1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5283 2020 熊蜂微孢子虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Nosema bombi 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5283 2020 I 前 言 本文件是根据 GB/T 1.12020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国海口海关、福建农林大学、厦门 瑞德利校准检测技术
2、有限公司、东莞市中鼎检测技术有限公司。 本文件主要起草人：张体银、郑腾、吴山楠、王武军、黄少康、张志灯、于师宇、白泉阳、 邓其馨、陈美传、曹维强。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5283 2020 熊蜂微孢子虫检疫技术规范 1 范围 本文件规定了熊蜂微孢子虫的光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式 反应检测技术。 本文件适用于熊蜂微孢子虫的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。
3、GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 PCR 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） Ct 循环阈值（Cycle threshold） ddH 2 O 双蒸水（Double -Distillation H 2 O） DNA 脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（Ethidium bromide） TBE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸
4、（Trihydroxymethyl aminomethane -boric acid-ethylene diamine tetraacetic acid ） TE TE 缓冲液（Tris -EDTA buffer solution） 4 仪器和设备 4.1 捣碎机 4.2 光学相差显微镜 4.3 高压灭菌锅 4.4 PCR 仪 4.5 荧光 PCR 仪 4.6 高速冷冻离心机 4.7 微量移液器（0.5 L10 L, 2 L20 L, 20 L200 L, 100 L1000 L） 4.8 超净工作台 4.9 水平电泳仪 4.10 凝胶成像系统 以正式出版文本为准 2 SN/T 5283 20
5、20 4.11 电子天平（感量 0.01 g） 4.12 冰箱（2 8 和 -20 ）。 5 试剂 5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2 酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 A.1。 5.3 三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 A.2。 5.4 TE 缓冲液。 5.5 10PCR 缓冲液。 5.6 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。 5.7 Taq DNA 聚合酶。 5.8 0.5TBE 缓冲液（配制方法见附录 A.3）。 5.9 上样缓冲液（配制方法见附录 A.4）。 5.10 EB（10 mg/mL），配制方法见附录
6、 A.5。 5.11 DNA 相对分子质量标准物 Marker。 5.12 DNA 纯化回收试剂盒。 5.13 普通 PCR 引物 上游引物 Nos -F1 ： 5 -CCA GCA GTA AAC TAT GCC-3 ； 下游引物 Nos -R1 ： 5 -CTC GAA TCA GGA TTC TCT CAG-3； 5.14 荧光 PCR 引物和探针 上游引物 Nos -F2 ：5 -GTC TCT CAG GCT CCT TCT CC-3 ； 下游引物 Nos -R2 ：5 -ATG TGC ACC GCA GAT AAC TA-3 ； 探针 qPCR -P ：FAM -ACC GTT
7、ACC CGT CAC TGC CTT GT-BHQ1 ； 6 采样 6.1 采样比例 6.1.1 当蜂群数量 10 群时，所有蜂群均采样。 6.1.2 当数量在 11 群 100 群时，以 10 群采样量为基础，每增加 10 群，采样量增加 1 群。 6.1.3 当蜂群数量为 101 群 200 群时，按总群数的 15采样。 6.1.4 当蜂群数量 200 群时，以 200 群采样量为基础，每增加 20 群，采样量增加 1 群。 6.2 采样方法 从每个选定蜂群中采取活力较弱的熊蜂 30 只，放入烧杯内盖好，记录群号。检验前先将活蜂用 乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻 10 min。 7 实验
8、室检测 7.1 形态学检测方法 7.1.1 样品处理 对处死后的蜂样品或死后新鲜的蜂样品，取其中肠，按照 110 加入生理盐水，用捣碎机充 分捣碎（对干燥的死蜂样品，先剪去其头胸部，取其腹部，浸泡 12 小时后再捣碎）。匀浆液用纱 以正式出版文本为准 3 SN/T 5283 2020 网（50 目 100 目）过滤，收集滤液。滤液差速离心（500 r/min，离心 1 min，弃沉淀，然后上清液 以 5 000 r/min ，离心 10 min，弃上清液）2 次 3 次。用样本 1 倍 10 倍体积的生理盐水悬浮，做为 微孢子虫待检液。 7.1.2 镜检 从 7.1.1 制备的待检液中取出 2
9、 个待检液样本 50 L，滴于载玻片，盖上盖玻片，用 4015（或 10）倍光学相差显微镜 2 人对检，先看中间，边调节微调旋钮，边慢慢移向四周，保证每个标本不少 于 20 个视野。 7.1.3 结果判定 光学相差显微镜下看到长约 5 m7 m，宽约 3 m4 m，外部形态短而宽，带有蓝色折光，边 缘发暗的椭圆形粒子就是微孢子虫，判为阳性（参见附录 B）。 7.2 PCR 检测方法 7.2.1 引物 根据熊蜂微孢子虫 16S rRNA 基因核酸序列设计，扩增长度约为 213 bp，用 ddH 2 O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。 7.2.2 设立对照 每次反应应设置空白
10、对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 ddH 2 O 代替样品；阴性对照为 未感染熊蜂微孢子虫的健康熊蜂腹部组织；阳性对照为感染熊蜂微孢子虫的熊蜂腹部组织。 7.2.3 DNA 的提取 7.2.3.1 分别取 7.1.1 待检液 0.5 mL 转移至 1.5 mL 离心管中，分别加入 0.2 mol/L KOH 0.5 mL，充分 混合，27 诱导 1 h 后 5 000 r/min 离心 5 min，弃上清液。 7.2.3.2 用 0.5mL 生理盐水重悬，25 放置 30 min。每管加入 0.5 mL 饱和酚，颠倒充分混匀 5 min， 4 12 000 r/min 离心 10 min
11、。 7.2.3.3 取水相至另一干净离心管，加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇（三者体积比为 25241），上下颠倒混匀 5 min，4 12 000 r/min 离心 10 min。 7.2.3.4 取水相至另一干净离心管，加入等体积的三氯甲烷 / 异戊醇（三者体积比为 241），上下 颠倒混匀 5 min，4 12 000 r/min 离心 10 min。 7.2.3.5 取水相至另一干净离心管，加入 2 倍体积预冷的异丙醇沉淀 DNA，轻轻混匀，4 12 000 r/min 离心 15 min，彻底去除上清。 7.2.3.6 用600 L 70%预冷的乙醇洗涤沉淀，4 下12 000 r/
12、min 离心10 min，弃上清，再瞬时离心， 用移液器彻底吸除酒精，在超净工作台上自然晾干。 7.2.3.7 加入 20 L TE 溶液溶解 DNA， -20 下保存。 7.2.3.8 空白对照、阴性对照和阳性对照从 7.1.1 开始进行同步操作。 7.2.3.9 DNA 提取也可选用等效的商品化试剂盒。 7.2.4 PCR 扩增 7.2.4.1 反应体系 普通 PCR 反应体系见表 1。PCR 扩增也可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5283 2020 表 1 普通 PCR 反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量 10PCR 缓冲液 10 1
13、 2.5 L dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 L Taq DNA 聚合酶 5 U/L 0.1 U/L 0.5 L 上游引物 Nos -F1 10 mol/L 0.4 mol/L 1.0 L 下游引物 Nos -R1 10 mol/L 0.4 mol/L 1.0 L 模板 DNA 2.0 L ddH 2 O 17.5 L 总体积 25 L F 反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。 7.2.4.2 反应程序 94 预变性 5 min ；之后 94 变性 45 s，57 退火 30 s，72 延伸 45 s，共 35 个循环；72 补充延伸 10 mi
14、n，4 保温。同时设阳性、阴性对照和空白对照。 7.2.5 琼脂糖凝胶电泳 用 TBE 电泳缓冲液配制 2.0% 的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶 面。将 6 L 样品和 2 L 上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA 相对分子质量标 准物 Marker 作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当指示剂到达底部时停止。 7.2.6 凝胶成像分析和测序 将电泳完毕的凝胶放入含 0.5 g/mL EB 溶液中染色 10 min30 min 后（或等效商品化核酸染料配 置琼脂糖凝胶时直接溶解在凝胶中），在水中漂洗凝胶，用凝胶成像仪观察并判断结果，经 PCR
15、 扩增 电泳后如出现一条大小约213 bp的DNA片段，应对其切胶利用DNA纯化回收试剂盒回收后进行测序， 也可直接送 PCR 产物进行测序。 7.2.7 结果判定 经 PCR 扩增并电泳后阳性对照出现一条大小约 213 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照无 条带时，试验成立。待检样品经 PCR 扩增并电泳后，出现大小约 213 bp 的 DNA 条带并经测序验证， 测序结果同参考序列（参见附录 C.1）同源性要达到 98% 以上方可判为阳性；无条带或条带的大小 不是约 213 bp 或条带的大小约 213 bp，但测序结果同参考序列同源性低于 98% 的判为熊蜂微孢子虫 阴性。 7
16、.3 实时荧光 PCR 检测方法 7.3.1 引物和探针 根据熊蜂微孢子虫 16S rRNA 基因核酸序列设计，扩增长度约为 151 bp，参见附录 C.2。用 ddH 2 O 溶解至 10 mol/L 后，保存于 -20 备用。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5283 2020 7.3.2 设立对照 同 7.2.2。 7.3.3 DNA 提取 同 7.2.3。 7.3.4 实时荧光 PCR 扩增 7.3.4.1 反应体系 实时荧光PCR反应体系见表2。实时荧光PCR扩增也可以采用等效的商品化荧光定量PCR试剂盒。 表2 实时荧光 PCR 反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量 10P
17、CR 缓冲液 10 1 2.5 L dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 L Taq DNA 聚合酶 5 U/L 0.1 U/L 0.5 L 上游引物 Nos -F2 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 L 下游引物 Nos -R2 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 L 探针 qPCR -P 10 mol/L 0.2 mol/L 0.5 L 模板 DNA2.0 L ddH 2 O18.0 L 总体积25 L F 反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积或不同仪器的要求进行适当调整。 7.3.4.2 反应程序 95 预变性 5 min ；之后 95
18、变性 15 s，61 退火 30 s，收集荧光，共 40 个循环。同时设阳性 对照、阴性对照和空白对照。 7.3.5 结果判断 7.3.5.1 综合分析仪器给出的各项结果，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高 点为准。 7.3.5.2 阳性对照样品有对数扩增曲线，而且 Ct 值 30 ；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且 Ct 值 40 或未检出，二者均成立才可判定试验成立。 7.3.5.3 检验样本 Ct 值 35，并且曲线有明显的对数增长期，报告熊蜂微孢子虫阳性； 7.3.5.4 检验样本 35 Ct 值 40 时，重复一次，如果 Ct 值仍然 40，并且曲线有明显的对数增长
19、 期，报告熊蜂微孢子虫阳性，否则报告熊蜂微孢子虫阴性； 7.3.5.5 样本 Ct 值为零或 Ct 值 40 时，报告熊蜂微孢子虫阴性。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5283 2020 附 录 A （规范性） 试剂的配制 A.1 酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇混合液 用 1.0 mol/L Tris 饱和酚（pH7.90.2）、三氯甲烷和异戊醇按 25241 的比例混合，密闭避光 保存。 A.2 三氯甲烷 / 异戊醇混合液 将三氯甲烷和异戊醇按 241 的比例混合，密闭避光保存。 A.3 TBE 电泳缓冲液（5 浓缩液） Tris 54.0 g 硼酸 27.5 g EDTA 2.9 g 加
20、蒸馏水至 1 000 mL 用 5 mol/L 的盐酸（HCl）调到 pH 8.0，或直接购买商品化的产品。 A.4 上样缓冲液 溴酚蓝 0.25 g 蔗糖 40 g 蒸馏水 100 mL 溶解混匀后 121 高压灭菌 15 min。 A.5 溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB） 溴化乙锭（EB） 100 mg 蒸馏水 10 mL 用蒸馏水配制成 10 mg/mL 的浓缩液。用时每 100 mL 染色液中加 10 L 的浓缩液。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5283 2020 附 录 B （资料性） 熊蜂微孢子虫病 B.1 疫病概述 微孢子虫病是目前熊蜂病害中最引人关注、研
21、究最广的一种病，它既能感染蜂王，也可侵染工 蜂成年蜂、幼虫和蛹，感染微孢子虫的熊蜂蜂群死亡率比正常情况下高出 5 倍。熊蜂被感染后逐渐衰 弱，出现发育延迟、行动迟缓、食欲下降、爬蜂等慢性症状，因微孢子虫侵入中肠，也可造成肠道机 能紊乱，使熊蜂下痢、腹部肿胀，群势变弱，蜂蜜和蜂王浆产量减小，给蜂场造成严重损失。蜂王被 感染后虽无明显症状，仍能交配产卵，继续其生命进程，但产卵推迟，寿命缩短，产卵能力也降低， 甚至造成整个蜂群的衰亡。 B.2 病原学 熊蜂微孢子虫（ Nosema bombi，简称 N. bombi）是Fantham 等首次从熊蜂身上分离出一种微孢子虫， 它主要危害熊蜂，是熊蜂最主要
22、的病虫害之一。在 400 X600 X 光学显微镜下观察，熊蜂微孢子虫呈 边缘发暗的椭圆形粒子，长约 5 nullm7 nullm，宽约 3 nullm4 nullm，外部形态短而宽，带有蓝色折光。 图 B.1 成熟微孢子虫孢子纵剖 EX ：孢子外壁；EN ：孢子内壁；PM ：质膜；AD ：固定板；PL ：片状原生质体；PT ：极丝管； N ：细胞核；NU ：核仁；PV ：后极泡；RER ：粗面内质网。 图 B.2 光学显微镜下的释放了的微孢子虫 G ：发芽的孢子；U ：未发芽的孢子；PT ：外翻的极丝。 以正式出版文本为准 8 SN/T 5283 2020 B.3 流行病学 熊蜂微孢子虫为熊
23、蜂的一种严重病害，在自然界广泛传播。Nb 由熊蜂食入后，最初在其马氏管 中发育，后逐渐侵入中肠、气管、结缔组织和脂肪体中。熊蜂微孢子虫感染的高峰期在春季和秋季， 不仅感染熊蜂成蜂，也包括其幼虫和蛹。 微孢子虫的传播主要有种群内部或种群之间的水平传播和世代间的垂直传播两种途径。水平传播 主要因吞食孢子经口侵入，包括病蜂与健康蜂的直接接触和对巢内或一定范围内蜜粉源或水源等的污 染造成的间接感染。垂直传播则主要经卵传染，家蚕通过繁殖将微孢子虫传染给下一代，进行世代间 的垂直传播；蜜蜂的微孢子虫则可长期存活于其储蜜中，随着越冬蜂群进行世代间的垂直传播。由于 熊蜂的生活史特性，没有这样的储蜜库，严重感染
24、微孢子虫的越冬蜂王大多在未产卵前死亡，轻度和 中度感染蜂王所产的卵并未发现微孢子虫感染，因此可认为微孢子虫在熊蜂中只有水平传播这一种途 径，但这一说法还有待进一步的研究证实。 B.4 临床诊断 B.4.1 临床症状 微孢子虫是成年常见病害，由于其潜伏期长，外部特征不明显，养蜂生产上很容易被忽略。其造 成消化功能紊乱，体质下降，寿命缩短，严重影响了蜂群的发展。被微孢子虫孢子侵染前期的工蜂与 健康工蜂没有差别，活动正常，后期由于大量孢子侵染中肠上皮细胞，肠道受损，严重影响的消化吸 收功能，降低工蜂间的食物分配，导致营养不良，生理功能减弱，个体变得虚弱，体质下降，行动迟 缓，寿命缩短。 B.4.2
25、病理变化 蜂王感染熊蜂微孢子虫孢子后通常表现为卵巢发育不良，卵母细胞退化， 卵巢管萎缩， 产卵量下 降，并很快停止产卵，几周后死亡。受到熊蜂微孢子虫孢子侵染的熊蜂的中肠形态发生明显变化，健 康工蜂中肠呈蜜黄色，孢子侵染后中肠变灰白色。 以正式出版文本为准 9 SN/T 5283 2020 附 录 C （资料性） 熊蜂微孢子虫病 C.1 PCR 扩增的熊蜂微孢子虫 16S rRNA 基因序列（共 213 bp）（GenBank: KF188740.1） ccagcagtaaactatgccgacgatgtgatatgagtatttgtattacatagtagaaattagagttttttggct
26、ctggggatagtatgatcgcaagattgaaaattaaag aaattgacggaagaataccacaaggagtggattgtgcggcttaatttgactcaacgcgaggtaacttaccaatattttattattctgagagaatcctgattcgag C.2 实时荧光 PCR 扩增的熊蜂微孢子虫 16S rRNA 基因序列（共 151 bp）（GenBank: MK128979.1） gtctctcaggctccttctccggaatattacaaagtaataccgttacccgtcactgccttgttaagccattaccctaacaactagctgat
27、aggtctcactcttactgt acacatgttatctacactttaacgtagttatctgcggtgcacat 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 24 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：1551752 定价 16.00 元 熊蜂微孢子虫检疫技术规范 行 业 标 准 SN/T 52832020 * * * SN/T 5283 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
