1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5282 2020 虾偷死野田村病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with covert mortality nodavirus 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5282 2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关
2、，中国水产科学研究院黄海水产研究所。 本文件主要起草人：于力、张庆利、史秀杰、刘爽、王津津、郑晓聪、刘荭、黄倢。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5282 2020 虾偷死野田村病毒病检疫技术规范 1 范围 本文件规定了虾偷死野田村病毒病临床症状、组织病理、套式聚合酶链反应、实时荧光逆转录 聚合酶链反应和原位杂交的检测方法。 本文件适用于虾偷死野田村病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修
3、改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 3.1 CMNV ：偷死野田村病毒（covert mortality nodavirus） 3.2 RT-PCR ：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction） 3.3 Nested PCR ：套式聚合酶链反应（nested polymerase chain reaction） 3.4
4、 Ct ：达到阈值的循环数（cycle threshold） 3.5 cDNA ：互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid） 3.6 DEPC ：焦碳酸乙二酯（diethypyrocarbonate） 3.7 PBS ：磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline） 3.8 PBST ：磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffer saline with tween） 3.9 RNase ：RNA 酶（ribonuclease） 3.10 dNTPs ：三磷酸脱氧核苷酸（deoxynucleotide triphosphat
5、es） 3.11 EB ：溴化乙锭（ethidium bromide） 3.12 MAB ：马来酸缓冲液（maleic acid buffer） 3.13 BCIP ：5 - 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基磷酸盐（5 -Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate） 3.14 NBT ：氯化硝基四氮唑蓝（nitroblue tetrazolium chloride） 3.15 DTT ：二硫苏糖醇（DL -Dithiothreitol） 3.16 EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid） 4 疾病概述 虾偷死野田村病毒病也
6、叫虾病毒性偷死病，其病原为偷死野田村病毒（ CMNV），属于野田村病 以正式出版文本为准 2 SN/T 5282 2020 毒科（ Nodaviridae）甲型野田村病毒属（ Alphanodavirus），详细资料参见附录 A。 5 试剂和材料 5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格，用 DEPC 处理以除掉 RNase。PCR 实验应在符合 SN/T 1193 要求的实验室进行。 5.2 CMNV 病毒参考株。 5.3 Davidsons AFA 固定液：见附录 B.1。 5.4 1% 盐酸乙醇：浓盐酸和 70% 乙醇配制。 5.5 梯度乙醇：70%、80%、95% 及无水乙
7、醇。 5.6 二甲苯。 5.7 石蜡。 5.8 苏木精染液。 5.9 0.5% 伊红乙醇溶液。 5.10 中性树脂。 5.11 逆转录酶：20 U/ L， -20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.12 RNase 抑制剂：20 U/ L， -20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.13 Trizol 试剂：RNA 抽提试剂。 5.14 Taq 酶： -20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.15 dNTPs ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。 5.16 实时荧光 RT -PCR 的引物和探针的序列如下： CMNV-Taq-F ：5 -CGA-G
8、CT-AAT-CCA-AGC-ACT-TC-3 CMNV-Taq-R ：5 -ACC-TGT-TAG-GTA-CGC-TAC-CA-3 探针：5 -FAM-CGC-TCA-CGG-CTT-TGG-ATA-CCT-T-BHQ1-3 扩增 RNA 聚合酶基因片段中 198 bp 的片段。引物和探针终浓度为 200 nmoL/L。 5.17 Nested PCR 引物序列 5.17.1 第一步引物序列如下： CMNV-7F1 ：5 -AAA-TAC-GGC-GAT-GAC-G-3 CMNV-7R1 ：5 -ACG-AAG-TGC-CCA-CAG-AC-3 扩增 RNA 聚合酶基因片段中 619 bp
9、 的片段。引物终浓度为 400 nmoL/L。 5.17.2 第二步引物序列如下： CMNV-7F2 ：5 -CAC-AAC-CGA-GTC-AAA-CC-3 CMNV-7R2 ：5 -GCG-TAA-ACA-GCG-AAG-G-3 扩增第一步产物中 165 bp 的片段。引物终浓度为 400 nmoL/L。 5.18 75% 乙醇：用无水乙醇和 DEPC 水配制，使用前预冷到 -20。 5.19 氯仿。 5.20 异丙醇。 5.21 DNA 相对分子质量标准：分子量大小 100 bp2000 bp 间的 DNA 片段， -20保存。 5.22 4% 多聚甲醛：多聚甲醛和 PBS 配制。 5.
10、23 地高辛标记 RNA 探针，序列参见附录 C。 5.24 碱性磷酸酶偶联抗地高辛抗体： -20保存。 5.25 PBST ：含 0.1% 吐温 -20 的 PBS。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5282 2020 6 器材和设备 6.1 切片机。 6.2 显微镜。 6.3 组织研磨器。 6.4 高速冷冻离心机。 6.5 实时荧光 PCR 扩增仪。 6.6 PCR 扩增仪。 6.7 水平电泳仪。 6.8 微量移液器。 6.9 凝胶成像仪。 7 临床症状 病虾多沉入水底，很少在水面活动，软壳，生长缓慢，很多情况下可见腹节肌肉发白。解剖可见 肝胰腺萎缩，空肠空胃。 8 检测方法 8.1 组
11、织病理 8.1.1 取样和固定 取肝胰腺和肌肉组织，用 Davidsons AFA 固定液固定 24 h。 8.1.2 脱水、包埋和切片 将固定好的组织用 70% 乙醇处理 1 h，80% 乙醇处理 1 h，95% 乙醇处理 1 h，无水乙醇处理 30 min（重复 2 次），二甲苯 + 无水乙醇（体积比 11）处理 30 min，二甲苯处理 30 min（重复 2 次）， 二甲苯 + 石蜡（体积比 11）处理 15 min，石蜡处理 15 min（重复 2 次），石蜡包埋，切片，切片厚 度约 3 m。切好的片子用于染色或者原位杂交。各步骤的时间可根据样品情况作适当调整。 8.1.3 染色 将
12、切片用二甲苯处理 5 min（重复 2 次），二甲苯 + 无水乙醇（体积比 11）处理 5 min，无水乙 醇处理 5 min，95% 乙醇处理 5 min，80% 乙醇处理 5 min，70% 乙醇处理 5 min，双蒸水洗涤，苏木 精染色，双蒸水洗涤，1% 盐酸乙醇处理，双蒸水洗涤，0.5% 伊红染色，双蒸水洗涤，70% 乙醇处理 5 min，80% 乙醇处理 5 min，95% 乙醇处理 5 min，无水乙醇处理 5 min（重复 2 次），二甲苯 + 无水 乙醇（体积比 11）处理 5 min，二甲苯处理 5 min（重复 2 次），最后用中性树脂封固，显微镜下观察。 各步骤的时间可根
13、据样品情况作适当调整。 8.1.4 结果判定 8.1.4.1 典型组织病理病变为：肝胰腺组织的肝胰腺小管上皮细胞中可见嗜酸性包涵体；肌肉组织 可见凝固状坏死，坏死肌纤维中有血细胞浸润，浸润血细胞的细胞核出现核固缩（参见附录 D）； 8.1.4.2 组织病理方法只用作初步判定。若检测样品中观察到典型病变，判定为可疑病例，需要用 本标准其他方法确诊。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5282 2020 8.2 Nested PCR 8.2.1 样品采集 按 GB/T 18088 的标准采样，优先选取具有临床症状的个体。取肝胰腺、鳃和附肢。 8.2.2 RNA 抽提 用组织研磨器制备组织匀浆，取匀
14、浆成糊状的组织样品 25 mg 100 mg 加入到 1.5 mL 离心管。 加入 1 mL Trizol，用枪头充分吹打均匀；加入 200 L 三氯甲烷，涡旋振荡 30 s ；4 12000 r/min 离心 15 min；取上层水相到新的1.5 mL离心管，加入500 L异丙醇，上下颠倒数次混匀，静置10 min；4 12000 r/min 离心 15 min ；弃上清，沉淀物用 1 mL DEPC 水配制的 75% 乙醇洗涤；4 8000 r/min 离 心 10 min ；弃上清，沉淀室温干燥 10 min ；加入 30 L DEPC 水溶解 RNA 沉淀。提取后的 RNA 应尽 快用
15、于逆转录合成 cDNA 模板。 具备同样抽提效率的商业化 RNA 抽提试剂盒也同样适用。 8.2.3 Nested PCR 第一步 8.2.3.1 反应体系和参数 在冰上配制体系，取 18.5 L（总量约 150 ng 200 ng）待测 RNA 溶液，加 10 倍逆转录酶浓缩缓 冲液（见附录 B.2）2.5 L、dNTP 1 L、RNase 抑制剂 1 L、逆转录酶 1 L、下游引物（CMNV -7R1） 1 L。混匀后，置 PCR 仪上 50反应 30 min，95反应 10 min， -20保存 cDNA 模板。 在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq
16、酶浓缩缓冲液（见附录 B.3）2.5 L、 dNTPs 0.5 L、 Taq 酶 0.5 L、上游引物（CMNV -7F1）和下游引物（CMNV -7R1）各 0.5 L、双蒸水 18 L、cDNA 模板 2.5 L，配制反应体系。同时设置不含 cDNA 模板的空白对照、阳性对照和阴性对 照，检测体系配制方法相同。95 4 min ；95 30 s，45 30 s，72 40 s，35 个循环；72 7 min， 4保存。 具有同样扩增效率的商业化 RT -PCR 试剂盒也同样适用。 8.2.3.2 电泳和产物测序 用 TBE 电泳缓冲液（见附录 B.4）配制 1.5% 的琼脂糖平板（含 1
17、g/mL EB）。将平板放入水平电 泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将 6 L 扩增产物和 2 L 溴酚蓝指示剂溶液（见附录 B.5）混匀 后加入孔内。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当溴酚兰到达琼脂 糖凝胶的底部时停止。 用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。若阳性对照出现一条 619 bp 的目标条带， 阴性对照和空白对照没有该条带，实验有效；若样品出现目标条带，进行测序确认；若样品无条带， 需进行 Nested PCR 第二步。 8.2.4 Nested PCR 第二步 8.2.4.1 反应体系和参数 在 0.2 mL PCR 薄壁管或
18、八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液 2.5 L、dNTPs 0.5 L、 Taq 酶 0.5 L、上游引物（CMNV -7F2）和下游引物（CMNV -7R2）各 0.5 L、双蒸水 18 L，Nested PCR 第一步扩增产物 2.5 L，配制反应体系。同时设置不含模板的空白对照、阳性对照和阴性对照， 检测体系配制方法相同。95 4 min ；95 20 s，50 20 s，72 20 s，30 个循环；72 7 min，4 保存。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5282 2020 具有同样扩增效率的商业化 PCR 试剂盒也同样适用。 8.2.4.2 电泳和产物测序
19、方法见 8.2.3.2，目标条带大小为 165 bp。 8.2.5 结果判定 8.2.5.1 若 Nested PCR 第一步或第二步出现目标条带，测序结果与参考序列（参见附录 E）同源性 大于或等于 95%，判定为阳性； 8.2.5.2 若未出现相应大小的目标条带，或序列同源性小于 95%，判定为阴性。 8.3 实时荧光 RT -PCR 8.3.1 样品采集和 RNA 抽提 方法见 8.2.1 和 8.2.2。 8.3.2 反应体系和参数 逆转录方法见 8.2.3.1，使用下游引物（CMNV -Taq-R ）。 在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩
20、缓冲液 2.5 L、dNTPs 0.5 L、 Taq 酶 0.5 L、上游引物（CMNV -Taq-F）和下游引物（CMNV -Taq-R）各 0.5 L、探针 0.5 L、双蒸 水 17.5 L、cDNA 模板 2.5 L，配制反应体系。同时设置不含 cDNA 模板的空白对照、阳性对照和阴 性对照，检测体系配制方法相同。95 5 min ；95 15 s，53 35 s（收集荧光信号），40 个循环。 具有同样扩增效率的商业化一步法荧光 RT -PCR 试剂盒也同样适用。 8.3.3 结果判定 8.3.3.1 若阳性对照出现典型扩增曲线且 Ct 值小于或等于 35，阴性对照和空白对照无扩增曲
21、线，实 验有效； 8.3.3.2 若检测样品出现典型扩增曲线且Ct值小于或等于35，判定为阳性；若检测样品无扩增曲线， 判定为阴性； 8.3.3.3 若检测样品的 Ct 值大于 35 而小于 40 时，应增加模板浓度重新进行检测。重新检测 Ct 值大 于 35，判定为阴性；出现典型扩增曲线且 Ct 值小于或等于 35，判定为阳性。 8.4 原位杂交 8.4.1 操作步骤 8.4.1.1 制作组织切片方法见 8.1.1 和 8.1.2，按 8.1.3 用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡水化处理。 8.4.1.2 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 洗涤 3 次。0.2 mol/L HCl 处理 1
22、0 min，PBST 洗涤 3 次。10 g/mL 蛋白酶 K 消化 10 min，PBST 洗涤 3 次。 8.4.1.3 加入杂交液（见附录 B.8），70预杂交 25 h。加入含适量地高辛标记 RNA 探针的杂交液， 70过夜。 8.4.1.4 在 70，洗涤液（见附录 B.9）洗涤 2 次，2SSC 洗涤 2 次，0.2SSC 洗涤 2 次。室温用 MAB（见附录 B.10）洗涤 1 次。用封闭液（见附录 B.11）封闭 4 h，加入适当浓度的碱性磷酸酶偶联 抗地高辛抗体，4过夜。 8.4.1.5 PBST 洗涤 6 次，加入 BCIP/NBT 底物溶液放置黑暗处显色，注意观察样品的颜
23、色变化。待 样品的显色达到理想着色后，PBST 洗涤 5 次终止反应，显微镜下观察。同时设置阳性对照和阴性对 照。各步骤的时间可根据样品情况作适当调整。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5282 2020 8.4.2 结果判定 8.4.2.1 若阳性对照观察到深蓝色杂交信号，而阴性对照未观察到深蓝色沉淀物，实验有效； 8.4.2.2 若检测样品中观察到深蓝色杂交信号，判定为阳性； 8.4.2.3 若检测样品中没有观察到深蓝色杂交信号，判定为阴性。 9 综合判定 9.1 出现下列的一种情况，判定为可疑病例： a) 出现典型临床症状或组织病理变化； b) Nested PCR 结果阳性； c)
24、实时荧光 RT -PCR 结果阳性； d) 原位杂交结果阳性。 9.2 对于出现典型临床症状或组织病理变化的，采用 Nested PCR、实时荧光 RT -PCR 或原位杂交进 行检测。如果使用其中一种方法出现阳性，判定为患虾偷死野田村病毒病。 9.3 对于无典型临床症状或组织病理变化的，如果采用 Nested PCR、实时荧光 RT -PCR 或原位杂交 任何两种以上不同方法检测结果为阳性，判定为偷死野田村病毒阳性。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5282 2020 附 录 A （资料性） 虾偷死野田村病毒病 虾偷死野田村病毒病主要危害南美白对虾（ Penaeus vannamei）、中
25、国明对虾（ Fenneropenaeus chinensis）、日本囊对虾（ Penaeus japonicus）和斑节对虾（ Penaeus monodon）等，在国内最早发生于 2002 2003 年海南、广西等地，后陆续传播到我国沿海主要对虾养殖地区。后来，泰国、马来西亚、 印度、越南、墨西哥和厄瓜多尔等地均有发病或阳性检出的报道。该病多发生于对虾养殖 3060 天 后，病虾常沉于池底，陆续发病死亡，累积死亡率可达 80%，对于对虾养殖业影响很大。该病的病 原 CMNV 主要感染甲壳类动物，该病毒基因组为单股正链 RNA，病毒粒子呈球状，无囊膜，直径约 为 19 nm32 nm。 以正式
26、出版文本为准 8 SN/T 5282 2020 附 录 B （规范性） 试剂配制 B.1 Davidsons AFA 固定液 甲醛（37%） 220 mL 乙醇（95%） 330 mL 冰醋酸 115 mL 加双蒸水定容至 1000 mL B.2 10 倍逆转录酶浓缩缓冲液 Tris-HCl（1 mol/L）5 mL KCl 558.8 mg MgCl 2 （1 mol/L）300 L DTT（2 mol/L）1 mL 加DEPC水定容至10 mL 调pH到8.3 B.3 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液 Tris-HCl（1 mol/L）2 mL KCl 372.5 mg TritonX-10
27、0 0.1 mL MgCl 2 （1 mol/L）150 L 加双蒸水定容至 10 mL 调pH到8.3 B.4 TBE 电泳缓冲液（5 倍浓缩液） Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g EDTA（0.5 mol/L）20 mL 加双蒸水定容至 1000 mL 调pH到8.0 以正式出版文本为准 9 SN/T 5282 2020 B.5 溴酚蓝指示剂溶液（6 倍上样缓冲液） 溴酚蓝 120 mg 蔗糖 20 g 加双蒸水定容至 50 mL B.6 20SSC NaCl 175.3 g 二水柠檬酸三钠 88.2 g 加DEPC水定容至1000 mL 调pH到7.0 B.7 20 丹哈特氏液
28、 牛血清白蛋白 0.4 g 聚蔗糖400 0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮360 0.4 g 加DEPC水定容至100 mL 0.45 m滤器过滤 B.8 杂交液 甲酰胺 50 mL 20nullSSC 25 mL 20丹哈特氏液5 mL 肝素 10 mg EDTA（0.5 mol/L）1 mL tRNA 25 mg 吐温-20 0.1 mL 加DEPC水定容至100 mL B.9 洗涤液 甲酰胺 25 mL 20nullSSC 12.5 mL 20丹哈特氏液2.5 mL EDTA（0.5 mol/L）0.5 mL 吐温-20 50 L 加DEPC水定容至100 mL 以正式出版文本为准 10 SN
29、/T 5282 2020 B.10 MAB 马来酸 1.2 g NaCl 870 mg 加DEPC水定容至100 mL 调pH到7.5 B.11 封闭液 山羊血清 10 mL Blocking reagent 2 mL 加MAB定容至100 mL 以正式出版文本为准 11 SN/T 5282 2020 附 录 C （资料性） 地高辛标记 RNA 探针序列 AAAGGGACGGAAGGGUUCCGGGCGGUGAGAUGGAUUUUGCGUAAACAGCGAAGGGGAUCCGUA AUGGAAGUGUUUGUGUUAAAAGGAUCCACGAAUACGCGAGCAAGAAAUGAUAUUCCU
30、AUUUCUGGAU UAAAUUUCUCAUAUUUAGUCGAUAGGCCUAGUGCGUUCGCUACUUUGUUGAUGAAAGGUUUGACUCG GUUGUGGCUCAAGCCGUCAUCGCCGUAUU 以正式出版文本为准 12 SN/T 5282 2020 附 录 D （资料性） 组织病理参考图片 注： 黑实心箭头表示正常骨骼肌组织，黑框箭头表示坏死的肌肉组织。比例尺为 20 m。 图 D.1 对虾的腹部肌肉坏死苏木精 - 伊红染色结果 注：黑箭头表示嗜酸包涵体的初级阶段，白箭头表示嗜酸包涵体。比例尺为50 m。 图 D.2 对虾的肝胰腺管上皮细胞苏木精 - 伊红染色结果 以正
31、式出版文本为准 13 SN/T 5282 2020 附 录 E （资料性） 扩增产物参考序列（KM112247） E.1 Nested PCR 扩增产物的参考序列 AAATACGGCGATGACGGCTTGAGCCACAACCGAGTCAAACCTTTCATCAACAAAGTAGCGAACGCA CTAGGCCTATCGACTAAATATGAGAAATTTAATCCAGAAATAGGAATATCATTTCTTGCTCGCGTATTCGT GGATCCTTTTAACACAAACACTTCCATTACGGATCCCCTTCGCTGTTTACGCAAAATCCATCTCACCGCCC GGAACCC
32、TTCCGTCCCTTTAGCAGACGCATGTTGCGATCGAGTTGAAGGCTATCTCGTGACAGATGCCCTT ACACCATTGGTGGGTGATTACTGTCGCTCTATGATTCGATTGTATGGTGGAGCTGCGTCAAGTCAATTGGT AAGACTGAAGCGCAAAACCAGCAATTCCGAGAAGCCCAATTGGTTGACGAATGATGGTTCCTGGCCCCA AAATGCCGCCGATAAAGATGCTATGTTCAACGTCCTTTGTGCCCGCACTCAAATTCATCCCGAGACGGTA AATAGCCTTATCGAACGCCTGG
33、CCAACATAACTACACCTTTTGACCCTATAATTACTGAGTTTAATGATGC CGCAAGTAACAGTAATACCATCGGCGTTGATGGTCCAGTAGGGTCTGTGGGCACTTCGT E.2 实时荧光 RT-PCR 扩增产物的参考序列 CGAGCTAATCCAAGCACTTCCCGACAAGGTATCCAAAGCCGTGAGCGCGGTTCGCAACCTAACCGT CGACGACGCCCCGGAGGCCGTCCAAAAGGACCTCCGCAATCTGATTGCATGCGTCAACCTCAGCGTGACC AAGGTCTCCAAGGCCGTGACATCGCT
34、GATGGACAAGCCGACAGTGGTAGCGTACCTAACAGGT 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1.25 字数 24 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：1551752 定价 16.00 元 虾偷死野田村病毒病检疫技术规范 行 业 标 准 SN/T 52822020 * * * SN/T 5282 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
