1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5335 2020 非洲猪瘟检测实验室生物安全 操作技术规范 Technical specifications of biosafety operations for laboratory testing African swine fever 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5335 2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 null2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民
2、共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国青岛海关、中华人民共和国上海 海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国长春海关、中华人民共 和国深圳海关、中华人民共和国广州海关、中华人民共和国长沙海关、中华人民共和国重庆海关。 本文件主要起草人：罗宝正、王群、陈轩、张强、乔彩霞、邵建宏、罗佳、孟日增、曹琛福、 佟铁铸、李健、刘艳华、朱忠武、李应国、王伟利、薄清如。 I 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5335 2020 非洲猪瘟检测实验室生物安全操作技术规范 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟检测实验室生物安全基本
3、要求，包括样品接收和管理、样品处理、样品 检测、废弃物和验余样品无害化处理、设施及环境消毒处理和初筛阳性样品传递。 本文件适用于非洲猪瘟检测实验室的相关活动。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 18648 非洲猪瘟诊断技术 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 SN/T 1559 非洲猪瘟检疫技术规范 病原微生物实
4、验室生物安全管理条例（国务院令第 424 号） 高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样本运输包装规范（农业部公告第 503 号） 世界动物卫生组织（OIE）陆生动物诊断试验与疫苗手册 （2019 版） 联合国粮食和农业组织（FAO）动物生产与卫生手册（2018 版） 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 实验室生物安全基本要求 4.1 非洲猪瘟病毒属于高致病性动物微生物，相关资料参见附录 A。根据国务院第 424 令第三十条规 定，从事高致病性病原微生物分离和动物体上相关实验活动的，应在生物安全三级以上实验室进行。 4.2 开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其设施设备配置
5、应符合 GB 19489 中生物安全二级 （BSL -2）及以上实验室的要求。样品灭活前的实验活动应在生物安全柜中操作，废弃物及检测完样品 应经高压蒸汽等消毒处理。 4.3 开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其管理、技术、过程控制和结果质量控制均应符 合 GB/T 27401 要求。 4.4 开展非洲猪瘟病毒核酸和抗体检测的实验室，其所从事的检测实验活动种类应达到相应级别的生物 安全实验室防护要求，并取得主管部门的批准。未取得授权或检测资质的实验室不应开展非洲猪瘟检测。 5 样品接收和管理 5.1 样品的包装和运输应符合农业部公告第 503 号的要求，使用密封三层包装，外包装加贴生物危
6、以正式出版文本为准 2 SN/T 5335 2020 险标识，由专人送达实验室。 5.2 用于非洲猪瘟检测的样品应 2 8 冷藏运输，尽快（24h 内）送达实验室。用于病毒核酸或 血清抗体检测的样品，应在 2 8 暂存（24 h 内），-20或 -70较长时间保存。需要分离血清 的非抗凝血，室温下放置 12 h24 h 后收集血清。用于 PCR 等病毒核酸检测的血液应使用 EDTA 抗凝。 组织样品按照农业部公告第 503 号要求采集和送检。样品送样量应达到初筛检测和确诊送样的需要， 符合 GB/T 18088 要求。 5.3 实验室接收样品时，接样人员应检查外包装有无损坏，确认样品在冷藏和密
7、封状态下运输到实验 室。如发现包装有破损，应在外层增加密封包装，并立即通知送样人员，评估病毒暴露风险并进行处置。 5.4 在确认样品外包装无破损后，在样品室内打开外包装，检查确认样品内包装无泄漏、无污染， 核对样品种类和数量无误，加贴样品标识。 5.5 非洲猪瘟检测样品应实行严格的管理制度，实验室应有专门的冰柜或冰箱用于非洲猪瘟检测样 品的保存，实行“双人双锁”严格管理。如需要调取检测样品时，应经过实验室负责人的同意，并由 样品管理员记录。 5.6 样品标识应包含但不限于以下信息：样品编号、名称、数量、检测项目。 5.7 用于非洲猪瘟检测的样品不得留样。检测任务完成后，应对检测结果为阴性的样品
8、进行高压蒸 汽消毒（121，30 min）或者其它无害化措施处理，并做好处理记录。初筛结果为阳性的样品需要 确诊的，按规定包装好送主管部门指定的确诊实验室。 6 样品处理 6.1 样品准备 检验人员负责对样品进行处理和检测。取出样品，待样品解冻后，密封状态下送入实验室生物安 全柜内进行样品制备。 6.2 样品制备要求 在生物安全柜内打开样品包装前，应使用有效消毒剂进行表面消毒，然后进行无菌取样处理。 6.3 样品制备 6.3.1 组织样品制备 应在生物安全柜中用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 0.1 g0.2 g 放入无菌研钵或离心管中，再加 入 1 mL2 mL PBS（0.01 mol/L，
9、pH 7.4，配制见附录 B）后，经充分研磨破碎后制成 10% 组织组织匀 浆液，装于 1.5 mL 灭菌离心管中，12 000 g 离心 5 min 后，取上清，60灭活 30 min。如在生物安全 柜外利用组织研磨仪处理样品，应将待研磨的样品管表面消毒之后再移出生物安全柜，待研磨结束之 后离心，在生物安全柜内取上清，60 作用 30 min 灭活之后用于后续的检测。 6.3.2 抗凝血 在生物安全柜内直接吸取抗凝血分装于 1.5 mL 灭菌离心管中备用。如血液粘稠无法吸取，可用 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）作 10 倍稀释后，吸取抗凝血分装于 1.5 mL 灭菌离心管中。6
10、0 灭活 30 min 后移出生物安全柜进行后续的检测。 6.3.3 非抗凝血 非抗凝血样品采集之后，室温下放置 12 h 24 h 待血清析出，在生物安全柜中收集血清，分装于 1.5 mL 灭菌离心管中。如果用于核酸检测，应 60灭活 30 min 后移出生物安全柜进行核酸提取；用于 以正式出版文本为准 3 SN/T 5335 2020 免疫学分析的血清，将离心管表面消毒之后方可移出生物安全柜，4 暂存（24 h 以内），放在 -20 或 -70较长时间保存。免疫学检测过程中可能接触到样品的设备设施应使用有效消毒剂做好消毒处理。 6.3.4 蜱 对蜱进行非洲猪瘟病毒核酸检测，应在生物安全柜中
11、用无菌镊子将蜱样品放入预冷的无菌研钵， 使用 1.5 mL 预冷的 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）研磨，将研磨的匀浆液转入 1.5 mL 灭菌离心管中，1000 g 离心处理5 min，取上清液60 灭活30 min之后移传出生物安全柜，进行病毒核酸检测或冷冻储存备用。 6.3.5 其它样品 用于非洲猪瘟病毒核酸检测的动物产品、食品、生物制品等其它样品，参照上述组织或液体样 品的处理方法，将待检样品在生物安全柜中灭活处理后进行后续检测活动。 6.4 验余样品暂存 取完样的验余样品用生物安全袋密封包装，做好标记，表面用有效消毒剂表面消毒后，保存 于 -20或 -70专用冰箱。 7
12、样品检测 7.1 样品溢洒处理方式 样品检测过程中发生小量液体样品溢洒时，应用吸水纸吸干，然后在表面喷洒有效消毒剂进行 处理。发生大量液体样品溢洒时，应当立即用毛巾或纸巾覆盖感染性物质及相关破碎物品，然后在 上面喷洒有效消毒剂，作用 30 min。对吸水毛巾或纸巾以及破碎物品进行清理（玻璃碎片应用镊子清 理），然后再用有效消毒剂喷洒或擦拭污染区域。清理完毕后清洁用具及垃圾应进行高压灭菌。检验 人员整个操作过程应戴手套。 7.2 样品接触皮肤处理方式 当操作样品时溅到或沾到手、脸等皮肤，应立即用 75酒精或等效的消毒液充分清洗皮肤，或 者用棉球浸湿上述消毒液充分擦拭皮肤，直到清洁干净，然后用清水
13、充分清洗皮肤。如果样品中液体 溅到眼里，则应立即用洗眼器冲洗干净，冲洗眼后的用水应灭菌处理。 7.3 检测方法选择 灭活的样品提取核酸后，实验室可采用标准中推荐的 PCR 或荧光 PCR 等方法开展非洲猪瘟病毒 核酸检测。分离的血清样品如果用于免疫学检测，应注意生物安全。具体操作方法见 OIE陆生动物 诊断试验和疫苗手册（2019 版）3.8.1 节、GB/T 18648 或 SN/T 1559。 8 废弃物及验余样品无害化处理 8.1 非洲猪瘟检测结果为阴性时，验余样品应及时进行高压蒸汽消毒（121，30 min）处理，交给 指定的生物安全垃圾处理公司进行无害化处理，并做好记录。 8.2 非
14、洲猪瘟初步检测结果为阳性时，应及时报告送样部门和业务主管部门，并将验余样品进行明 显标识，待上级业务主管部门确定进一步处理方案后，对样品进行相应处理。同时应用有效消毒剂对 实验室内可能接触到的设备设施和环境进行全面消毒处理。 8.3 非洲猪瘟检测实验活动中产生的垃圾、废弃物和验余样品等，直接进行高压蒸汽消毒（121， 30 min）。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5335 2020 8.4 非洲猪瘟检测实验活动中使用过的防护服、工作鞋等，如果需要重复使用，应在每次使用结束 之后进行紫外消毒处理 40 min。如果检测到阳性样品，应将使用的防护服、工作鞋等进行高压蒸汽 消毒（121，30
15、min）。 9 设施和环境消毒处理 9.1 有效消毒剂 有效的消毒剂包括苯及苯酚、次氯酸盐、强碱类及戊二醛等。宜使用 FAO动物生产与卫生手 册（2018 版）中“非洲猪瘟发现与诊断”一节推荐的有效消毒剂，0.8% 氢氧化钠、含 2.3% 有效 氯的次氯酸盐、0.3%福尔马林、3%邻苯基苯酚和3%碘化合物，处理 30 min。其中碱类（氢氧化钠、 氢氧化钾等）、氯化物和酚化合物适用于建筑物、木质结构、水泥表面、设施设备消毒，酒精和碘 化物适用于人员消毒。 9.2 生物安全柜内消毒 进行非洲猪瘟检测活动时应在生物安全柜中操作区铺隔水垫，实验后卷起隔水垫置于污物桶后 消毒灭菌，采用有效消毒剂将生物
16、安全柜内操作区消毒处理一遍，再以清水浸泡纱布或吸水纸清洗 12 遍。 9.3 剪刀、镊子等可重复使用物品消毒 剪刀、镊子等可高压灭菌的物品直接置于锐器盒高压灭菌处理。不能高压灭菌的物品考虑消毒剂 浸泡，可用塑料盒盛装有效消毒剂进行浸泡处理 30 min。不能消毒剂浸泡但可高压处理的，可放进生 物安全灭菌袋后直接高压蒸汽消毒（121，30 min）。 9.4 仪器、工作台面、地面、环境消毒 实验结束后，仪器、工作台面、地面、环境均应喷洒消毒，对金属仪器等消毒时应防止对仪器 的腐蚀。实验过程中如出现样品溢洒或容器破碎等情况，按照 7.1 方案进行处置。 9.5 消毒完毕后清理 操作区域及环境消毒完
17、毕之后，如水份蒸发导致台面、内壁等出现白色结晶现象，应采用蒸馏 水喷洒擦拭清理干净。 10 初筛阳性样品传递 初筛阳性样品需要外送确诊的，样品的包装和运输应符合 OIE 和农业部公告第 503 号的规定。 样品应进行三层密封包装后，放于盛有冰袋的生物安全运输箱中低温冷链传递。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5335 2020 附 录 A （资料性） 非洲猪瘟相关资料 A.1 非洲猪瘟概述 非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染 家猪和各种野猪（非洲野猪、欧洲野猪等）引起一种急性、出血性、
18、烈性传染病。世界动物卫生组织 （OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短， 最急性和急性感染死亡率可以达到 100%，临床表现为发热（达 40 42 ），心跳加快，呼吸困难， 部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲 猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。2018 年 8 月 3 日，我国确诊首例非洲猪 瘟疫情。非洲猪瘟病毒不感染人。 A.2 非洲猪瘟病毒的抵抗力 在适宜的、蛋白质丰富的环境中，非洲猪瘟病毒在较宽的温度和 pH 值范围内可以保持稳定，并 且对自溶和各种消毒剂具有抵抗性。
19、因此，腐败、熟化以及肉类的冷冻不会使其失去活性。因此，非 洲猪瘟病毒在排泄物、尸体、新鲜肉类和某些肉类产品中可存活不同时间。在粪便中至少可能会感 染持续 11 天，冷藏肉类可能持续感染 15 周 ( 在冻肉中可能时间更长 )，除非已经在高温下煮熟或熏 制，否则在骨髓或腌制火腿和香肠中会持续数月。这对非洲猪瘟的传播具有非常重要的意义。如果用 未煮熟的、未充分熏制的、干肉、腌猪肉、血液、尸体和胴体喂猪或丢弃在猪或野猪可能采食的公共 垃圾堆放处，会造成感染。在 70 下煮 30 min 会使病毒灭活。某些吸血昆虫，如厩螫蝇，已被证明 能够在吸取病猪血液后至少 24 h 内保留并传播非洲猪瘟病毒，这与
20、猪群内传播息息相关。在湖泊和 河流等大型水域中，由于病毒迅速被稀释，无法达到感染所需要的浓度水平，因此不大可能因此发生 感染。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5335 2020 附 录 B （规范性） 试剂配制 B.1 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4） 氯化钠（NaCl） 85.00 g 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ） 15.49 g 磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ） 2.03 g 加去离子水至 1000 mL 或者 氯化钠（NaCl） 80.00 g 氯化钾（KCl） 2.00 g 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 12H 2 O） 30.00 g 磷酸二
21、氢钾（KH 2 PO 4 ） 2.00 g 加去离子水至 1000 mL 调 pH 值至 7.4，4冰箱保存，使用前恢复至室温摇匀后使用。 B.2 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4） 0.1 mol/L PBS 100 mL 去离子水 900 mL 调 pH 值至 7.4，103 kPa 高压蒸汽灭菌 30 min，室温或 4冰箱保存。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 8801230 1/16 印张 0.00 字数 00 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1000 书号：000000 定价 00.00 元 非洲猪瘟检测实验室生物安全 操作技术规范 行 业 标 准 SN/T 53352020 * * * 网址 SN/T 5335 2020
