1、ICS 65.150 B 52 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 36492020 水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法 Determination of residues of sulfonamides in aquatic Products ELISA method 文稿版次选择 2020 - 06 - 22 发布 2020 - 07 - 22 实施 安徽省市场监督管理局 发布 DB34/T 36492020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省水产技术推广总站提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位
2、：安徽国泰众信检测技术有限公司、宁国市金东坊农业开发有限公司、宣城市金水 源水产专业合作社、安徽省水产技术推广总站、合肥市畜牧水产技术推广中心、北京柏奥泰科技有限公 司、合肥金荣生态农业有限公司。 本标准主要起草人：孙德祥、陈洪周、周作友、吴敏、王婷、何广、李瑞、卞红正、许世富、张武 庆、姚杰、李先锋、桂淦、郭恒心、魏泽能、荣朝振、刘传涛、魏涛、钱之云、金家红、刘卫芳、王振、 何超、范希芹、李珺、陈恩全。 DB34/T 36492020 1 水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了水产品中磺胺类药物残留量的测定 酶联免疫吸附法的原理、试剂和材料、仪器和设 备、试样
3、制备与保存、测定方法、检测限、准确度和精密度、结果确证。 本标准适用于水产品中磺胺甲噁唑、磺胺吡啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺喹噁啉、磺胺对甲氧嘧啶、磺 胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺甲二唑、磺胺氯哒嗪残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 30891 水产品抽样规范 农业部 1077号公告-1-20 08 水产品中17种磺胺类及15种喹 诺酮类药物残留量的测定 液相色谱- 串联质谱法
4、农业部 1192号公告-1-2009 水产苗种违禁药物抽检技术规范 3 原理 试样中残留的磺胺类药物、酶标记抗原竞争结合磺胺类药物抗体，同时，磺胺类药物抗体又与微孔 板上包被的磺胺类药物的二抗结合，加 TMB 底 物后的颜色与试样中磺胺类药物的含量成反比，用酶标 仪在 450 nm 处测定吸光度值，以标准曲线算得对应试样中磺胺类药物浓度，乘以最终试液体积，除以 最终试样质量，即得到含量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯；用水应符合 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 乙腈：色谱纯。 4.2 乙酸乙酯：色谱纯。 4.3 正己烷：色谱纯。 4.4 乙腈水溶液：按 84 m
5、L乙腈：16 mL水混合。 4.5 氯化钠溶液2 mol/L：称取 11.6 9 g 氯化钠，用水溶解并定容至 100 mL。 4.6 磺胺类药物测定试剂盒： 28保存，组成参见附录 A。 4.6.1 96 孔酶标板：包被有抗磺胺类药物抗体的捕获抗体（二抗），8 孔/条 12 条 4.6.2 系列标准工作溶液： 0 ng/mL，0.5 ng/mL，1.5 ng/mL，5.0 ng/mL，15 ng/mL，50 ng/mL DB34/T 36492020 2 4.6.3 磺胺类药物抗体工作液 4.6.4 HRP 标记的磺胺类药物抗原工作液 4.6.5 10 倍样品提取液 4.6.6 20 倍浓缩
6、洗涤液 4.6.7 TMB 底物 4.6.8 终止液 4.7 样品提取液： 按 10 倍样品提取液（4.6.5）：水（V/V）=1:9 进行稀释。 28保存，有效期 1 个月。 4.8 洗涤液： 按 20 倍浓缩洗涤液（4.6.6）：水（V/V）=1:19 进行稀释。 28保存，有效期 1 个月。 5 仪器和设备 5.1 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 5.2 分析天平：感量 0.01 g。 5.3 组织捣碎机。 5.4 漩涡仪。 5.5 振荡器或超声波。 5.6 离心机：离心力4000 g。 5.7 氮气吹干装置：温控范围：室温100。 5.8 恒温培养箱：温控范围：060，温度均匀度
7、：0.5 5.9 可调移液器： 单道 20 L200 L、100 L1000 L、500 L5000 L； 八道 50 L300 L。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 水产品按 GB/T 30891 的规定执行；水产苗种按农业部 1192号公告-1-2009 规定执行。 采用四分法，将样品分成两等份，装入洁净容器，加封并做标识。 取均质后的供试样品，作为供试试样。 取均质后的空白样品，作为空白试样。 取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。 6.2 试样保存 于 -18冰箱中避光保存，保存期 6 个月。 7 测定方法 7.1 测定条件 DB34/T 3649202
8、0 3 所有操作应在 2025室温下进行。试剂盒及所有试剂 ，使用前应提前 60 min 以上取出，回 升至室温后方可使用。 7.2 试样前处理 称取试样 3 g 0.02 g 于 50 mL 离心管中，加入 9 mL 乙腈水溶液（4.4），振荡或超声 10 min， 离心力 4000 g 离心 10 min；移取 4 mL 上清液（相当于含 1 g 原始试样）到另一 50 mL 离心管中， 加入 2 mL 的氯化钠溶液（4.5）、8 mL 乙酸乙酯（4.2） ， 漩涡振荡 5 min，离心力 4000 g 离心 5 min； 移取 4 mL 乙酸乙酯层上清液（相当于含 0.5 g 原始试样）
9、到另一 10 mL 离心管中，5060氮气 吹近干；加 1 mL 样品提取液（4.7），振荡或超声 1 min，加 1 mL 正己烷（4.3）混合 2 min，离心 力 4000 g 离心 5 min，去除上层正己烷层；下清液用作试液。 此最终试液体积（v）为 1 mL，所代表的最终试样质量（m）为 0.5 g。 7.3 酶联免疫测定 7.3.1 测定步骤 将所需的酶标板条插入板架（按每个标准工作液、试液、空白及质控溶液作两个平行计算），并记 录对应位置。每孔加 50 L 标准工作液或试液，50 L HRP 标记的磺胺类药物抗原，50 L 磺胺类药 物抗体，用一次性吸头上下吸附振荡 3 次，轻
10、轻振荡微孔 板混匀 1 min，盖板膜，放入恒温培养箱中 于 22.52.5避光孵育 60 min。取出酶标板，孔向下甩出液体，加 250 L 洗涤液（4.8），轻轻 振荡 15 s 后甩出液体，重复操作 3 次，在吸水纸上拍打，完全除去孔中液体。加 100 L 的 TMB 底 物（4.6.7），轻轻振荡混匀，盖板膜，放入恒温培养箱中于 22.52.5避光孵育 15 min。加 100 L 终止液（4.6.8），轻振荡混匀，稳定 2 min ，用酶标仪于 450 nm 波长处测量吸光度值(读数前， 使用无绒布擦拭微孔底部水分和指模)。 注： 不同试剂盒制造商间的产品组成和操作会有差别，应严格按
11、说明书要求规范操作。 7.3.2 空白试验 除不加试样外，其余均按 7.2、7.3.1 进行。 7.3.3 结果计算和表述 用所获得的标准工作溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算，见式(1)： 相对吸光度值A()= 0 B B 100 . (1) 式中： A相对吸光度值()； B非 0 浓度标准工作液或试液的吸光度值； B0浓度为 0 标准工作液的吸光度值。 以相对吸光度值()为纵坐标，标准点浓度（ng/mL）为横坐标建立标准曲线。算得试样中磺胺类 药物的残留量浓度，再乘以最终试液体积（v），除以最终试样质量（m），即可得出试样中磺胺类药物 的残留量结果，按式(2) 计算： X=c m v 1
12、000 1000 . (2) DB34/T 36492020 4 式中： X磺胺类药物含量，单位为微克每千克（ g/kg）； c从校正曲线算出的试样中磺胺类药物浓度（ng/mL）； v检测液最终体积，单位为毫升（mL）； m检测液所代表的最终试样质量，单位为克（g）。 注： 结果保留两位有效数字。 计算结果应扣除空白值。 7.4 质量控制 7.4.1 质控要求 每一批测定均应进行平行试验、空白试样测定和空白添加测定。 7.4.2 质控形式 7.4.2.1 平行试验 按以上步骤，对同一标准溶液、试样溶液、空白及质控溶液应进行两个平行试验测定。 7.4.2.2 空白试样测定 测定结果应为阴性。 7
13、.4.2.3 空白添加试样测定 用空白试样添加磺胺类标准溶液，添加浓度水平为试剂盒检测限和相关产品的最大残留限量。 8 方法检测限、准确度、精密度 8.1 检测限 本方法水产品中磺胺类药物的单一药物或混合药物的检测限均为 1 g/kg。 8.2 准确度 本方法在 1 g/kg10 g/kg的空白添加回收率范围为 70120。 8.3 精密度 本方法的变异系数10。 9 结果确证 本方法测定结果为阳性的样品，应按农业部 1077号公告-1-2008 进行确证。 DB34/T 36492020 5 A A 附 录 A （资料性附录） 磺胺类药物酶联免疫测定试剂盒 A.1 96 孔酶标板：每条 8
14、孔，一板 12 条 A.2 标准溶液 A.3 磺胺类药物抗体 A.4 HRP标记的磺胺类药物抗原 A.5 10样品提取液 A.6 20浓缩洗液 A.7 TMB底物 A.8 终止液 酶标板(Sulfonamide P late)（可拆式 ） . . 128 孔 标准液(Standards)（ng/mL）：0， 0.5，1.5，5.0， 15，50 ） . 60.8 mL 回收用标准品 1000（ ng /mL ) . 0.8 mL 磺胺类药物抗体 (Sulfonamid e Antibody) . 8 mL HRP标记的磺胺类药物抗原(Sulfonamide -HRP Conjugate) . 6 mL 10样品提取液E(Sample Extraction Buffer E) . 25 mL 20浓缩洗液(Wash S olution) . 28 mL TMB底物(TMB Substrate) . . 14 mL 终止液(Stop Buff er) . 12 mL 浓缩组织提取液（Concentrate of Tissue Extraction Buffer） . . 60 g 组织纯化试剂（Tissue Clean Up Mix） . . 12 g 2-8的温度下储存。如果超过 3 个月不使用试剂盒，应将酶标抗原放置 -20保存。 _
