1、ICS 13.100 C 60 ws 中 华 人 民 共 和 国 卫生 行 业 标 准 WS/T 615 2018 辐射生物剂量估算 早熟染色体凝集 环分析 法 Estimation of radiation biological dose analyzing premature chromosome condensation ring 2018 - 06 - 15 发布 2018 - 12 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS/T 615 2018 I 前 言 本标准 按照 GB/T 1.1 2009 给出的 规则起草。 本标准由国家卫生标准委员会放射卫生标准专业委员
2、会提出。 本 标准 起草单位： 中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所、中国医学科学院放射医学研究 所、苏州大学。 本 标准主要 起草人： 刘青杰、赵骅、陆雪、刘强、朱巍。 WS/T 615 2018 1 辐射生物剂量估算 早熟染色体凝集环 分析 法 1 范围 本标准规定了通过分析早熟染色体凝集环，对电离辐射外照射受照人员进行生物剂量估算的方法。 本标准适用于发生在受照后 1个月内、吸收剂量在 4 Gy 20 Gy范围内 的 X或 射线 、急性全身均匀 或近似均匀 外 照射的受照人员的生物剂量估算。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的
3、版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 28236一 2011 染色体畸变估算生物剂量 方法 3 术语和定义 GB/T 28236一 2011界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 早熟染色体凝集 premature chromosome condensation； PCC 利用化学或生物的方法，间期 淋巴 细胞核被诱导提前进入有丝分裂期，使间期 淋巴 细胞核内极度分 散状态的染色 质凝缩成细纤维状的染色体样结构。 3.2 早熟染色体凝集环 premature chromosome condensation ring； PCC
4、-R 当早熟染色体凝集断裂后， 一条染色体的两个断裂末端重接形成 的 环状染色体。 3.3 剂量 -效应曲线 dose-effect curve 某种生物体系受到照射后的反应与受照射剂量之间存在着某种定量关系，可用适当的数学模式 描 述，制备出相应的反应效应与受照剂量之间关系的刻度曲线，可用其估算受照剂量。 4 早熟染色体凝集标本制备 4.1 主要仪器和试剂配制 主要仪器和试剂配制参见附录 A。 4.2 早熟染色体凝集标本制备 WS/T 615 2018 2 4.2.1 样品采集 抽取人静脉血 1 mL 2 mL，注入肝素抗凝管。 4.2.2 样品接种和细胞培养 将 0.5 mL肝素抗凝全血加
5、入到 4.5 mL含有 20%胎牛血清的全培养基（ RPMI 1640）中，每个样品设 2 个平行样， 37 恒温培养箱中 培养 46 h 47 h后 ，加入终 浓度为 50 nmol/L的 花萼海绵体诱癌素 A （ Calyculin A）或终浓度为 500 nmol/L的冈田酸 （ Okadaic acid） ，继续培养 1 h 2 h。 4.2.3 收获细胞 用吸管吹打培养物，转入 15 mL刻度离心管中，水平离心机 250 g离心 10 min， 弃上清液 ，约留 1 mL 剩余沉淀物。 4.2.4 低渗 每离心管中加入 37预温的 0.075 mol/L氯化钾（ KCl）至 8 mL
6、 10 mL，用吸管吹打均匀，置 37 低渗 10 min 30 min。 4.2.5 预固定 每离心管中加入 1 mL 2 mL新配制的固定液 甲醇 /冰乙酸 = 3/1（体积比） ，用吸管轻轻吹吸混 匀， 250 g离心 10 min， 弃上清液 。 4.2.6 固定 每离心管中加入 8 mL固定液，轻轻吹吸混匀，室温固定 20 min， 250 g离心 10 min， 弃上清液 。 4.2.7 第二次固定 加入 8 mL固定液，轻轻 吹吸混匀， 室温 固定 15 min， 250 g离心 10 min，弃去大部分上清 液 ，留适 量上清 液 。 4.2.8 细胞悬液的制备 用吸管吹打混匀
7、剩余上清 液 和沉淀，制得细胞悬液。 4.2.9 制片 将 2滴 3滴细胞悬液滴在预冷玻片上，过火 2 s 3 s，室温自然干燥。 4.2.10 染色 用 pH 6.8的磷酸缓冲液将 吉姆萨染液（ Giemsa）稀释 成 8%溶液 ，染色 8 min 10 min，自来水冲洗 后晾干。 5 早熟染色体凝集 环 的分析和记录 5.1 光学显微阅片 在光学显微镜的低倍镜 （ 10倍） 下， 寻找 合适的早熟染色体凝集分裂相；然后 在油镜（ 100倍 ） 下 将早熟染色体凝集 分裂相调至视野正中间，计数早熟染色体凝集环的数量。 WS/T 615 2018 3 5.2 早熟染色体凝集环判定标准及计数标
8、准 早熟染色体凝集环分为空心环和实心环。空心环是 呈 中空的圆环形或不规则环形结构 。 实心环是呈 实心球状的结构，稍致密，直径 大于 早熟凝集染色单体的横径。在分析时不计数实心环。早熟染色体凝 集环示例参见附录 B。 两条姐妹染色单体排在一起的分裂相称作 G2/M期早熟染色体凝集分裂相，这种分裂相中出现的环称 作 G2/M期早熟染色体凝集环。 G2/M期早熟染色体凝集分裂相中排在一起的 2个大小相近的环状结构，计 数 1个早熟染色体凝集环。 两条染色单体 明显处于分开状态的分裂相称作 M/A期早熟染色体凝集分裂相， 这种分裂相中出现的环称作 M/A期早熟染色体凝集环。 M/A期早熟染色体凝集
9、分裂相中的每个环状结构， 计数 1个早熟染色体凝集环。 5.3 结果数据的记录和保存 检测到早熟染色体凝集环时，需要进行拍照。 将选择分析的每一个 早熟染色体凝集 分裂相 记录在 早 熟染色体凝集环分析 记录表 中。早熟染色体凝集环分析记录表参见附录 C。 6 剂量 -效应曲线的建立 6.1 样品采集 抽取人静脉血 6 mL 8 mL，注入肝素抗凝管。 6.2 供血者要求 2名 3名 健康成年人 ，非放射工作者，男女均可，年龄在 18岁 60岁，半年内无急慢性疾病、无射 线和化学毒物接触史，近一个月内无病毒感染史。 6.3 照射条件 样品均匀照射； X或 射线照射剂量范围在 4 Gy 20 G
10、y；照射剂量率选择 0.3 Gy/min 1 Gy/min， 照射剂量点在 6个 8个（均匀布点）； 37 进行照射。照射后将样品置 37 恒温培养箱中 修复 2 h，然 后进行细胞培养。 6.4 早熟染色体凝集标本制备、分析及记录 早熟染色体凝集标本制备、分析和记录按照第 4章 第 5章中所述方法进行。 6.5 数据处理 两组间早熟染色体凝集环每细胞数的比较用泊松分布的 U检验，多组间早熟染色体凝集 环每细胞数 的比较用卡方检验；早熟染色体凝集环每细胞数与照射剂量的关系进行曲线拟合，对拟合回归方程进行 假设检验用卡方检验。 6.6 剂量 -效应曲线拟合 参照 GB/T 28236-2011中
11、 4.3，对 X或 射线诱导的早熟染色体凝集环与受照射剂量之间的剂量 -效应 关系以拟合二次多项式为宜，按照式（ 1）进行拟合： Y = c + D + D2 （ 1） 式中： Y 早熟染色体凝集环每细胞数； WS/T 615 2018 4 c 常数项， 早熟染色体凝集环每细胞数本底值（ PCC环 /分裂相）； 剂量 一次项系数； D 照射剂量，单位为戈瑞（ Gy）； 剂量二次项系数。 6.7 建立剂量 -效应曲线 进行剂量估算的实验室应建立剂量 -效应曲线；有条件的实验室可建立不同辐射类型、不同剂量率 的剂量 -效应曲线。 7 剂量估算 7.1 早熟染色体凝集标本的制备 所要估算剂量样品的早
12、熟染色体凝集标本制备方法均应与建立剂量 -效应曲线的方法相同。 7.2 分析早熟染色体凝集分裂相数的确定 可先分析 200个早熟染色体凝集分裂相，将得到的早熟染色体凝集环每细胞数 p，代入式（ 2）计算 出需要分析的分裂相数。 n = (1 ) 96.04p p （ 2） 式中： n 需要分析的分裂相数； p 早熟染色体凝集环每细胞数； 96.04 采用 20%的允许误差，令 1.96 n )-(1 pp =p 20%，根据 95%可信区间计算获得的常数。 7.3 检测早熟染色体凝集环每细胞数和 95%可信区间的计算 检测早熟染色体凝集环每细胞数的计算按照式（ 3）计算： p = xn （ 3
13、） 式中 ： p 检测到的早熟染色体凝集环每细胞数； x 检测到的早熟染色体凝集环数； n 早熟染色体凝集分裂相数 。 检测早熟染色体凝集环每细胞数的 95%可信区间按照式 （ 4） 计算： 95%CI = p 1.96Sp （ 4） 式中： 95%CI 95%可信区间； p 检测到的早熟染色体凝集环每细胞数； Sp 早熟染色体凝集环每细胞数的标准误，按照式（ 5）计算： WS/T 615 2018 5 Sp = xn （ 5） 式中： Sp 早熟染色体凝集环每细胞数的标准误； x 检测到的早熟染色体凝集环数； n 早熟染色体凝集分裂相数 。 7.4 受照剂量的估算 将所要估算剂量的标本中得到
14、的早熟染色体凝集环每细胞数及 95%可信区间的上下限代入建立的剂 量 -效应曲线，估算出受照剂量。事故受照人员生物剂量估算 示 例参见附录 D。 8 质量控制 8.1 进行早熟染色体凝集制备与分析的 实验室应有 2名 （含） 以上专业技术人员，掌握电离辐射生物 效 应和细胞遗传学基础知识，熟练掌握早熟染色体凝集环显微镜下分析技术。 每个早熟染色体凝集环需 2名 专业技术人员 相互确认。 8.2 标本应 有唯一性编号 。 8.3 标本分析完毕后，应置于玻片盒内保存，并做好记录。 WS/T 615 2018 6 A A 附 录 A （资料性附录） 主要仪器设备和试剂配制 A.1 主要仪器设备 A.
15、1.1 恒温培养箱：用于细胞培养。 A.1.2 普通离心机：水平式离心机，用于收获细胞。 A.1.3 光学显微镜：用于分析早熟染色体凝集环。 A.1.4 恒温水浴箱：用于收获细胞。 A.1.5 低温冰箱（ -20 ）和普通冰箱 ： 用于贮存 少量 实验用试剂 。 A.2 主要试剂的配制 A.2.1 Calyculin A工作液 ：将 1 mL无水乙醇加入 到 10 g花萼海绵体诱癌素 A粉末中，混匀后置 于 -20 低温冰箱 保存。 A.2.2 冈田酸 工作液 ：将 1 mL二甲基亚砜加入到 25 g冈田酸 粉末中，混匀后置于 -20 低温冰箱 保存。 A.2.3 RPMI1640 全培养基：
16、 1L RPMI1640 培养基中含有 10.4 gRPMI1640 粉末、 1.3 g无水碳酸氢 钠 ， pH在 7.0 7.2之间。 RPMI1640 全培养基中含 20%胎牛血清、青霉素 100 IU/mL、链霉素 100 mg /mL、植物血球凝集素 200 g/mL。 A.2.4 低渗液：称取 5.59 g氯化钾（ KCl）双蒸水溶解后定容到 1 L，终浓度为 0.075 mol/L， 37 保存。 A.2.5 固定液：将甲醇与冰乙酸以 3/1（体积比）的比例混匀，使用前新鲜配制。 A.2.6 磷酸缓冲液：称取 4.705 g磷酸氢二钾及 4.54 g磷酸二氢钠双蒸水溶解后定容到 1
17、 L， pH 为 6.8，终浓度为 1/15 mol/L， 4保存。 A.2.7 Giemsa染液：称取 1.0 g吉姆萨粉末放入研钵中，加入少量甘油混匀研磨，边研磨边加入甘 油至 66 mL，充分混匀后，置于 60水浴箱中 2 h。冷却至室温后，加入 66 mL甲醇，充分搅拌混匀， 避光密闭保存。 注： 试剂级别为分析纯。 WS/T 615 2018 7 B B 附 录 B （资料 性附录） 早熟染色体凝集环示例 早熟染色体凝集环示例见图 B.1。 a) G2/M PCC细胞中的 1对空心环 b) G2/M PCC细胞中的 1对实心环 c) M/A PCC细胞中的 1个空心环 d) M/A
18、PCC细胞中的 2个空心环 图 B.1 早熟染色体凝集环示例 WS/T 615 2018 8 C C 附 录 C （资料性附录） 早熟染色体凝集环分析记录表和检测报告 C.1 早熟染色体凝集环 分析记录表 早熟染色体凝集环分析记录表见表 C.1。 表 C.1 早熟染色体凝集环分析 记录表 第 页，共 页 样本 编号： 受检者姓名： 分析细胞数量： 检测到早熟染色体凝集环数： 载玻片编号： 显微镜编号： 注： 适用于记录每个细胞中的早熟染色体凝集环； N表示未见早熟染色体凝集环 ， R表示 1个早熟染色 体凝集环；记录含有早熟染色体凝集环分裂相的显微镜坐标（如 130.5/14.2， R）或图片
19、保存文 件名（如 liming 001,2R）， 以便复核。 检测单位： 分析人： 分析 日期： 年 月 日 复核人： 复核日期： 年 月 日 WS/T 615 2018 9 C.2 早熟染色体凝集环 检测报告 早熟染色体凝集环检测报告见表 C.2。 表 C.2 早熟染色体凝集环 检测报告 样本 编号： 姓名： _ 性别： _ 年龄： _ 送检日期： _ 委托单位： _ 联系人： _ 联系电话： _ 工 种： _ 照射史： _ 检测项目 人外周血淋巴细胞早熟染色体凝集环分析 检测方法： 培养 _h加入 花萼海绵体诱癌素 A/冈田酸 ， _h收获细胞。 结 果： 分析 个 早熟染色体凝集分裂相，
20、 检测到 个早熟染色体凝集环，根据公 式 ，估算该样品受到的受照剂量为 （ ， ） Gy。 结果评价： 分析人： 分析 日期： 年 月 日 复核人： 复核日期： 年 月 日 签发 人： 签发 日期： 年 月 日 WS/T 615 2018 10 D 附 录 D （资料性附录） 剂量估算应用 示 例 D.1 事故受照人员生物剂量估算 （应用 示 例） 某男性受到 60Co 射线事故照射，受照后 24 h内取外周血，分析 1000个早熟染色体凝集分裂相，观 察到 57个早熟染色体凝集环。 早熟染色体凝集环每细胞数为 p =100057 = 0.057，标准误 Sp = 100057 = 0.007
21、5。 95%可信区间： p1.96Sp=0.0571.960.0075，因此，检测早熟染色体凝集环每细胞数可信区间为 （ 0.0423,0.0717）。 根据本实验室所建立的 60Co 射线照射离体血建立的早熟染色体凝集环的剂量 -效应曲线： Y =0.0033+0.0083D+0.00022D2 （剂量率为 1 Gy/min） 其中 Y 为早熟染色体凝集环每细胞数， D 为剂量 (Gy)。 将 0.057、 0.0423和 0.0717分别代入 Y 项，解方程后求出平均剂量为 5.63 Gy，下限为 4.23 Gy，上 限为 6.95 Gy，估算的剂量为 5.63（ 4.23， 6.95） Gy。 _
