1、ICS 11.020 C 59 WS 中 华 人 民 共 和 国 卫生 行 业 标 准 WS 5882018 手足口病诊断 Diagnosis for hand, foot and mouth disease 2018-03-06 发布 2018-08-01 实施 中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会 发布 WS 5882018 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 术语和定义 . 1 3 缩略语 . 1 4 诊断依据 . 1 5 诊断原则 . 2 6 诊断 . 3 7 鉴别诊断 . 3 附录 A（规范性附录） 手足口病相关肠道病毒特异性抗体检测 . 5 附录 B（规范性附录）
2、 手足口病相关肠道病毒核酸检 测 . 10 附录 C（规范性附录） 手足口病相关肠道病毒的分离和鉴定 . 14 WS 5882018 II 前 言 本标准第 6章为强制性条款，其余为推荐性条款。 本标准按照 GB/T 1.1 2009给出的规则 起草。 本标准起草单位： 首都医科大学附属 北京地坛医院、中国疾病预防控制中心、 首都医科大学附属 北 京儿童医院 、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 。 本标准主要起草人：李兴旺、杨维中、王子军、钱素云、陈志海、许文波、张静、卢联合。 WS 5882018 1 手足口病诊断 1 范围 本标准规定了手足口病的诊断 依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断 。
3、 本标准 适用于全国各级各类医疗卫生机构 及其医务人员 对手足口病的诊断。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 2.1 手足口病 hand,foot and mouth disease 由 人肠道病毒 71型 (EV-A71)和 柯萨奇 病毒 A组 16型（ CV-A16）等肠道病毒引起的急性传染病，多见 于学龄前儿童。 重症病例多由 EV-A71感染所致。 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE： 细胞病变效应 （ cytopathic effect） CV-A16： 柯萨奇病毒 A组 16型（ coxsackievirus A16） cDNA： 互补 DNA dNTP：
4、脱氧核糖核苷 三磷酸 （ deoxy-ribonucleotide triphosphate） EDTA:乙二胺四乙酸 ELISA： 酶联免疫吸附试验 （ enzyme-linked immunosorbent assay） EV-A71:人肠道病毒 71型（ human enterovirus A71） HEPES： 4-羟乙基 哌嗪 乙磺酸 缓冲液 Hep-2： 人喉癌上皮细胞 IgG： 免疫球蛋白 G（ immunoglobulin G） IgM： 免疫球蛋白 M（ immunoglobulin M） MEM： Eagles 培养液（ eagles minimum essential m
5、edium） OPD： 邻苯二胺 RD： 人横纹肌肉瘤细胞 RT-PCR： 逆转录 -聚合酶链反应 （ reverse transcription-polymerase chain reaction） TMB： 3,3,5,5-四甲基 联苯胺 Vero： 非洲绿猴肾细胞 4 诊断依据 WS 5882018 2 4.1 流行病学特点 一年四季均可发病， 具有季节性分布特点，南方可出现春夏季主高峰和秋冬季次高峰， 北方主要出 现夏秋流行，尤其是夏季 。肠道病毒传染性强、隐性感染比例大、传播途径复 杂、传播速度快，在短时 间内可造成较大范围的流行，流行期间，可在 幼儿园、 托幼机构、家庭 等 地 出
6、 现聚集性或暴发疫情 。 4.2 临床表现 潜伏期一般为 2 d 10 d，平均 3 d 5 d。 急性起病，发热，手、足和臀部出现斑丘疹、疱疹，口腔 黏 膜 或咽峡部出现散在疱疹。可伴有咳嗽、 流涕、食欲不振、腹泻等症状。 部分病例仅表现为手、足和臀部皮疹 和 /或 咽峡部疱疹。少数病例皮疹不典型，表现为细小沙粒状 皮疹、单部位皮疹或无皮疹。 少数病例可累及中枢神经系统，表现为脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎，甚至出现肺水肿、肺出血 和 /或 循环功能障碍等，病情进展迅速，可致死亡。 4.3 实验室检查 4.3.1 一般检查 4.3.1.1 血常规 白细胞计数正常或降低，重型和危重型病例白细胞计数可升
7、高。 4.3.1.2 血糖 危重型病例可升高。 4.3.1.3 脑脊液 中枢神经系统受累时常表现为：外观清亮，压力增高，白细胞计数增多，多以单核细胞为主，蛋白 正常或轻度增多，糖和氯化物正常。 4.3.2 血清学及病原学检查 4.3.2.1 用 ELISA等方法在患者血清或脑脊液中检测到抗 EV-A71或 CV-A16等肠道病毒 IgM抗体 （见 附录 A） 。 4.3.2.2 用 ELISA或中和试验等方法检测患者血清中 EV-A71或 CV-A16等肠道病毒 IgG抗体，恢复期 血清比急性期有 4倍升高或急性期抗体阴性而恢复期抗体阳转。 4.3.2.3 用 RT-PCR、荧光定量 RT-P
8、CR等方法从患者鼻咽拭子、肛 拭子、粪便、疱疹液、脑脊液或尸 检标本中检测到 EV-A71或 CV-A16等肠道病毒特异性核酸 （见附录 B） 。 4.3.2.4 用 RD、 HEp-2或 Vero等细胞系对患者鼻咽拭子、肛拭子、粪便、疱疹液、脑脊液或尸检标本 进行病毒培养，可分离到 EV-A71或 CV-A16等肠道病毒 （见附录 C） 。 5 诊断原则 5.1 根据临床表现及一般实验室检查结果可做出临床诊断和分型。流行病学资料可作为参考。 WS 5882018 3 5.2 确诊需要手足口病相关病原学和血清学检测的阳性结果。 6 诊断 6.1 临床诊断病例 符合 4.2，并排除其他相关疾病。
9、 6.2 确诊病例 临床诊断病例，并具有 4.3.2之一者。 6.3 临床分型 6.3.1 普通型 手、足、臀部皮疹，口腔 黏 膜疱疹，伴或不伴发热。 6.3.2 重型 出现中枢神经系统受累表现，如：精神差、嗜睡、易惊、谵妄；头痛、呕吐；肢体抖动、肌阵挛、 眼球震颤、共济失调、眼球运动障碍；无力或急性弛缓性麻痹；惊厥。可见脑膜刺激征，腱反射减弱或 消失。实验室检查可有白细胞和血糖升高。 6.3.3 危重型 重型病例出现下列情况之一者： a) 频繁抽搐、昏迷、脑疝等严重中枢神经系统受损表现； b) 呼吸困难、血性泡沫痰、紫绀等呼吸功 能障碍表现； c) 皮肤花斑、四肢冰凉、心率明显加快、血压明显
10、上升或下降等循环功能障碍表现。 7 鉴别诊断 7.1 其他出疹性疾病 手足口病普通型应与丘疹性荨麻疹、水痘、不典型麻疹、幼儿急疹、带状疱疹以及风疹等疾病鉴别。 可根据流行病学、皮疹形态、部位、出疹时间及顺序、有无淋巴结肿大以及伴随症状等进行鉴别，以皮 疹的形态及部位最为重要。最终可依据病原学和血清学检测结果进行鉴别。 7.2 其他病毒所致脑膜炎或脑炎 由其他病毒引起的脑膜炎或脑炎，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、 EB病毒、流行性乙型脑炎病毒等， 临床表现与手足口病出现的中枢神经系统损害表现相近。对皮疹不典型者，根据流行病学史、病原学或 血清学检查结果做出诊断。 7.3 脊髓灰质 炎 手足口病出现
11、急性弛缓性麻痹（ AFP）时应与脊髓灰质炎鉴别。后者主要表现为双峰热，病程第 2 周退热前或退热过程中出现弛缓性麻痹，且无皮疹。最终依据病原学检测结果鉴别。 7.4 肺炎 WS 5882018 4 手足口病危重型病例可发生肺水肿，应与肺炎鉴别。肺炎主要表现为发热、咳嗽、呼吸急促等呼吸 道症状，一般无皮疹；病情进展相对缓慢，胸片加重或减轻均呈逐渐演变，可见肺实变病灶、肺不张及 胸腔积液等。 WS 5882018 5 附 录 A （规范性附录） 手足口病相关肠道病毒特异性抗体检测 A.1 ELISA检测 EV-A71 IgM抗体 A.1.1 试验材料 试验材料如下： a) 微孔板：包被抗人 IgM
12、； b) 抗原试剂：含 EV-A71抗原； c) 酶标试剂：辣根过氧化物酶标记的 EV-A71抗体； d) 阳性对照：含抗 EV-A71 IgM抗体阳性血清； e) 阴性对照：不含抗 EV-A71 IgM抗体血清； f) 标本稀释液：含蛋白缓冲液； g) 浓缩洗涤液：含不低于 2.5 的表面活性剂； h) 底物： TMB或 OPD； i) 终止液：含硫酸，浓度 2 mol/L。 A.1.2 标本 标本如下： a) 血清或血浆，含或不含 EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的标本。无悬浮纤维蛋白或聚合物、 重度溶 血、细菌污染 。 b) 脑脊液。 A.1.3 步骤 因不同试剂盒操作方法及流程不同，具
13、体操作按照其试剂说明书 进行，本文以 ELISA通用操作为例 ， 检测步骤如下： a) 试剂室温平衡 30 min以上； b) 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水 20倍稀释； c) 编号：将标本对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照 3孔，阳性对照 2孔和空白对照 1孔； d) 加稀释液：每孔加入标本稀释液 100 L，空白孔除外； e) 加样：分别在相应孔中加入待测标本或阴性、阳性对照 10 L，轻轻振荡混匀（脑脊液可以 1 2稀释）； f) 孵育：用封板膜封板后， 37孵育 30 min； g) 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤 5遍，最后一次扣干； h) 加抗原：每孔加入抗原试剂 5
14、0 L，空 白孔除外； i) 加酶：每孔加入酶标试剂 50 L，空白孔除外，轻轻振荡混匀； j) 孵育： 用封板膜封板后， 37孵育 30 min； k) 洗板： 小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤 5遍，最后一次扣干； l) 显色：每孔加入显色剂 A、 B液各 50 L，轻轻振荡混匀， 37避光显色 15 min； WS 5882018 6 m) 测定：每孔加入终止液 50 L，轻轻振荡混匀， 10 min内测定结果 ， 设定酶标仪波长于 450 nm， 用空白孔调零后测定各孔 OD值。 A.1.4 试剂对照范围 A.1.4.1 阴性对照 OD值 0.1。若 1孔阴性对照 OD值 0.1应舍弃，若
15、 2孔或 3孔阴性对照 OD值 0.1，应重 复试验。 A.1.4.2 阳性对照 OD值 0.8。 A.1.5 结果判断 A.1.5.1 临界值（ cutoff）计算：临界值 =0.1+阴性对照 OD均值。（阴性对照孔 OD值低于 0.05按 0.05计 算）。 A.1.5.2 阴性判定：标本 OD值 临界值，为 EV-A71 IgM抗体阴性。 A.1.5.3 阳性判定：标本 OD值 临界值，为 EV-A71 IgM抗体阳性。 A.2 手足口病肠道病毒中和抗体检测 A.2.1 液体配制 A.2.1.1 血清处理液 (A液 ) 100 mL中含下列液体 ： a) MEM， 85 mL； b) 3
16、 L-谷氨酰胺 ， 1 mL； c) 7.5 碳酸氢钠 ， 2 mL； d) 胎牛血清 ， 2 mL； e) 青、链霉素（各 10 000 U/mL） ， 10 mL。 A.2.1.2 细胞营养液 （ B液） 按生长液配方配制， 100 mL中含下列液体 ： a) MEM， 85 mL； b) 3 L-谷氨酰胺 ， 1 mL； c) 7.5 碳酸氢钠 ， 2 mL； d) HEPES， 1 mL； e) 胎牛血清 ， 10 mL； f) 青霉素 、链霉素（各 10 000 U/mL） ， 1 mL。 A.2.1.3 病毒（血清）稀释液 （ C液） 按维持液配方配制， 100 mL中含下列液体
17、： a) MEM， 93 mL； b) 3 L-谷氨酰胺 ， 1 mL； c) 7.5 碳酸氢钠 ， 2 mL； d) HEPES， 1 mL； WS 5882018 7 e) 胎牛血清 ， 2 mL； f) 青 霉素 、链霉素（各 10 000 U/mL） ， 1 mL。 A.2.2 攻击病毒 CCID50滴定和滴度梯度制备 （ EV-A71或 CV-A16） A.2.2.1 将增殖后的病毒悬液冻融 3次，然后在 4 、 12 000 r/min条件下离心 10 min，取上清液分装 于 20支冻存管中，每管 0.5 mL， 保存在 70 冰箱 长期保存。每次中和试验取一管， 每管应在一次试
18、 验中用完，有剩余者应 灭活后 废弃 。 A.2.2.2 加 Eagle液 10倍系列稀释为 10-8 10-1病毒液，各加入细胞板内，每孔 50 L，每稀释度 4孔细 胞 。 A.2.2.3 每孔加细胞悬液 50 L，同时设细胞对照（ 50 L稀释液 +50 L细胞悬液）， 36 培养 7 d，观 察细胞病变 。 A.2.2.4 按 Behrens-Krber公式计算出分离病毒株的 CCID50。 A.2.2.5 正式试验前应先滴定攻击病毒 2次 3次，取其平均值，求出每 0.05 mL中含 100 CCID50的病毒 载量 。 A.2.2.6 按照计算好的稀释 比例 配制攻击病毒，求出试验
19、所需的病毒总量（即 100 CCID50/0.05 mL） 。 A.2.2.7 取 3支小试管，每 支 加病毒稀释液（液体配制中的 C液） 0.9 mL。 A.2.2.8 用带滤芯的吸尖（ ART吸尖）吸 0.1 mL已经 稀释 好的攻击病毒液（即 100 CCID50/0.05 mL）到 第一支小试管中，换另一支 ART吸尖，轻轻并彻底地混匀，避免产生大量气溶胶，按照此方法依次稀释 至 0.1 CCID50/0.05 mL。 A.2.3 稀释血清 A.2.3.1 发病 1 d 7 d内采 集的 患者急性期血清，发病后 3周 4周采 集的 恢复期血清，分别 -20 冻存 备检。 A.2.3.2
20、 取无菌小试管若干支（每份血清使用一支）置试管架上，每管加血清处理液（ A.2.1.1液体配 制中的 A液） 0.3 mL，加待测血清 0.1 mL，盖紧塞子， 振摇 混匀，放 4 冰箱过夜，即为 1:4稀释血清。 次日 56 、 30 min灭活。 A.2.3.3 打开独立无菌包装 48孔组织培养板，纵向使用，每孔加血清稀释液（ A.2.1.3液体配制中的 C 液） 0.3 mL，每份血清使用一排，每排 4孔。使用移液器取处理过的血清 0.1 mL加入第一孔（即为 1:16）， 吹吸 8次 10次，吸 0.1 mL加入第二孔（即为 1:64），依次至 1:1 024，血清稀释的过程中不必换吸
21、尖。 即每份血清标本进行 4倍倍比稀释，即 1:4、 1:16、 1:64、 1:256、 1:1 024。 A.2.3.4 每份血清标本的每个稀释度都要平行做两孔。 A.2.4 病毒中和抗体测定的操作步骤 具体操作步骤如下： a) 取一块 96孔板横向使用，每块板可以做 8份（ 4对）待测血清，版面设计 见图 A.1。 1) A1-A2 孔（ B1-B2、 C1-C2、 D1-D2、 E1-E2、 F1-F2、 G1-G2、 H1-H2）中每孔加入 1:1 024 稀释度的待测血清 0.05 mL，不必换吸尖 ； WS 5882018 8 2) 在 A3-A4 孔（ B3-B4、 C3-C4
22、、 D3-D4、 E3-E4、 F3-F4、 G3-G4、 H3-H4）中每孔加入 1:256 稀释度的待测血清 0.05 mL； 3) A5-A6孔（ B5-B6、 C5-C6、 D5-D6、 E5-E6、 F5-F6、 G5-G6、 H5-H6）中每孔加入 1:64稀释 度的待测血清 0.05 mL； 4) A7-A8 孔（ B7-B8、 C7-C8、 D7-D8、 E7-E8、 F7-F8、 G17-G8、 H7-H8）中每孔加入 1:16 稀 释度的待测血清 0.05 mL； 5) A9-A10 孔（ B9-B10、 C9-C10、 D9-D10、 E9-E10、 F9-F10、 G9
23、-G10、 H9-H10）中每孔加入 1:4稀释度的待测血清 0.05 mL； 6) A11-A12 孔（ B11-B12、 C11-C12、 D11-D12、 E11-E12、 F11-F12、 G11-G12、 H11-H12）为 每份待测血清对照孔，每孔 中补加稀释液 0.05 mL。 图 A.1 病毒中和抗体测定 96 孔板版面设计图 b) 上述孔中分别加入病毒 0.05 mL（病毒滴度事先已经 稀释 为 100 CCID50/0.05 mL） 。 c) 盖好盖子后用微量板混匀器混匀，放入 36 CO2孵箱中孵育 2 h。 d) 另取一块 96 孔板纵向使用，做 100 CCID50/
24、0.05 mL病毒滴度的核实（每次实验都必须做）。 每孔先加病毒稀释液（试剂配制中的 C液） 0.05 mL，然后从 0.1 CCID50/0.05 mL加起，每孔 0.05 mL，每个稀释度 8 孔，不必更换吸尖，一直加至 100 CCID50/0.05 mL；同时留出 4 孔做 为细胞对照孔，每孔加入 0.1 mL病毒稀释液，然后放入 4 冰箱中 暂存 。 e) 在孵育期间，用消化液消化细胞，准备细胞悬液，细胞悬液的浓度为 2105个 /mL，每块 96孔 板至少需要准备 10 mL。 f) 孵育结束后每个待测血清孔、血清对照孔（待检标本板）和病毒回滴孔和细胞对照孔（病毒回 滴板）分别加入
25、 0.1 mL细胞悬液，然后用微量板混匀器混匀，放入 36 CO2孵箱中孵育培养； g) 使用倒置显微镜每天观察 CPE，并记录病毒滴定结果，以不产生细胞病变的血清最高稀释度的 倒数为终点效价。当 100 CCID50/0.05 mL的病毒对照孔出现完全病变时，判定最终结果（ 5 d 7 d） 。 h) 注意：如果病毒对照结果（病毒回滴）不在 32 CCID50/0.05 mL 320 CCID50/0.05 mL的范围内， 实验无效，就要重复实验。 WS 5882018 9 A.2.5 结果判定 A.2.5.1 当最高稀释度血清的 2孔中有 1孔出现细胞病变，另一孔不出现细胞病变，该稀释度的
26、倒数计 即为该血清标本的中和抗体效价 。 A.2.5.2 当高稀释度 2孔完全病变，相邻低 稀释度 2孔完全不病变，则两者平均稀释度的倒数即为该血 清标本的中和抗体效价 。 A.2.5.3 当两个相邻稀释度血清均出现 1孔细胞病变，另 1孔不 出现细胞病变，则两者平均稀释度的倒 数即为该血清标本的中和抗体效价。 A.2.5.4 对于 HFMD患者 的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清 EV-A71或 CV-A16 中和抗体滴度出现 4倍或 4倍以上增高即可确诊 。 A.2.5.5 如恢复期血清较急性期血清其 他 肠道病毒中和抗体滴度出现 4倍或 4倍以上增高可证实该肠道 病毒
27、感染，是否为病因 还应结合临床和流行病学判断。 WS 5882018 10 附 录 B （规范性附录） 手足口病相关肠道病毒 核酸检测 B.1 RT-PCR法检测肠道病毒核酸 B.1.1 试验材料 B.1.1.1 可用于手足口病肠道病毒检测的临床标本：鼻咽拭子、肛拭子、粪便、疱疹液、脑脊液或尸 检标本 ，或其病毒分离培养物 。 B.1.1.2 扩增引物设计 如下： a) 人 肠道病毒核酸检测通用引物序列 （产物长度 116bp） ： PE2（上游）： 5 - TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3 ； PE1（下游）： 5 - ACA CGG ACA CCC
28、AAA GTA GTC GGT CC -3 ； b) EV-A71核酸检测引物序列 （产物长度 226bp）： EV-A71-S（上游）： 5 - GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3 ； EV-A71-A（下游）： 5 - ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3 ； c) CV-A16核酸检测引物序列 （产物长度 208bp） ： CV-A16-S（上游）： 5 -ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3 ； CV-A16-A（下游）； 5 -TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3 。 B.1.1.3 总 RNA提取
29、试剂： 可使用商业化试剂盒提取 RNA。 B.1.1.4 AMV逆转录酶、耐热 DNA聚合 酶和 dNTP等。 B.1.2 操作 步骤 ： 不同试剂盒 RT-PCR操作及反应流程不同，具体操作以说明书为准，本文以两步法 RT -PCR为例。 B.1.2.1 总 RNA提取：按试剂说明提取细胞总 RNA，制备模板 RNA。 B.1.2.2 设计对照， A： 阳性对照： 灭活病毒 对照。 B： 正常 细胞对照。 C：试剂对照：用去离子水代替 标本。 B.1.2.3 逆转录合成 cDNA：根据 AMV逆转录酶生产厂说明书，通过逆转录合成与目的基因 RNA序列互补 的 cDNA B.1.2.4 配置反
30、应体系：不同试剂盒配置体系不同，本文以一般通用方法为例。 具体配置见表 B.1。 表 B.1 PCR反应体系配置（ 50 L体系 ） 试剂名称 体积 10PCR Buffer 5 L 50 mM MgCl2 1.5 L 10 mM dNTP Mix 1 L 上游引物（ 0.1 g/L） 1 L 下游引物（ 0.1 g/L） 1 L WS 5882018 11 Taq DNA 聚合酶（ 5 U/L） 0.5 L cDNA（逆转录产物） 5 L RNase Free dH2O 35 L B.1.2.5 PCR扩增： PCR循环特异性扩增目的基因片度，反应条件： 95预变性 3 min； 95变性
31、30 s， 50退火 30 s， 72延伸 40 s，共扩增 30个 35个循环；最后 72延伸 10 min。 B.1.2.6 用 2琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物。 B.1.3 结果判断 如果 PCR扩增产物电泳条带分子量与预期产物片段大小相同，表明为阳性。 标本的实验室诊断结果 根据表 B.2进行判断。 表 B.2 PCR产物结果判断参照表 待检标本 RT-PCR结果 实验室诊断 结果 EV（）， EV-A71（）， CV-A16（） 肠道病毒阴性 EV（）， EV-A71（）， CV-A16（） 非 EV-A71、 CV-A16的其 他 肠道病毒 EV（）， EV-A71（）， C
32、V-A16（） EV-A71 EV（）， EV-A71（）， CV-A16（） CV-A16 B.1.4 意义 阳性结果表明有手足口病相关肠道病毒感染。 B.2 荧光定量 RT-PCR法 检测肠道病毒核酸 B.2.1 方法 单通道检测 EV-A71，单通道检测 CV-A16，单通道检测肠道病毒；或采用双通道同时检测 EV-A71和 CV-A16；或采用三通道同时检测 EV-A71和 CV-A16和肠道病毒 。 B.2.2 试验材料 B.2.2.1 检测标本：见 B.1.1.1。 B.2.2.2 扩增引物和荧光探针设计 如下： a) CAV16荧光引物探针：上游引物： CAV16YGF： 5 -
33、GGGAATTTCTTTAGCCGTGC-3； 下游引物： CAV16YGR： 5 -CCCATCAARTCAATGTCCC-3 ； 探针（ FAM 荧光素标记）： CAV16YGPB： 5 -(FAM) ACAATGCCCACCACGGGTACACA-(BHQ1)- 3 。 b) EV71荧光引物探针 ： 上游引物： EV71YGF： 5 -TGATTGAGACACGCTGTGTTCTTA- 3 ； 下游引物 ： EV71YGR: 5 - CCCGCYCTGCTGAAGAAACT- 3 ； 探针（ HEX荧光素标记）： EV71YGPB： 5 -HEX -TCGCACAGYACAGCTGAG
34、ACCACTC- (TAMARA)- 3 。 WS 5882018 12 c) 肠道病毒 荧光引物探针：上游引物： EV(YG)F： 5 -GGCTGCGYTGGCGGCC-3 ； 下游引物： EV(YG)R： 5 -CCAAAGTAGTCGGTTCCGC-3 ； 探针（ FAM 荧光素标记）： EVTY(YG)PB： 5 -(FAM) CTCCGGCCCCTGAATGCGG (BHQ1)- 3 。 B.2.2.3 总 RNA提取试剂： 可使用商业化试剂盒提取 RNA。 B.2.2.4 AMV逆转录酶、 DNA聚合酶和 dNTP等；可用一步法荧光定量 RT-PCR试剂。 B.2.3 步骤 B.
35、2.3.1 总 RNA提取：按试剂说明提取细胞总 RNA，制备模板 RNA。 B.2.3.2 设计对照， A： 阳性对照： 灭活病毒 对照。 B： 正常 细胞对照。 C：试剂对照：用去离子水代替 标本 。 B.2.3.3 一步法荧光定量反应体系：不同试剂盒、不同荧光定量仪器的反应体系及试剂名称不同，本 文以一步法单通道检测 EV-A71反应体系为例，具体配置见表 B.3。 表 B.3 RT-PCR检测 EV-A71反应体系配置（ 25 L体系） 试剂名称 体积 2one step RT-PCR buffer 12.5 L Ex Taq HS 0.5 L RT-Enzyme Mix II 0.5
36、 L EV-A71上游引物 :（ 20 M） 0.8 L EV-A71下 游引物 :（ 20 M） 0.8 L EV-A71探针 （ 20 M） 0.4 L RNase Free dH2O 5.5 L RNA模板 4 L B.2.3.4 一 步法荧光定量 RT-PCR扩增：每管加入相应的标本或对照核酸、引物和探针（依据单通道， 双通道或三通道加入相应的探针）和荧光定量 RT-PCR试剂。特异性扩增目的基因片段，反应条件（依据 使用的试剂盒有所不同）： 42逆转录 30 min； 95变性 2 min； 94 10 s， 5 35 s，共扩增 40个循 环。 B.2.4 结果判断 阈值设定原则以
37、阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，或可根据仪器噪音情况进行调整。 标本的实验室诊断结果与普通 RT-PCR法相同，详见 B.1.3。 阈值设定原则 以不同商业化试剂盒设置的 阈 值线 为准 ， 通常试剂盒 结果判断如下： WS 5882018 13 a) Ct值 38.0 或 无数值的标本为阴性 ； b) Ct值 35.0 的样本为阳 性 ； c) Ct值 35.0 38.0 的样本建议重做。 WS 5882018 14 B A 附 录 C （规范性附录） 手足口病相关肠道病毒的分离和鉴定 C.1 肠道病毒分离 C.1.1 标本处理 C.1.1.1 粪便标本的 处理： 在生物安全柜中
38、，取 约 2 g粪便 标本 、 10 mL含有抗生素的完全 PBS、 1 mL 三氯甲烷 加入 50 mL耐 三氯甲烷 的离心管中。使用机械 振荡 器剧烈混匀 20 min，制成粪便悬液。然后 3 000 r/min离心 20 min。在生物安全柜中吸上清至一新冻存管中，以备接种。 C.1.1.2 脑脊液标本的处理 ： 脑脊液标本通常直接用于病毒分离。 C.1.1.3 疱疹液标本的处理 ： 疱疹液标本通常直接用于病毒分离。 C.1.1.4 咽拭子标本的处理 ：咽拭子要在标本运输（ 保存 ）液中充分 振荡 10 s 15 s，以洗下拭子上 粘附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在 4 条件下， 10
39、 000 r/min离心 20 min，用上清接种到细胞上， 如果发现有细菌污染， 应 用滤器过滤除菌。 C.1.2 所需材料 RD、 Vero或 HEp-2等 细胞 ；使用 8mL斜面 细胞 培养管。 C.1.3 操作步骤 C.1.3.1 显微镜下观察单层细胞，以确保细胞是健康的。 传代后 48 h 72 h接种。 C.1.3.2 倒掉生长液（ GM），换上 1 mL 1.2 mL的维持液（ MM） 。 C.1.3.3 每一份标本 至少 需要同时接种 2种细胞， 2支 RD细胞和 2支 HEp-2细胞 ；必要时增加 Vero细胞。 正确标记每支细胞培养管（包括标本的编号、日期、传代数） 。
40、C.1.3.4 每一种细胞至少标记一管作为阴性对照 。 C.1.3.5 每支试管接种 0.2 mL的标本悬液，培养温度要求 36。 C.1.3.6 使用倒置显微镜每天观察细胞培养管，以观察有特征 性的肠道病毒致细胞病变效应（ CPE）的 出现（如细胞变圆，折光增强并脱离管壁等） 。 C.1.3.7 记录接种管和对照管细胞所发生的变化至少一周， 每天观察 细胞 有无 毒性反应、老化或污染 ， 记录 CPE动态变化 （ 1+， 25； 2+， 25 50 ； 3+， 50 75 ； 4+， 75 100 ） 。 C.1.3.8 如果有特征性的肠道病毒 CPE出现要如实记录，并观察直到 75 的细胞
41、 出现 CPE时 ， 将分离物 储藏在 30低温冰箱 以备二次传代 。 C.1.3.9 第 1代培养见可疑细胞病变时继续传 1代 2代，待细胞病变稳定出现后 ， 30低温冰箱保 存 。 WS 5882018 15 C.1.3.10 一代阳性分离物再传二代，如果又有明显的 CPE出现，将病毒保存在 70 冰箱（二代病毒）。 因二代病毒滴度高于用一代病毒，所以选用二代病毒进行鉴定 。 C.2 结果判断 C.2.1 有 CPE出现，判定为病毒分离阳性。 C.2.2 如果 7 d之后没有 CPE出现，盲传 1代继续观察 7 d。盲传 2代后，仍然没有出现 CPE的，则判定为 病毒分离阴性。 C.2.3 病毒分离物的鉴定可以采用附录 B方法进行。 _
