10.3 土霉素回收率：71.66 %93.93 % ，相对标准偏差（RSD）： 0.31 %4.73 % ；四环素回收率： 77.20 %97.33 % ，相 对标 准偏差 （RSD）： 0.47 %4.68 % ；金 霉素 回收 率：72.04 %96.92 %，相 对标 准偏差 （RSD）： 0.64 %4.98 %。 DB15/T 21122021 6 附录A （资料 性） 土霉素 、四 环素 、金 霉素 标准物 质色 谱 土霉素 、四 环素 、金 霉素 标准物 质色 谱图 见图A.1 注1 ：土霉素保留时间：17.240 min 。 注2 ：四环素保留时间：21.071 min 。 注3 ：金霉素保留时间：31.356 min 。 图A.1 土霉 素、 四环 素、 金霉 素 标准物 质色 谱图
