1、 ICS 65.020.20 B 16 DB37 山东省 地 方 标 准 DB37/T 4101 2020 苹果轮纹病菌快速检测方法 Rapid detection of botryosphaeria dothidea 2020 - 08 - 31 发布 2020 - 10 - 01 实施 山东省市场监督管理局 发布 DB37/T 4101 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则起草。 本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。 本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：山东省烟台市农业科学研究院。 本标准主要起草人：王英姿、刘保友、汪少丽、王培松
2、、石洁。 DB37/T 4101 2020 1 苹果轮纹病菌快速检测方法 1 范围 本标准规定了用环介导等温扩增（ LAMP）快速检测苹果轮纹病菌的测定方法。 本标准适用于苹果叶片、 枝条和果实中苹果轮纹病菌的快速检测。方法检出限： 10-7ng/ L苹果轮 纹病菌 DNA。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 原理 3.1 扩增原理
3、根据苹果轮纹病菌的 ITS序列中特异性序列设计特异性内、外引物及环引物各一对，特异性序列参 见附录 A。三对引物特异性识别靶标 序列上的六个独立区域，利用 Bst酶启动循环链置换反应，在 ITS基 因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 -环 DNA混合物， 加入显色液即可通过颜色变化观察判定结果。 3.2 显色液显色原理 SYBR Green I是一种高灵敏度的 DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链 DNA的小沟内。当它与双链 DNA结合时，荧光信号是游离状态的 800 1 000倍。在不发生扩增反应时， SYBR染料分子的荧光信号不 发生改变，颜色显
4、现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链 DNA的增加， SYBR染料的荧光信号 也随之大 幅度增强，其信号强度可代表双链 DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 LAMP：环介导等温扩增（ loop-mediated isothermal amplification） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid） ITS：内转录间隔区（ Internal transcribed spacer） 2 Lamp Master Mix：等温扩增 PCR混合液 Bst酶： Bst DNA 聚合酶（ Bst DNA polymerase）
5、5 试剂和材料 DB37/T 4101 2020 2 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为 GB/T 6682中规定的一级水。 5.1 等温扩增 PCR 混合液（ 2 Lamp PCR Master Mix1)） ：包含 40 mmol/L Tris-HCl、 20 mmol/L (NH4)2SO4、 20 mmol/L KC1（ pH 值为 8.8）、 16 mmol/L MgSO4、 2.0 mmol/L dNTPs、 0.2 % Trion X-100。 5.2 Bst DNA 聚合酶：酶浓度 8 U/ L。 5.3 显色液： SYBR Green I 荧光染料， 1 0
6、00 。 5.4 引物：根据苹果 轮纹病菌 ITS 基因序列设计一套特异性引物，包括外引物 1（ F3），外引物 2（ B3）， 内引物 1（ FIP），内引物 2（ BIP），环引物 1（ LF）和环引物 2（ LB）。外引物扩增片段长度： 189 bp， 引物序列见附录 A。 5.5 DNA 快速提取液： DNA-EZ Reagents All-DNA-Fast-Out2)。 5.6 甜菜碱： 5 mol/L。 5.7 离心管： 0.1 mL、 1.5 mL。 5.8 塑料研磨棒：长度 70 mm，研磨头外径 6.2 mm，研磨头长度 9.5 mm。 6 仪器设备 6.1 恒温箱：满足 6
7、5 3 、 80 1 要求。 6.2 移液 器：量程 0.5 L 10 L，量程 10 L 100 L，量程 100 L 1 000 L。 7 测定步骤 7.1 试验设置 7.1.1 阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（ Valsa mali）基因组 DNA 为模板。 7.1.2 阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（ Botryosphaeria dothidea）基因组 DNA 为模板，浓度应略高于方法检出限。 7.1.3 空白对照：以水代替 DNA 模板。 7.2 试样采集 进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约 0.5 cm 0.5 cm待检测的苹果组织（果实、叶片、枝
8、条）， 放置于 1.5 mL离心管中保存并标记。 7.3 试样 DNA 提取 7.3.1 将 100 L DNA 快速提取液加入到盛有试样的 1.5 mL 离心管中，用研磨棒研磨 5 min。 7.3.2 80 1 加热 5 min，如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到 10 min 30 min。 7.3.3 用手振荡混匀后取裂解物直接进行 LAMP 反应。 7.4 LAMP 反应步骤 7.4.1 反应体系 1) 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的 认可。如果其他 等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2)
9、由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 DB37/T 4101 2020 3 LAMP反应体系见表 1。每个试样各做 2个平行管。加样时应使试样 DNA溶液完全加入反应液中，不要 粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将 1 L显色液滴于反应管的管盖内侧，盖管盖时应尽量小心， 防止显 色液混合进入反应液中。这样试样扩增反应后不必开盖即可观察颜色变化。 表 1 LAMP 反应体系 组分 工作液浓度 加样量 反应体系最终浓度 外引物 1（ F3） 10 mol/L 0.5 L 0.
10、2 mol/L 外引物 2（ B3） 10 mol/L 0.5 L 0.2 mol/L 内引物 1（ FIP） 10 mol/L 2 L 0.8 mol/L 内引物 2（ BIP） 10 mol/L 2 L 0.8 mol/L 环引物 1（ LF） 10 mol/L 1 L 0.4 mol/L 环引物 2（ LB） 10 mol/L 1 L 0.4 mol/L Lamp PCR Master Mix 2 12.5 L 1 Bst DNA 聚合酶 8 U/ L 0.5 L 0.16 U/L 甜菜碱 5 mol/L 4 L 0.8 mmol/L DNA 模板 - 1 L - 水 - 补足至 25.
11、0 L - 7.4.2 反应过程 65 3 恒温扩增 60 min， 80 1 持续 10 min使酶灭活，反应结束。 7.4.3 显色反应 反应结束后，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，立即在正常光照条件下于 黑色背景（如黑布、 黑色纸板）下进行颜色观察。阴性对照：反应管中液体呈橙色。阳性对照：反应管中液体呈绿色。空白 对照：反应管中液体呈橙色。 7.5 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合 GB/T 27403中附录 D规定。 8 结果判定 8.1 待测样品 2 个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结 果为阴性，不携带苹果轮纹病菌。 8.
12、2 待测样品 2 个平行样反应管中液体至少一管呈绿色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品 检测结果为阳性，携带苹果轮纹病菌。 8.3 若与上述条件不符，则本次检查结果无效，应更 换试剂按本方法重新检测。 DB37/T 4101 2020 4 A A 附 录 A （资料性附录） 苹果轮纹病菌 ITS 基因特异性序列 A.1 苹果轮纹病菌 ITS基因特异性序列（ accession no.MN559436.1） 1 ATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAAGC 61 TCTGCTTGGTATTGGGCACCGTCCTT
13、TGCGGGCGCGCCTCAAAGACCTCGGCGGTGGCGT 121CTTGCCTCAAGCGTAGTAGAACATACATCTCGCTTCGGAGCGCAGGGCGTCGCCCGCCGG 181 ACGAACCTTCTGAACTTTTCTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC 注： 下划线所示部分为引物扩增匹配区段。 A.2 组成引物中碱基构成 外引物 1（ F3， 5 -3）： TGCCTGTTCGAGCGTCAT 外引物 2（ B3， 5 -3）： TCCGAGGTCAACCTTGAGAA F1c F2 内引物 1（ FIP， 5 -3）： CACCGCCGAGGTCTTTGAGGTACAACCCTCAAGCTCTGCT B1c B2 内引物 2（ BIP， 5 -3）： GCGTCTTGCCTCAAGCGTAGTGTTCAGAAGGTTCGTCCGG 环引物 1（ LF， 5 -3）： GGACGGTGCCCAATACCA 环引物 2（ LB， 5 -3）： AGAACATACATCTCGCTTCGGAG _
