1、ICS 11.080 C 50 WS 中华人民共和国 卫生行业 标准 WS/T 683 2020 消毒试验用微生物要求 Requirements of microorganism for disinfection test 2020-07-20 发布 2021-02-01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 683 2020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出 的规则起草。 本标准起草单位： 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、江苏省疾病预防控制中心、 中 国人民 解放军疾病预防控制 中心 、北京 市 疾病预防控制中心、山东省疾病预防控制中心
2、、黑龙江省疾 病预防控制中心、 广州海关技术中心 。 本标准主要起草人： 沈瑾、段弘扬、王林、张流波、徐燕、魏 秋华、 王 佳奇、佟颖、 崔 树玉、 李涛、 李炎 、 林 玲、 吴晓松、于礼、孙 惠惠、 廖 如燕 、杨彬、韩 杰、 李俐、朱 亭亭 。 WS/T 683 2020 1 消毒试验用微生物要求 1 范围 本 标准规定了 消毒 试验 微生物 、 培养基 、 传代与 保存、菌悬液 和染菌载体 制备 的 要求。 本标准所指消毒试验用微生物仅包括细菌、真菌、分枝杆菌和细菌芽胞，不涉及消毒试验用病毒及 其他微生物的替代物（如酶、抗原、核酸等）。 本标准 适用于 各种 消毒 试验用 微生物 （除
3、 病毒 和替代物 外 ）的 使用和保存 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 18281.5 医疗保健 产品灭菌 生物指示物 第 5部分 ：低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示物 GB/T 33417 过氧化氢 气体灭菌生物指示物检验方法 GB/T 33419 环氧乙烷 灭菌生物指示物检验方法 GB/T 33420 压力蒸汽 灭菌生物指示物检验方法 消毒 技术规范（ 2002年版 ） 卫生部 （卫法监发 2002 282号） 3 试验微生物 3.1 来源
4、 试验 微生物来源于 具有资质 的菌种保藏机构，并能通过 常规检测 方法进行 鉴定 。 3.2 细菌 3.2.1 金黄色葡萄球菌 消毒 试验以 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)作为细菌繁殖体中 化脓 性球 菌的代表 ， 试验 常 用 菌种 为 ATCC 6538； 消毒剂对皮肤消毒模拟现场试验时，用 ATCC 27217。 3.2.2 大肠杆菌 消毒 试验以 大肠杆菌 (Escherichia coli)作为细菌繁殖体中 肠道菌的代表 ， 试验 常 用 菌种为 8099； 消毒剂 对手消毒模拟现场试验时， 用 8099或 NCTC 10538。 3.2.3 铜绿假
5、单胞菌 消毒 试验以 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)作为医院感染中最常分离 的细菌繁殖体的代 表 ， 试验 菌种 为 ATCC 15442。 3.2.4 白色葡萄球菌 WS/T 683 2020 2 消毒 试验以 白色葡萄球菌 (Staphylococcus albus)作为 空气 中 细菌 的 代表 ， 试验 菌种为 8032。 3.3 真菌 3.3.1 白色念珠菌 消毒试验 以白 色念珠菌 (Candida albicans)作为致病性真菌的代表， 试验 常用 菌种 为 ATCC 10231。 3.3.2 黑曲霉菌 消毒试验 以黑曲霉菌 (Aspergill
6、us niger)作为致病性真菌的代表， 试验 常用 菌种 为 ATCC 16404。 3.4 分枝杆菌 消毒试验 以 龟分枝杆菌脓肿亚种 (Mycobacterium chelonae subsp. abscessus)、 鸟分枝杆菌 （ Mycobacterium avium subsp. avium） 或 地分枝杆菌（ Mycobacterium terrae）作为人结核 分枝 杆菌 的代表 ，试验 用菌种为 龟分枝杆菌脓肿亚种 CMCC（ B） 93326或 ATCC 19977， 鸟分枝杆菌 ATCC 15769， 地 分枝杆菌 ATCC 15755。 3.5 细菌芽胞 3.5.1
7、枯草杆菌黑色变种芽胞 消毒 试验以 枯草杆菌黑色变种芽胞（ Bacillus subtilis var.niger）作为 细菌 芽胞 的代表， 试验 常 用菌种为 ATCC 9372；用于 指示干热灭菌 效果 时，符合 消毒 技术规范 （ 2002年 版 ）的 要求 ；用于 指示环氧乙烷 灭菌效果 时，符合 GB/T 33419的 要求 。 3.5.2 嗜热脂肪杆菌芽胞 嗜 热 脂肪杆菌芽胞 （ Geobacillus stearothermophilus）是 灭菌效果指示菌， 菌种 为 ATCC 7953或 SSI K31； 用于指示 压力蒸汽 灭菌效果时，符合 GB/T 33420的 要求
8、 ； 用于指示过氧化氢气体灭菌效果时， 符合 GB/T 33417的 要求 ； 用于指示 低温蒸汽 甲醛灭菌效果时，符合 GB 18281.5的 要求 。 3.5.3 短小杆菌芽胞 短小杆菌芽胞 （ Bacillus pumilus）是电离 辐射灭菌或消毒的指示菌，菌种为 E 601或 ATCC 27142， 符合 消毒 技术规范 （ 2002年 版 ）的 要求 。 3.6 其他 可 根据消毒 试验要求，选择抗力相当的 其他 菌种 进行 试验。 4 培养基 4.1 选择相应 培养基和 试剂进行 菌种 的传代和培养 ，消毒 试验 所需 培养基和试剂 见附录 A。 4.2 实验室 自行制备的固体斜
9、面 培养基和 平板 冷藏 保存 ，保存期 不超过 3 个月，如出现 缺水、干裂等 情况，灭菌处理后销毁。 实验室自行制备 的 液体 培养基 密封冷藏 保存， 保存期 不超过 3 个月，如出现 浑 浊， 灭菌处理 后销毁。 4.3 商品化 平板 、 斜面 和 培养基按产品说明书储存并在有效期内使用。 5 传代与保存 WS/T 683 2020 3 5.1 复苏与传代 5.1.1 以无菌操作方式开启 冻干 菌种管，加入适量 培养液 （按 菌种选择培养液，如 细菌选择营养肉汤、 白色 念珠菌 选择 沙堡液体培养基、 分枝杆菌选择 苏通 综合液体培养基 、 黑曲霉菌选择 麦芽浸膏营养肉汤 培养基 ）
10、， 吹吸数次，使菌种融化分散。 取含 5.0 mL 10.0 mL 相应培养液的试管，滴入少许菌种悬 液， 在适宜 温度下培养至规定时间 （一般 为 36 1 培养 18 h 24 h、 黑曲霉菌 为 30 1 培 养 42 h 48 h）， 此为第 1 代 培养物。 5.1.2 用接种环取第 1 代培养物， 或从菌种冻存管中取 适量菌液 /瓷 珠 ， 划线接种于相应培养基平板 （按 菌种选择培养 基 ，如 细菌选择营养琼脂培养基、白色 念珠菌 选择 沙堡琼脂培养基、 分枝杆菌选择 改良 罗 氏 培养基 或其他 商品化 分 枝 杆菌专用复合琼脂培养基 、 黑曲霉菌选择 麦芽浸膏 琼脂 培养基
11、） ， 在适宜 温 度下培养至规定时间 （一般 为 36 1 培养 18 h 24 h、 分枝杆菌 36 1培养 72 h、 黑曲霉 菌 30 1 培养 42 h 48 h）， 此为第 2 代 培养物。 5.1.3 挑取第 2 代培养物中典型菌落，接种于相应培养基斜面或 平板 （按 菌种选择培养 基 斜面 ，如 细 菌选择营养琼脂斜面、白色 念珠菌 选择 沙堡琼脂斜面、 分枝杆菌选择 改良 罗氏 培养基 或其他 商品化 分 枝 杆菌专用复合琼脂 斜面、 黑曲霉菌选择 麦芽浸膏琼脂 培养基平板 ） ， 在适宜 温度下培养至规定时间 （一 般 为 36 1 培养 18 h 24 h、 分枝杆菌 3
12、6 1 培养 72 h、 黑曲霉菌 30 1 培养 42 h 48 h）， 此为第 3 代 培养物。 5.1.4 取第 3 代培养物，接种于相应培养基斜面，在适宜 温度下培养至规定时间 ， 此为第 4 代 培养物。 5.1.5 按 上述方法培养至所需代数，传代 时 在试管上注明菌种名称、菌种号、代数及传代日期等基本 信息。 5.2 保存 5.2.1 菌种 斜面 的保存 5.2.1.1 传代 用菌种采用斜面 冷藏 保存。 5.2.1.2 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，在适宜 温度下培养至规定时间 ，生长充分后，转移 至冰箱 冷藏 保存，以备 实验传代 用。此法用于实验用菌种的短期保存，随时
13、检查其污染杂菌和变异等情 况，发现异常，灭菌处理后销毁。 5.2.1.3 保存时间与菌种类型有关，一般 存储时间不超过 9 周，铜绿假单胞菌和 分枝杆菌不超过 6 周， 如保存 期内，斜面出现缺水、干裂等情况，灭菌处理后销毁。 5.2.2 菌种 冻存 管的保存 菌种 可 采用甘油 、 液体石蜡 、瓷 珠 等方式冻存，根据其 特性选择适宜冻存方法， 常用 方法 参 见附录 B。 冻存管 注明菌种名称、菌种号、 冻存 日期等基本信息。 菌种 冻存管在 -80 保存 不宜超过 18个 月。 可 间隔一段时间，将菌种 冻存 管复苏后，重新冻存。 5.2.3 真空 冷冻干 燥保存 采用真空 冷冻 技术
14、，将菌种 冷冻 干燥 成菌 粉后 长期保存 。 菌种 管注明菌种名称、菌种号、日期等基 本信息 ， -20 2 冷冻保藏 。 6 菌悬液 的制备 6.1 细菌繁殖体悬液的制备 WS/T 683 2020 4 6.1.1 取第 3代第 8代的营养琼脂培养基培养 18 h 24 h的新鲜斜面培养物，用 5.0 mL吸管吸取 3.0 mL 5.0 mL 稀释液（除酸性电解水用生理盐水外 ， 其他均用 胰蛋白 胨生理盐水溶液 ）加入斜面试管内， 反复吹吸，洗下菌苔。用 5.0 mL 吸管将洗脱液移至另一无菌试管中，用电动混匀器混合 20 s，或在手 掌上振打 80 次，使细菌悬浮均匀。 6.1.2 将
15、 制成的菌 悬液， 进行活菌培养计数， 按 其结果 用稀释液稀释至所需 浓度， 悬液 定量杀灭试验 时， 菌 悬液浓度为 1 108 CFU/mL 5 108 CFU/mL。 6.1.3 细菌繁殖体悬液冷藏保存备用，当天使用。 6.1.4 怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。 6.2 枯草杆菌黑色变种芽胞悬液的制备 6.2.1 以无菌操作方式开启菌种管，加入适量营养肉汤培养基，吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 mL 10.0 mL 营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种 悬液，置 36 1 培养 18 h 24 h。用接种环取 第 1 代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂
16、培养基平板上，置 36 1 培养 18 h 24 h。挑取上 述第 2 代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，置 36 1 培养 18 h 24 h，即为第 3 代培 养物。 6.2.2 用 10.0 mL 吸管吸取 5.0 mL 10.0 mL 第 3 代 5 代的 18 h 24 h 营养肉汤培养物，接种于罗 氏瓶（或 细胞培养瓶 ）营养琼脂培养基表面，将其摇动使菌液布满培养基表面，将多余肉汤培养物吸出， 罗氏瓶（或 细胞培养瓶 ）置 36 1 恒温培养箱内培养 5 d 7 d。 6.2.3 用接种环取少许菌苔涂于玻片上，以改良芽胞染色法染色。改良芽胞染色法：用接种环取菌苔 涂于玻片上
17、，自然干燥后，通过火焰加热将菌固定于玻片上；将涂片放入平皿内，片上放两层滤纸，滴 加足量的 5.0%孔雀绿水溶液，将平皿盖好，置 55 1 加热 30 min。取出，去滤纸，用自来水冲 去残留液；加 0.5%沙黄水溶液， 1 min 后水洗，待干后镜检。芽胞呈绿色，菌体呈红色。在显微镜（油 镜）下镜检，当芽胞形成率达 90%以上时，即可进行以下处理。否则，继续在室 温下放置一定时间，直 至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。 6.2.4 加 10.0 mL 无菌蒸馏水于罗氏瓶（或 细胞培养瓶 ）中，以 L 棒轻轻刮下菌苔，吸出，再加入 5.0 mL 无菌蒸馏水冲洗培养基表面，吸出。将两次吸出的
18、菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中，振摇 5 min。 6.2.5 将烧瓶置 45 水浴 24 h，使菌自溶断链，分散成单个芽胞。 6.2.6 用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液，清除琼脂凝块。 6.2.7 将芽胞悬液置无菌离心管内，以 3000 r/min 速度离心 30 min。弃上清液，加蒸馏水吹吸使芽 胞重新悬浮。再 离心和重新悬浮清洗， 本步骤重复进行 3 遍。 6.2.8 将洗净的芽胞悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内， 80 水浴 10 min（或 60 水浴 30 min）， 以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，摇匀分装后冷藏保存备用，有效使用期 6 个月。 6.2.9 芽胞悬液在使
19、用时，先进行活菌培养计数。 6.2.10 怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。 6.3 真菌悬 液制备 6.3.1 白色 念珠菌悬液的制备 6.3.1.1 取第 3 代第 6 代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（ 18 h 24 h），用 5.0 mL 吸管吸取 3.0 mL 5.0 mL 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用 5.0 mL 吸管将洗脱液移至另一无菌试 管中，用电动混匀器混合 20 s，或者在手掌上振打 80 次，使白色念珠菌悬浮均匀。 WS/T 683 2020 5 6.3.1.2 将 制成的菌 悬液， 进行活菌培养计数， 按 其结果 用稀释液稀
20、释至所需 浓度， 悬液 定量杀灭试 验时， 菌 悬液浓度为 1 107 CFU/mL 5 107 CFU/mL。 6.3.1.3 菌悬液 冷藏保存 ，当天使用。 6.3.1.4 怀疑有污染时，以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。 6.3.2 黑曲霉 菌 孢子 悬液的制备 6.3.2.1 挑取第 2 代培养物中典型菌落，接种于麦芽浸膏 营养肉汤培养基 中 ， 置 30 1 恒温培 养箱中培养 42 h 48 h，即为第 3 代培养物。 6.3.2.2 用 10.0 mL 吸管吸取 5.0 mL 10.0 mL 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满 麦芽 浸膏琼脂 培养基表面，
21、将多余肉汤培养物液体吸出，置 30 1恒温培养箱中培养 42 h 48 h。 6.3.2.3 向罗氏瓶培养物中加 入 5.0 mL 10.0 mL 0.05%（ V/V）吐温 80 生理盐水溶液，刮洗黑曲霉 菌分生孢子于溶液中，将孢子悬液移入装有玻璃珠的三角瓶中，轻轻振摇 1 min，过滤除去菌丝后，显 微镜下（ 400 倍）观察是否仍有菌丝存在，若有可经 5000 r/min 6000 r/min 离心 20 min。再次在 显微镜下（ 400 倍）观察，必要时重复上述步骤。 6.3.2.4 黑曲霉菌分生孢子悬液冷藏保存不超过 2 d，使用前，混合均匀，在显微镜下（ 400 倍）观 察是否有
22、孢子出芽，若有则不得使用。 6.3.2.5 将 制成的菌 悬液， 进行活菌培养计数， 按 其结果 用稀释液稀释至所需 浓度， 悬液 定量杀灭试 验时， 菌 悬液浓度为 1 107 CFU/mL 5 107 CFU/mL。 6.4 分枝杆菌 悬液制备 6.4.1 取第 3 代斜面培养物，在改良 罗氏 培养基 或其他商品化分枝杆菌专用复合琼脂培养基斜面上连 续传代，培养方法与第 3 代 相同，取第 5 代第 6 代 的 72 h 新鲜 培养物， 用 5.0mL 吸管吸取 3.0 mL 5.0 mL 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。用 5.0 mL 吸管将洗脱液移至含 有 6 g 7 g
23、玻 璃珠 的无菌圆锥底试管中，用电动混 匀 器 混合至少 5 min。将 菌液吸入至另一试管内，制成菌悬液 ，冷 藏保存， 当天使用。 6.4.2 将 制成的菌 悬液， 进行活菌培养计数， 按 其结果 用稀释液稀释至所需 浓度， 悬液 定量杀灭试验 时， 菌 悬液浓度为 1 107 CFU/mL 5 107 CFU/mL。 7 染菌 载体的制备 7.1 载体根据消毒对象选择 相应的 材料 ，如 手术器械选择不锈钢片，物体表面选择棉布片，非金属管 腔选择聚四氟乙烯片（ 管 ） ， 光滑表面可选择玻璃 片 等 。 常用的材料有金属、玻璃、滤纸、棉布、聚四 氟乙烯等，金属载体一般用 12 mm 直径
24、圆形金属片（厚 0.5 mm），其他材质载体一般为方形，大小 10 mm 10 mm，特殊试验可使用其他材质、形状的载体。评价气体 、雾化 等 消毒方式 时 ，不 可 使用布片和 滤纸片等有吸附能力的载体。 7.2 所用载体（除滤纸片外）于染菌前，进行脱脂处理。脱脂方法如下： a)将载体放在含碱性洗涤剂 的水中煮沸 30 min； b)以自来水洗净； c)用蒸馏水煮沸 10 min； d)用蒸馏水漂洗至 pH 呈中性； e)晾干、 熨平备用。 7.3 布片用 40 织纱的白平纹棉布制作。将脱脂后的布块按载体规定的大小抽去边缘一周的经纬纱各 一根，按抽纱痕 剪开。金属片以不锈钢制作，纸片以滤纸制
25、作。 7.4 载体经压力蒸汽灭菌后，使用滴染法染菌。 7.5 染菌用菌悬液： 菌悬液 和芽胞悬液的制备按第 6 章 进行 ， 然后加入等量 3.0%或 0.3%的牛血清白蛋 白。 WS/T 683 2020 6 7.6 滴染法染菌时，将经灭菌的载体平铺于无菌平皿内，用移液器逐个滴加菌液，必要时用接种环涂 匀整个载体表面。置 36 1 恒温培养箱或者室温干燥备用，黑曲霉菌染菌载体置于二级生物安全 柜内干燥备用。 7.7 每个染菌载体的回收菌量为 1 106 CFU/个 5 106 CFU/个。特殊染菌载体（ 如压力 蒸汽灭菌 生 物 指示物 ）的 回收菌量符合相应标准的要求。 7.8 染菌载体冷
26、藏保存，芽胞载体有效期 1 个月，其他染菌载体当天使用。 WS/T 683 2020 7 附 录 A （规范性附录） 培养基和试剂 A.1 稀释液 A.1.1 胰蛋白胨生理盐水溶液（ TPS） 胰蛋白胨 1.0 g 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL 制成溶液 ， 调 pH至 6.8 7.2（ 20 ），于 121 压力蒸汽灭菌 20 min备用。 A.1.2 生理盐水 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1000 mL 制成溶液，于 121 压力蒸汽灭菌 20 min备用。 A.2 孔雀绿与沙黄芽胞染色液 5.0%孔雀绿水溶液 0.5%沙黄水溶液 A.3 有机干扰物 牛血清白蛋白 30.0
27、g 或 3.0 g 蒸馏水 1000 mL 溶解后用微孔滤膜（孔径为 0.45 m）滤过除菌，冰箱冷藏保存备用。 A.4 营养琼脂培养基 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g 蒸馏水 1000 mL 制成溶液， 调 pH至 7.2 7.4，于 121 压力蒸汽灭菌 20 min备用。 A.5 营养肉汤培养基 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 5.0 g WS/T 683 2020 8 蒸馏水 1000 mL 制成溶液，调 pH 至 7.2 7.4，于 121 压力蒸汽灭菌 20 min 备用。 A.6 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（ TSA
28、） 胰蛋白胨 15.0 g 大豆蛋白胨 5.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 16.0 g 蒸馏水 1000 mL 制成溶液 ，调 pH至 7.2 7.4， 于 121 压力蒸汽灭菌 20 min备用。 A.7 沙堡琼脂培养基 葡萄糖 40.0 g 蛋白胨 10.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1000 mL 制成溶液， 调 pH 至 5.4 5.8， 于 115 压力蒸汽灭菌 30 min 备用。 A.8 沙堡液体培养基 葡萄糖 40.0 g 蛋白胨 10.0 g 蒸馏水 1000 mL 制成溶液，调 pH 至 5.4 5.8，于 115 压力蒸汽灭菌 30 min 备用。 A.9 苏通
29、 综合液体培养基 磷酸二氢钾 0.50 g 硫酸镁（ MgSO4.7H2O） 0.50 g 柠檬酸铁 铵 0.05 g 柠檬酸 2.0 g 甘油 60 mL 天冬素 4.0 g 蒸馏水 940 mL 加热 溶解后，调 pH至 7.2 7.4，过滤、 分装 ， 于 121 压力蒸汽灭菌 30 min备用。 A.10 改良 罗氏培养基 味精 （ 谷氨酸钠 95%以上） 7.20 g 磷酸二氢钾 2.40 g 硫酸镁 0.24 g 柠檬酸镁 0.60 g 甘油 12 mL 马铃薯淀粉 30.0 g WS/T 683 2020 9 2%孔雀 绿 20 mL 全卵 液 1000 mL 蒸馏水 600 m
30、L 各盐类 成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水锅内煮沸 30 min 40 min（其 间不时摇动， 防凝块）， 呈糊状，冷却后，加入经 消毒 纱布过滤的新鲜全卵液 1000 mL， 混匀 。 加 2%孔雀绿 20 mL， 混匀，分装试 管，每一试管加培养基 7 mL， 培养基斜面高度为培养基占试管底部的 2/3处 为宜；若制作培养基平 板 ， 则每皿 加 约 30 mL 35 mL， 置 血清 凝固 器 内凝固。 凝固 器内 温度至 90 后，放入分装好的培养基试 管 或平皿，以摆放两层为宜。 待 凝固器内温度达 85 90 ， 计时，凝固 1 h 1.5 h后 取出， 冷却 。无菌 试验
31、 后放冰箱冷藏备用，一个月内使用。 A.11 麦芽浸膏琼脂培养基（ MEA） 麦芽浸膏 30.0 g 大豆蛋白胨 3.0 g 琼脂 15.0 g 双蒸馏水 1000 mL 制成溶液， 121 20 min 压力蒸汽灭菌， 灭菌后无菌调节 pH 至 5.4 5.8 备用。 A.12 麦芽浸膏肉汤培养基（ MEB） 麦芽浸膏 20.0 g 双蒸馏水 1000mL 制成溶液， 121 20 min压力蒸汽灭菌，灭菌后无菌调节 pH至 6.7 7.1备用。 WS/T 683 2020 10 附 录 B （ 资料性 附录） 菌种冻存方法 B.1 甘油冷冻管 保存 法 用无菌接种环刮取平板或琼脂斜面的培养
32、物，放入装有无菌 纯 化 水的试管中， 通过接种环与试管壁 间的摩擦，使细菌充分扩散到纯化水中，制备成菌悬液。向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油 （浓度 20%），即为 10%甘油菌悬液，轻轻振摇，充分混合后，分装于无菌小试管或 冻存管 ，冷冻保存。 B.2 液体石蜡保存法 B.2.1 无菌液体石蜡的制备 选用优质化学纯液体石蜡， 121 30 min压力 蒸汽灭菌 后 ， 置 40 恒温箱中蒸发水分，备用。 B.2.2 液体石蜡管的制备 将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，用无菌吸管吸取上述无菌液体 石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约 1 cm，使菌
33、体与空气隔绝，并将试管直立，置于 -20 冷冻或冷藏保存。 B.3 真空 冷冻干燥法 B.3.1 准备 安瓿管 用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，可用长颈球形底安瓿管 或 管状安瓿管 ，将 安 瓿管 清洗 干净，烘干， 管口 塞好 脱脂 棉塞， 121 灭菌 30 min，备用。 B.3.2 菌 悬液的制备 及 分装 在无菌条件下 ， 用 2 mL 3 mL脱脂牛乳 将 生长良好的 纯 菌培养物 从 斜面上洗脱下来，制 成 菌悬液， 分装入安瓿管 ， 每支安瓿管分装 0.1 mL 0.2 mL。 B.3.3 预冻 -80 预冻 1 h 2 h。 B.3.4 冷冻 干燥 将冷冻后的
34、 安瓿管 置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为 8 h 20 h。终止干燥 时间根据下列情况判断： a)安 瓿 管内冻干物呈酥块状或松散片状； b)真空度接近空载时的最高值； c) 选用 1 2支对照管，其 中加水与菌悬液同量 ， 若对照管中水份已干燥 ，视为干燥完结。 WS/T 683 2020 11 B.3.5 封口 抽真空干燥后，取出安瓿 管 ，接在封口用的玻璃管上，可用 L形五通管继续抽气，约 10 min即可达 到 26.7 Pa（ 0.2 mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。 B.3.6 保藏 安瓿管保 存 在 -20 冰箱。 B.4 瓷珠冷冻保存法 按商品化菌种 保存管 说明书 进行 瓷珠 冷冻保存。 _
