1、 ICS 11.020 C 59 WS 中华人民共和国 卫生 行业标准 WS 295 2019 代替 WS 295 2008 流行性脑脊髓膜炎诊断 Diagnosis for meningococcal meningitis 2019 - 01 - 02 发布 2019 - 07 - 01 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 WS 295 2019 II 前 言 本标准 的 5.1、 5.2、 5.3为强制性条款，其余为推荐性条款。 本标准按照 GB/T 1.1 2009 给出的规则起草。 本标准代替 WS 295 2008流行性脑脊髓膜炎 诊断标准 。 本标准与 WS 295 20
2、08相比，主要技术变化如下： 增加了缩略语（见第 2 章）； 修改了流行病学史（见 3.1， 2008 年版的 2.1）； 修改了临床表现（见 3.2,2008 年版的 2.2）； 修改了“末梢血象”为“血常规”（见 3.3.1， 2008 年版的 2.3.1）； 增加 了 脑脊液检查的结果 （见 3.3.2）； 增加了“ 瘀点（斑）组织液 ”（见 3.3.3.2 和 3.3.3.3）； 修改 了诊断原则 （见 4， 2008 年版的 3） ； 修改了“血清学”为“免疫学”（见 3.3.4， 2008 年版的 2.3.4）； 修改了疑似病例（见 5.1， 2008 年版的 4.2）； 修改了临
3、床诊断病例（见 5.2， 2008 年版的 4.3）； 修改了确诊病例（见 5.3， 2008 年版的 4.4）； 增加了“其他脑膜炎球菌性疾病”（见 7.2）； 增加了 “鉴别 诊断 ” （见 附录 B 的 B.4）； 修改了 脑膜炎奈瑟菌实验室检测方法（见附录 A） ； 根据流行性脑脊髓膜炎流行病学特征的变化，在附录 B 中，对流行性脑脊髓膜炎的病原 学、流行病学和临床表现中的有关描述予以订正（见附录 B） 。 本标准起草单位： 中国 疾病预防控制中心 、 首都医科大学附属北京 地坛医院、山东省疾病预防控 制 中心、甘肃省疾病预防控制中心、山东大学齐鲁儿童医院、 首都医科大学附属 北 京儿
4、童医院、 中国医 学科学院 北京协和医院 。 本标准主要起草人： 李艺星、 崔富强、 邵祝军、李军宏、李兴旺、徐爱强、蒋荣猛、朱兵清、李慧、 盖中涛、申昆玲、 吴丹 、范洪伟 。 本标准所替代标准的历次版本发布情况为： WS 295 2008。 WS 295 2019 1 流行性脑脊髓膜炎诊断 1 范围 本标准规定了 流行性脑脊髓膜炎 的诊断 依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断 。 本标准适用于 全国 各级各类医疗 卫生机构及其医务 人员对 流行性脑脊髓膜炎 的诊断 。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CFU/mL ：每毫升菌落形成单位（ colony-forming unit/mL） DI
5、C：弥散性血管内凝血（ disseminated or diffuse intravascular coagulation） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid） ELISA：酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbent assay） IgG：免疫球蛋白 G (immunoglobulin G) OD：光密度（ optical density） PBS：磷酸盐缓冲液（ phosphate buffer saline） Real-time PCR ：实时荧光聚合酶链式反应 (real-time polymerase chain rea
6、ction) SBA：血清杀菌力试验 (serum bactericidal assays) TTC：氯化三苯基四氮唑 (triphenyl tetrazolium chloride) rpm： 每 分钟 转数 （ revolutions per minute） WHO： 世界 卫生组织 (world health organization) 3 诊断依据 3.1 流行病学史 当地有本病发生或流行，或发病前 10 d内 有流行性脑脊髓膜炎流行地区居住或旅行史。 3.2 临床表现 3.2.1 潜伏期 数小时至 10 d，一般为 2 d 3 d。 3.2.2 主要临床症状和体征 3.2.2.1 发
7、热、头痛、呕吐，和（或）有脑膜刺激征，婴幼儿可见前囟隆起。重症患者可有不同程度 的意识障碍和（或）感染中毒性休克。 3.2.2.2 皮肤 、黏 膜 出现 瘀点 （ 斑 ）。瘀斑可迅速扩大融合成片 。 WS 295 2019 2 3.3 实验室检测 3.3.1 血常规 白细胞总数 、 中性粒细胞 计数 明显 升高 。 3.3.2 脑脊液 常规 典型 改变为 压力增高 ， 外观呈浑浊米汤样或脓样；白细胞数明显增高，并以多 形 核 白 细胞增高为主； 糖及氯 化物明显减少，蛋白含量升高。 但在病程初期仅有压力升高，外观清亮，随后出现典型改变，暴 发休克型患者脑脊液 通常 清亮，蛋白、细胞数和糖亦无变
8、化。 3.3.3 病原学 3.3.3.1 瘀点（斑）组织液、 脑脊液涂片检测， 可在 多 形 核 白 细胞 内 或细胞 外 见到 革兰阴性肾形双球菌 。 3.3.3.2 脑脊液、 血 液、瘀点（斑）组织液培养脑膜炎奈瑟菌阳性。 3.3.3.3 脑脊液、 血 液、瘀点（斑）组织液脑膜炎奈瑟菌特异性核酸检测阳性。 3.3.4 免疫学 3.3.4.1 急性期 脑脊液样品脑膜炎奈瑟菌 特异性多糖抗原 检测阳性。 3.3.4.2 恢 复期血清 脑膜炎奈瑟菌 特异性 IgG 抗体 检测，其 效价较急性期呈 4 倍或 4 倍以上升高 。 4 诊断原则 根据流行病学史和临床表现及 血常规和 (或 )脑脊液 常
9、规检测结果 做出疑似 病例和（或） 临床 诊断 病 例的 诊断。 确诊需要脑膜炎奈瑟菌病原学或免疫学检测结果， 对 病原学检测阳性的 病例进一步 做出病原学分群 诊断（见附录 A 的 A.3）。 5 诊断 5.1 疑似病例 同时符合 3.1和 3.2.2.1，并同时符合 3.3.1、 3.3.2任一项。 5.2 临床诊断 病例 符合 5.1并同时符合 3.2.2.2。 5.3 确诊病例 符合 5.1或 5.2，并同时符合 3.3.3、 3.3.4中任一项。 5.4 临床分型 在临床诊断或确定诊断基础上，进行临床分型诊断（参见附录 B的 B.3）。 WS 295 2019 3 6 鉴别诊断 主要
10、和其他细菌所致的脑膜炎、其他原因所致的脓毒症、各种原因引起的紫癜等疾病鉴别。婴幼儿 还 应 与高热惊厥等疾病鉴别（ 参 见附录 B的 B.4）。 7 其他 7.1 带菌者 无临床症状和体征，咽拭子培养脑膜炎奈瑟菌阳性或脑膜炎奈瑟菌特异性核酸检测阳性。 7.2 其他脑膜炎球菌性疾病 人感染脑膜炎奈瑟菌后，大部分为无症状带菌者。出现症状者，临床疾病谱复杂 多样，除 可引起 脑 脊髓膜炎 外，还可 引起脓毒症、肺炎，偶也可引发关节炎、心肌炎、心包炎和眼内炎等 疾病 。 WS 295 2019 4 附 录 A （规范性附录） 脑膜炎奈瑟菌实验室检测方法 A.1 样品采集、处理和运送 A.1.1 样品采
11、集和处理 A.1.1.1 脑脊液 无菌操作采集脑脊液至少 2 mL，采集后立即送往微生物学实验室。如有条件，建议床旁接种，将适 量脑脊液（ 0.1 mL 0.5 mL）接种于 5羊血巧克力平板 (以下简称巧克力平板 )或血平板，三区划线后 送至实验室进行培养。 实验室收到脑脊液样品后， 应在 1 h内进行检测。首先 将样品放入无菌试管， 2 000 rpm 3 000 rpm，离心 20 min，吸出上清液。上清液可用于脑膜炎奈瑟菌特异抗原检测，亦可将其置于 -20，进 行其他检测。沉淀物部分应进行充分振荡混匀，用于培养及镜检。如脑脊液样品不足 1 mL，则不进行 离心，直接进行平板接种培养和
12、革兰染色镜检。 A.1.1.2 血液 如需开展核酸检测（如 Real-time PCR检测）， 在离心之前无菌操作留取脑脊液样品 200 L， -20 以下保存。 无菌采集患者急性期静脉血液 5 mL 10 mL，立即送往微生物学实验室进行 处理和 检 测。建 议床 旁 接种，将适量的血液（ 5 mL 10 mL）立即注入血培养瓶内，或将 0.5 mL血液直接接种于巧克力 平板或血平板。剩余血液样品用于 脑膜炎 奈瑟菌 特异性核酸检测或 IgG抗体检测。采集患者发病急性期 和恢复期双份血液样品，分离血清，检测 脑膜炎奈瑟菌 特异性 IgG抗体。采集血液样品过程中应不使用 抗凝剂。 建议在抗感染
13、治疗之前，同时在 不同部位 各 采集 1份 ，共 2份 血液样品 进行 培养。新生儿采集 1份 血液样 品 。 A.1.1.3 瘀点或瘀斑 选取患者皮肤上的新鲜瘀点或瘀斑，先用碘伏消毒，再用 70 的酒精擦除碘伏 ，待酒精完 全挥发后 用无菌针头挑破，挤出组织液，用消毒后的玻片直接蘸取组织液涂片，革兰染色镜检；随后用无菌棉签 蘸取组织液接种于巧克力平板或血平板，三区划线后送至实验室进行培养。 A.1.2 样品的运送 脑膜炎奈瑟菌对温度较为敏感， 避免 样品暴露于阳光、高温或寒冷的环境，温度过低或过高均可导 致 病原 菌死亡。在运送样品或培养物时，应保持样品处于 25 35之间，不能低温运送（
14、用于 检测抗 体和核酸的样品除外）。 A.2 脑膜炎奈瑟菌培养及镜检 A.2.1 脑脊液样品培养 WS 295 2019 5 用灭菌的毛细管或微量移液器吸头吸取沉淀物直接接种 于 巧 克力平板和 （ 或 ） 血平板，三区划线。 5 CO2环境， 37，培养 24 h 72 h，每日检查细菌生长情况，及时对平板上的疑似菌落进行转种和 鉴定 。 A.2.2 脑脊液样品镜检 吸取脑脊液样品离心后的沉淀物 10 L 20 L， 滴于载玻片上并涂开，在生物安全柜中风干玻片并 快速通过火焰 3次以固定涂片，注意避免灼干。结晶紫染色 1 min，用流动水冲洗玻片 1 min，去除多余 水分；革兰碘液媒染 1
15、 min，用流动水冲洗玻片并干燥； 95 乙醇脱色 5 s 10 s；用番红染液复染 20 s 30 s，或用酚红复染 10 s 15 s，流动水冲洗玻片并晾干或蘸干。显微镜观察染色的涂片，在亮视 野的透镜和油镜下，脑膜炎奈瑟菌位于多形核白细胞内 或细胞 外，为革兰阴性、肾形双球菌 。 A.2.3 血液样品分离培养 实验室接收到已接种血液样品的平板或血培养瓶后应立即置于 37 、 5 CO2的 环境 中 ，培养 24 h 72 h。如使用血培养瓶，每日观察细菌生长情况，如发现细菌生长，无菌操作取 0.5 mL接种于巧克力平 板和 （ 或 ） 血平板 。 A.2.4 脑膜炎奈瑟菌菌落形态 脑膜炎
16、奈瑟菌可在血平板或巧克力平板上生长。在血平板上培养 18 h 20 h后，可见圆形、光滑、 湿润、中央凸起、边界清晰、灰色的菌落，不溶血，菌落直径达 1 mm。在巧克力平板上生长的菌落呈 现大菌落、无色或灰色、不透明 。 A.2.5 脑膜炎奈瑟菌生化特征 采用氧化酶试验和糖代谢试验进行脑膜炎奈瑟菌的鉴定。如果氧化酶试验阳性，再进行糖代谢试 验。脑膜炎奈瑟菌能氧化葡萄糖和麦芽糖，但不氧化乳糖和蔗糖 。 A.3 脑膜炎奈瑟菌血清学分群 A.3.1 试验方法 通过血清玻片凝集法可对脑膜炎奈瑟菌进行血清群鉴定， 目前脑膜炎奈瑟菌已经确定了 12个不同 的血清群，其中， A、 B、 C、 W、 X和 Y
17、是最 常见的引起流行性脑脊髓膜炎的 6种血清群 。 A.3.2 实验操作 用乙醇擦净一块载玻片，用蜡笔或其它记号笔将载玻片分为多个部分，在每个部分的近底部处加 10 L灭菌生理盐水，用无菌接种环 或 针、涂棒或牙签从巧克力平板或血平板上挑取适量细菌培养物， 在生理盐水中将培养物制成略呈乳液状的悬液用于测试。在每个部分的上部加上所选的血清 10 L或 10 L生理盐水 或 PBS。在亮光下或黑色背景下，将血清或生理盐水与各自的菌悬液混合，摇动玻片 1 min 2 min（时间可能因血清生产商不同而有所差异） 。 鉴于生物安全， WHO推荐使用福尔马林灭活的脑膜炎奈瑟菌悬液，而不是活菌的生理盐水悬
18、液。福尔马林是一种致 癌物，在储存和使用时应高度小心，操作应在 生物 安全柜中进行 。 A.3.3 实验结果的读取 WS 295 2019 6 血清可分群的脑膜炎奈瑟菌应只与一种分群血清凝集，与生理盐水或 PBS不发生凝集。如果在生理 盐水或 PBS中凝集 ， 说明脑膜炎奈瑟菌有自凝性，判为自凝菌；如果无自凝现象，但与两种或两种以上 血清发生凝集，判为多凝菌；与任何一种血清或生理盐水 或 PBS都不能发生凝集，判为不凝菌；以上三 种情况均可报告为“血清不可分群脑膜炎奈瑟菌” 。 A.4 流行性脑 脊髓膜炎 Real-time PCR诊断 A.4.1 种特异性 Real-time PCR检测 A
19、.4.1.1 ctrA基因检测 绝大部分脑膜炎奈瑟菌含有 ctrA基因 （荚膜转运基因） ，少数菌株会缺失 ctrA基因成不可分群菌 株。脑膜炎奈瑟菌侵袭性病例多由有荚膜的菌株感染引起， 检测 脑脊液、血液等无菌部位样品时，可 采用 ctrA基因作为靶基因进行 Real-time PCR检测。 ctrA基因 Real-time PCR引物和探针序列如下 ： ctrA-F： 5 -TGTGTTCCGCTATACGCCATT-3 ctrA-R： 5 -GCCATATTCACACGATATACC-3 ctrA-Pb： 5 -(FAM)AACCTTGAGCAATCCATTTATCCTGACGTTCT
20、(SpC6) -3 “ T”标记淬灭基团 BHQ1。 A.4.1.2 sodC基因检测 脑 膜炎奈瑟菌均含有 sodC基因 （铜 -锌超氧化物歧化酶基因） ，其他种属细菌，如嗜血杆菌等也含 有 sodC基因。如果考虑不可分群脑膜炎奈瑟菌也可偶然引起疾病，可检测 sodC基因，其引物和探针序 列如下 ： sodC-F： 5 -GCACACTTAGGTGATTTACCTGCAT-3 sodC-R： 5 -CCACCCGTGTGGATCATAATAGA-3 sodC-Pb： 5 -(FAM)CATGATGGCACAGCAACAAATCCTGTTT(BHQ1)-3 A.4.2 血清群特异性 Real-
21、time PCR检测 ctrA或 sodC基因阳性的样品，可判断为脑膜炎奈瑟菌感染，需进行血清群特异性基因检测，以确定 脑膜炎奈瑟菌血清群。相应引物和探针序列 见表 A.1： 表 A.1 脑膜炎奈瑟菌血清群鉴定 Real-time PCR 引物和探针序列 血清群 检测基因 引物 /探针序列（ 5 -3 ） A sacB F： AAAATTCAATGGGTATATCACGAAGA R： ATATGGTGCAAGCTGGTTTCAATAG Pb： FAM-CTAAAAGTAGGAAGGGCACTTTGTGGCATAAT-SpC6 B synD F： GCTACCCCATTTCAGATGATTTGT
22、 R： ACCAGCCGAGGGTTTATTTCTAC Pb： FAM-AAGAGATGGGYAACAACTATGTAATGTCTTTATTT-SpC6 WS 295 2019 7 C synE F： CCCTGAGTATGCGAAAAAAATT R： TGCTAATCCCGCCTGAATG Pb： FAM-TTTCAATGCTAATGAATACCACCGTTTTTTTGC-SpC6 W synG F： TATTTATGGAAGGCATGGTGTATG R： TTGCCATTCCAGAAATATCACC Pb： FAM-AAATA”T”GGAGCGAATGATTACAGTAACTATAATGA
23、A-SpC6 X xcbB F： TGTCCCCAACCGTTTATTGG R： TGCTGCTATCATAGCCGCC Pb： FAM-TGTTTGCCCACATGAATGGCGG-BHQ1 Y synF F： TCCGAGCAGGAAATTTATGAGAATAC R： TTGCTAAAATCATTCGCTCCATAT Pb： FAM-TATGGTGTACGATATCCCTATCCTTGCCTATAAT-SpC6 注 ： “ T”标记淬灭基团 BHQ1。 A.4.3 临床样品 DNA处理 采用市售的 DNA提取试剂盒，提取脑脊液、血液、 瘀点 （ 斑 ） 组织 液 等临床样品中脑膜炎奈瑟菌的
24、 DNA，不推 荐采用直接煮沸方法。根据临床样品的类型、数量，以及其他革兰阳性菌感染的可能性，在 提取临床样品 DNA前期处理时，建议加入溶菌酶和变溶菌素 。 A.4.4 Real-time PCR反应体系和反应条件 PCR反应体系以 20 L为例， 2 PCR反应混合物 10 L，上下游引物、探针各 2 L（ ctrA上下游引物 和探针终浓度分别为 0.9 mol/L、 0.9 mol/L、 0.1 mol/L， sodC上下游引物和探针终浓度分别为 0.3 mol/L、 0.6 mol/L、 0.1 mol/L，分群引物和探针终浓 度分别为 0.6 mol/L、 0.6 mol/L、 0.
25、1 mol/L），根据荧光 PCR仪的要求确定是否加入参比荧光 Rox 及加入量， DNA模板 2 L，超纯水补齐至 20 L。反应条件：退火温度 60，共 50个循环；其他反应条件根据所使用的 2 PCR反应混合物的说明 书进行调整 。 A.4.5 Real-time PCR 检测结果的判断 扩增图应呈光滑的 S型曲线，如果曲线的形状改变，应判断为阴性或者重新检测。手动拖拽阈值线 至基线上方后读取 Ct值，根据以下标准判断检测结果。 “阳性”： Ct 值 36；“阴 性”： Ct 值 40；“可疑”： Ct 值介于 36 40 Ct 值介于 36 40，结果为可疑，应重新检测。重新检测时可采
26、取以下两种方法： a) 将模板稀释 4 10 倍和用 4 L 模板代替 2 L 两种方法重复检测。如果 Ct 值 36， 该 样 品判断为阳性，否则为阴性 。 b) 同时设置三个平行孔检测，如果两个或三个孔出现良好的扩增曲线，判断为阳性，否则为 阴性。 WS 295 2019 8 A.5 采用 PCR辅助鉴定疑似菌株 A.5.1 种特异性鉴定 crgA基因存在于所有脑膜炎奈瑟菌中，曾作为靶基因用于脑膜炎奈瑟菌种特异性鉴定。但由于部分 乳糖奈瑟菌也存在与脑膜炎奈瑟菌高度同源的 crgA基因，建议结合 crgA基因和 sodC基因的检测结果进行 判定，两个基因检测结果同时阳性时可判定为脑膜炎奈瑟菌
27、。 crgA和 sodC引物序列 见 表 A.2： 表 A.2 脑膜炎奈瑟菌种属鉴定普通 PCR 引物序列 检测基因 引物序列（ 5 -3 ） crgA F： GCTGGCGCCGCTGGCAACAAAATTC R： CTTCTGCAGATTGCGGCGTGCCGT sodC F： AGCACACGAGCATAATACGAT R： TAACCATGTTGTTTTGCACCT A.5.2 脑膜炎奈瑟菌分群鉴定 对明确鉴定为脑膜炎奈瑟菌的菌株可采用 普通 PCR方法进行分群鉴定，相应引物序列 见 表 A.3： 表 A.3 常见 脑膜炎奈瑟菌分群鉴定普通 PCR 引物序列 血清群 检测基因 引物序列
28、（ 5 -3 ） A orf-2 F： CGCAATAGGTGTATATATTCTTCC R： CGTAATAGTTTCGTATGCCTTCTT B siaD F： GGATCATTTCAGTGTTTTCCACCA R： GCATGCTGGAGGAATAAGCATTAA C siaD F： TCAAATGAGTTTGCGAATAGAAGGT R： CAATCACGATTTGCCCAATTGAC Y siaD F： CTCAAAGCGAAGGCTTTGGTTA R： CTGAAGCGTTTTCATTATAATTGCTAA W siaD F： CAGAAAGTGAGGGATTTCCATA R： C
29、ACAACCATTTTCATTATAGTTACTGT X ctrA F： GTCTTTGTATAAGGCCCAAG R： TTGTCGCGGATTTGCAACTA E ctrA F： ATTACGCTGACGGCATGTGGA WS 295 2019 9 R： TTGTCGCGGATTTGCAACTA Z ctrA F： TATGCGGTGCTGTTCGCTATG R： TTGTCGCGGATTTGCAACTA A.5.3 样品处理 可采用目前市售的 DNA提取试剂盒提取菌株 DNA。也可采取直接煮沸方法，用适量灭菌蒸馏水制备 菌悬液，沸水浴 10 min， 12 000 rpm 离心 5 m
30、in，取上清液作为 PCR扩增模板 。 A.5.4 PCR扩增及产物检测 94预变性 5 min； 94 30 s， 55 60 30 s， 72 40 s， 30个循环； 72终末延伸 5 min。 反应产物用 1.5 琼脂糖凝胶电泳检测，电压 5 V/cm。 A.6 胶乳凝集试验 A.6.1 样品的处理和检测 应严格按照试剂盒说明书操作。为了获得最佳的结果，脑脊液样品的上清液应尽快检测；如果样 品不能立即检测，应于 2 8短期（ 4 h 6 h）冷藏，或 -20以下长期冻存。乳胶试剂置于 2 8 保存，不能冻存。 乳胶凝集试验检测脑脊液样品的步骤应遵循试剂盒推荐方法。一般步骤如下： a)
31、1 000 g 离心脑脊液样品 10 min 15 min，收集上清液，沉淀用于革兰染色和培养 。 b) 上清液 100，加热 3 min。 c) 混匀乳胶凝集试剂 。 d) 滴 1 滴乳胶试剂在卡片上或者玻片上 。 e) 在乳胶液中加入 30 L 50 L 上清液 。 f) 最好在震荡器上慢速（ 100 rpm）摇动；如无条件，手动摇晃 2 min 10 min。 注：混匀时尽量避免交叉污染 。 g) 在明亮处观察凝集试验的结果。 A.6.2 结果判断 阳性结果：在 2 min 10 min内乳胶颗粒凝集（或可见团块） 。 阴性结果：悬液仍均质，出现轻微的浑浊 （似牛奶）。 A.7 酶联免疫
32、吸附试验 (ELISA) ELISA法可检测患者 急性期和恢复期血清 特异性 IgG抗体水平。严格遵照试剂盒的操作说明进行检 测 。 A.8 血清杀菌力试验 （ SBA） A.8.1 靶菌 WS 295 2019 10 作为靶菌的脑膜炎奈瑟菌对补体 的 自然杀菌作用 应 具有耐受性，但对杀菌抗体反应敏感 。 A.8.2 稀释液制备 灭菌磷酸盐缓冲液（ DPBS）：含 0.5 mmol/L MgCl2， 0.9 mmol/L CaCl2； pH 7.4。配制的稀释液分 装于小瓶中，置于 4，备用 2周。 使用前每 100 mL稀释液加 灭菌 10%葡萄糖 1 mL。 A.8.3 滴定板、补体及琼
33、脂选择 滴定板选择 96孔“ U”型底或“平”底细胞培养板。补体一般采用 3周 4周幼龄兔血清，要求无自 然杀伤靶菌活性，但加入已知阳性参考血清时应产生较高杀菌抗体滴度。琼脂使用氯化三苯基四氮唑 琼脂培养基（ TTC琼脂） 。 A.8.4 阳性参考血清制备 用脑膜炎奈瑟菌免疫兔制备的诊断血清， 不 加防腐剂 ，经预试 验 测定其杀菌抗体滴度较高（ 1:3 200以上）；或 用 人抗 脑膜炎奈瑟菌 参考品血清 CDC1992。 A.8.5 杀菌抗体测定步骤 A.8.5.1 靶菌液的制备 将 A、 B、 C、 W和 Y群 等 脑膜炎奈瑟菌纯培养物制成轻度混浊的均匀菌悬液， 600 nm波长下测量
34、OD 值为 0.35左右，菌液的最终浓度为 4 000 CFU/mL。稀释的靶菌悬液在 1 h内用完。若室温较高，可将菌 液管置冰中，以防靶菌迅速死亡 。 A.8.5.2 杀菌抗体的测定 待检血清样品置于 56， 30 min灭活补体，滴定板每孔内 加 25 L稀释液，每排第一孔内加 25 L 灭活的待检血清，用移液器从第一孔吹吸 5次 10次，吸出 25 L至下一孔， 如此 做 连续倍比稀释至最 后一孔 。从低温冰箱内取出补体，于低于 10 的水中摇动将其速溶，每孔加 25 L等体积 混合的 补体靶 菌混合液（补体和菌悬液各 12.5 L）。滴定板置微型振荡器上中速振荡 5 min， 37，
35、 无 CO2环境 ， 培 养 60 min 90 min，取出后每孔加 50 L已融化并冷却至 45左右的 TTC琼脂，边振荡边加 TTC琼脂。将 滴定板置 5 CO2环境， 37培养 15 h 20 h后观察结果 。 A.5.8.3 实验对照 阳性 质控 血清对照 （稀释液 12.5 L、阳性质控血清 12.5 L、 活补体 12.5 L和菌液 12.5 L） ；补 体对照 (稀释液 25 L、活 补体 12.5 L和菌液 12.5 L，检查补体自然杀菌活性 )；细菌生长对照 (稀释液 25 L、灭活补体 12.5 L和菌液 12.5 L)； 被检血清 对照（被检血清 25 L、灭活补体 1
36、2.5 L和菌液 12.5 L，检查被检血清自然杀菌活性）。每批次检测中应有一组上述四种对照试验。菌落计数：取菌液 12.5 L，滴加到一个巧克力琼脂平皿的一端，沿着划好的两条线倾斜往下流，在 37， 5 CO2环境，与 滴 定板 同时培养，次日检查每滴靶菌的纯度并记录菌落数，平板上生长的菌落数每 12.5 L应为 50 CFU 60 CFU。 A.5.8.4 结果判断 检查上述四种对照试验的结果，补体对照、抗体对照和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点 状小菌落；阳性参考血清应达到原来确定的杀菌滴度。以补体对照为参照计算杀菌率，杀菌 率为 50 的血清稀释度即为特异性体外杀菌滴度，即若所试各
37、孔中红色点状菌落数目明显少于补体对照孔 50 WS 295 2019 11 以 下或不出现红色点状菌落时，则判断为杀菌阳性；如果所测试孔中的菌落数目接近补体对照孔的一 半以上或 更多时，则判断为杀菌阴性。出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴 度。 SBA可用于测定患者急性期和恢 复期血清中 杀菌抗体 水平，也可用于 健康 人群血清 杀菌 抗体 检测 。 WS 295 2019 12 附 录 B （资料性附录） 病原学、流行病学、临床分型和鉴别诊断 B.1 病原学 B.1.1 脑膜炎奈瑟菌 流行性脑脊髓膜炎的病原菌为脑膜炎奈瑟菌，俗称脑膜炎双球菌，为肾形或豆形革兰阴性双球菌。 在患者脑
38、脊液中，多位于 多形核白细胞内或细胞外， 形态典型。新分离的菌株大多带有荚膜和菌毛，人 工培养后可成卵圆形或球形，排列不规则。 脑膜炎奈瑟菌的主要致病成分为内毒素，内毒素作用于小血管和毛细血管，引起坏死、出血，出现 皮肤瘀点 （斑） 和微循环障碍，严重脓 毒症时，大量内毒素释放可造成 弥 散 性血管内凝血 （ DIC）及中 毒性休克。 B.1.2 血清分群 根据荚膜多糖的结构，脑膜炎奈瑟 菌 可分为 A、 B、 C、 X、 Y、 Z、 E、 W、 L、 H、 I、 K等 12个血清群。 B.1.3 生物特性 脑膜炎奈瑟菌对环境的抵抗力低，对寒冷、干燥、高温、日光及紫外线都很敏感。化学药剂，如
39、1 酚、 0.1升汞、 0.1新洁尔灭、 0.01杜灭芬、 75酒精等处理很快死亡。脑膜炎奈瑟菌能产生自溶 酶，在保护剂中（如卵黄盐水和脱脂奶），特别是传代菌株放置冷暗处，自溶酶活力受到抑制，可延长 保存时间，在 培养基或保护剂中置 4 6，最长可存活 2个月。 B.2 流行病学 B.2.1 传染源 带菌者和患者。 B.2.2 传播途径 病原菌主要通过咳嗽、喷嚏、说话等由飞沫传播，进入呼吸道引起感染。密切接触对 2岁以下婴幼 儿的传播有重要意义。 B.2.3 人群易感性 人群普遍易感。发病年龄多从 2月龄 3月龄开始， 6月龄至 2岁时发病率最高，以后随着年龄的增长 而逐渐降低。易感人群受脑膜
40、炎奈瑟菌感染后， 60 70成为无症状带菌者， 25表现为皮肤瘀点， 7表现为上呼吸道感染，仅 1表现为化脓性脑膜炎。 B.2.4 流行特征 B.2.4.1 地区分布 WS 295 2019 13 全球均有流行性脑脊髓膜炎病例发生。 A群 脑膜炎奈瑟菌 曾引起全球大流行。目前欧美地区流行的 血清群主要为 B群、 C群或 Y群， W群则为非洲流行性脑脊髓膜炎主要流行血清群。历史上我国流行性脑脊 髓膜炎的流行血清群以 A群为主， 自 2003年以来 C群流行性脑脊髓膜炎逐渐流行。 自 2010年 以来 A群流行 性脑脊髓膜炎病例明显减少， 而 出现 B群及 W群 流行性脑脊髓膜炎 病例的地区呈增多
41、的趋势，个别省份出 现 X群和 Y群 流行性脑脊髓膜炎 病例。 B.2.4.2 周期性 在脑膜炎球菌疫苗广泛应用以前，约 3年 5年出现一次小流行， 8年 10年出现一次较大流行。广 泛接种脑膜炎球菌疫苗，可持续保持较低的流行性脑脊髓膜炎发病水平，流行高峰不再明显。 B.2.4.3 季节分布 流行性 脑脊髓膜炎 全年皆可发生，以冬春季节发病较多。 B.3 临床分型 B.3.1 普通型 B.3.1.1 上呼吸道感染期 有发热、咽痛、鼻炎和咳嗽等上呼吸道感染症状。部分病人有此期表现。 B.3.1.2 脓毒症期 有 恶寒、高热 、 头痛 、 呕吐 、 乏力 、 肌肉酸痛 、 神志淡漠等 症状 。约
42、70 患者皮肤及黏膜出现 瘀 点 （斑） 。 B.3.1.3 脑膜炎期 多与脓毒症期症状同时出现。发病后 24 h，除高热及毒血症外，主要表现为剧烈头痛、呕吐， 可呈 喷射性 ， 烦躁不安，脑膜刺激征阳性。颅压增高明显者有血压升高、脉搏减慢等。严重者可进入谵妄、 昏迷。婴幼儿 的症状 多不典型 ， 表现为 高热 、 拒食 、烦躁、 啼哭不安 ， 惊厥 、 腹泻及咳嗽较成人多见。 前囟未闭者 囟 门 可有隆起 ，而脑膜刺激征可能不明显。 B.3.1.4 恢复期 经治疗体温逐渐下降至正常，意识及精神状态改善，皮肤瘀点 （斑） 吸收或结痂愈合。神经系统检 查均恢复正常。约有 10的患者出现口周疱疹。
43、患者一般在 1周 3周痊愈。 普通型约占 90。各期不易严格区分。 B.3.2 暴发型 B.3.2.1 休克型 又 称 “ 暴发型脑膜炎 奈瑟 菌 脓毒 症 ” 。 起病急骤 ， 寒战、高热或体温不升，严重中毒症状 ， 短 时间 （ 12 h内 ） 出现遍及全身的瘀点 （ 斑 ） ,迅速扩大 ， 或继以瘀斑中央坏死。休克为重要表现 : 面色灰白 、 唇及指 （趾） 端紫绀 、 四肢厥冷 、 皮肤花斑状 、 脉细速 、 血压下降 ； 易并发 DIC。多无脑膜刺激征，脑 脊液检查多无异常。 WS 295 2019 14 B.3.2.2 脑膜脑炎型 除有高热、头痛和呕吐外，可迅速陷入昏迷 ， 频繁
44、抽搐， 锥体束征阳性 ,血压持续升高。球结膜水 肿。部分病人 出现脑疝 (小脑幕切迹疝 、 枕骨大孔疝 )，表现为双侧 瞳孔不等大，对光反应迟钝或消失 ， 可出现呼吸不规则，快慢深浅不一或骤停，肢体肌张力增强等 症状 。 B.3.2.3 混合型 同时具备休克型和脑膜脑炎型的临床表现，此型最为凶险，预后差，病死率高。 暴发型病情凶险，进展迅速，如不及时治疗，发病 6 h 24 h内即可危及生命。 婴幼儿 病死率 可高 达 50。 B.3.3 轻型 临床表现为低热、轻微头痛、咽痛等上呼吸道感染症状；皮肤黏膜可有少量细小出血点；亦可有脑 膜刺激征。脑脊液可有轻度炎症改变。 B.4 鉴别 诊断 B.4
45、.1 肺炎链球菌脑膜炎 无 明显季节性， 散发 。 多数病人有肺炎、中耳炎、乳突炎、鼻窦炎等感染灶，部分病人继发于颅脑 外伤骨折之后或脑外科术后。皮肤、 黏膜 出现瘀点 （斑） 较为少见。依据脑脊液 和血液病原学检查可确 诊。 B.4.2 流感嗜血杆菌脑膜炎 无 明显季节性， 散发 。 起病较为缓慢，病初多有明显的上呼吸道感染、肺炎或中耳炎症状。脑膜炎 症状与其 他 化脓性脑膜炎相似，偶有皮肤、黏膜瘀点。依据脑脊液 和血液病原学检查可确诊。 B.4.3 金黄色 葡萄球 菌 脑膜炎 多 继 发于皮肤感染或 金黄色 葡萄球 菌脓毒症 ， 常于 化脓性感染数日或 数周后发病 ，感染中毒症状重， 可见
46、猩红热样皮疹、化脓性皮炎、肺炎、肺脓肿等表现。依据脑脊液 和血液病原学检查可确诊。 B.4.4 大肠埃希菌脑膜炎 多见于新生儿 ，常由于早产、 损伤性 分娩和母亲感染 所致 。 亦可 发生于颅脑 外伤或 颅脑手术 及 鼻窦、 乳突 等灶性感染或手术 后 。 本病 易并发脑室脑炎 。皮肤、 黏膜 出现瘀点 （斑） 少见。依据脑脊液 和血液 病原学检查可确诊。 B.4.5 新型 隐球菌 脑膜炎 多数起病 缓慢 ， 可呈亚急性。 初期 症状不明显，常有头痛 ， 可位于前额、双侧颞部、枕后或眼眶后， 多为 胀痛或 钝痛 ， 呈 间歇性。 伴 低热或不发热。 脑脊液 细胞数轻 、 中度增加 ， 以淋巴细
47、胞为主 ， 早期也 可呈现中性粒细胞为主 ； 蛋白质 水平轻、中度 增高， 葡萄糖 和氯化物降低。 依据涂片、 培养分离、组织 病理 标本发现有 荚膜 的酵母菌 可确诊 新型隐球菌 感染 。 B.4.6 结核 性 脑膜炎 WS 295 2019 15 无 季节性。 多有 结核病史 或 密切接触史。 起病较缓慢 ， 也有急性起病， 病程较长 ， 脑膜刺激征较明 显，脑实质 通常无明显病变，晚期可有脑实质病变表现 。有 发热 、盗汗、消瘦等症状 ， 神经系统症状出 现较晚。 皮肤、 黏膜 不出现瘀点 （斑） 。脑脊液 以单核细胞为主 ，蛋白增高 ，糖 和 氯化物 降低 。 脑脊 液抗酸杆菌涂片及分
48、枝杆菌培养阳性，菌种 鉴定为结核分枝杆菌复合群可确诊，但阳性率较低。脑 脊液分枝杆菌核酸检测阳性有助于快速确定病原学诊断。脑脊液和血液的 -扰素释放试验阳性， 可辅助诊断。 必要时可 X线 胸片 和 眼底检查， 协助 鉴别。 B.4.7 流行性 乙型脑炎 主要经蚊媒传播。蚊虫 孳生季节 发病 。 有发热、头痛、喷射性呕吐， 发热 2 d 3 d后 出现不同程度 意识障碍。皮肤、 黏膜 不出现瘀点 （斑） 。 脑脊液 清亮 ， 脑脊液 细胞 数中度增加 ，蛋白质轻度增高，糖 和 氯化物基本正常 。依据血清学检查 和病原学检查可确诊。 B.4.8 中毒型细菌性痢疾 高热， 全身中毒症状严重，可有 嗜睡、昏迷及抽搐 ， 迅速发生循环和呼吸衰竭。 临床主要 表现为严 重毒血症、休克和（ 或 ） 中毒性 脑病 。发病初期 腹痛及腹泻症状 很轻 或无， 发病 24 h内可 出现腹泻及 痢 疾 样便。 作肛拭 或生理盐水灌肠镜检便标本，可见大量脓、白细胞。 B.4.9 肾综合征 出血热 多有鼠类接触史，以发热、出血、肾功能损伤为主要表现。初期 出血现象较轻， 表现为酒醉貌、结 膜 充血水肿 ， 皮肤上有条 索 状出血点，主要见于腋下。 血常规出现 异常淋巴细胞。尿 常规有大量 蛋白尿 和红 细
