1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5214 2020 伯乐树鉴定方法 Identification of Bretschneidera sinensis Hemsl. 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 65. 020. 01 CCS B 16 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5214 2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 给出的规则起草。 本文件中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国大连
2、 海关。 本文件主要起草人：于文涛、陈乃中、崔博采、李敏、李明福、王有福、虞赟、许瑾、李佳。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5214 2020 伯乐树鉴定方法 1 范围 本文件规定了伯乐树的鉴定方法。 本文件适用于伯乐树的鉴定。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 蒴果 capsule 由合生心皮的复雌蕊发育成的果实，子房 1 室或多室，每室有多粒种子。 3.1.2 中轴胎座 axial placentation 雌蕊是由多心皮构成，各心皮互相连合，在子房里形成中轴与隔膜，子
3、房室数和心皮数相同， 胚珠着生在中轴上。 3.1.3 总状花序 raceme 无限花序的一种。其特点是花轴不分枝，较长，自下而上依次着生许多有柄小花，各小花花柄等 长，开花顺序由下而上。 3.1.4 羽状复叶 pinnate 小叶在叶轴的两侧排列成羽毛状的复叶称为羽状复叶。 3.1.5 皮孔 lenticel 树木枝干表面、肉眼可见的一些裂缝状的突起。为茎与外界交换气体的孔隙。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp ：碱基对（base pair） 以正式出版文本为准 2 SN/T 5214 2020 CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium brom
4、ide） dNTP ：脱氧核糖核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） OD ：光密度值（optical density） Taq 酶：栖热水生菌 DNA 聚合酶 4基本信息 伯乐树的基本信息如下： 中文名：伯乐树，钟萼木，冬桃，钟古树 学名： Bretschneidera sinensis Hemsl. 异名： Bretschneidera yunshanensis Chun & F.C. How 英文名：Boleshu 分类地位：隶属伯乐树科 Bretschneideraceae、
5、伯乐树属 Bretschneidera Hemsl.。伯乐树为单型科， 即伯乐树科内仅伯乐树属一属，伯乐树属内仅伯乐树一种。 伯乐树其他信息参见附录 A。 5方法原理 伯乐树可能以果实、种子、植株残体、植物标本和幼苗等形式进出境。伯乐树种子、叶等形态特 征及标准 DNA 条码是鉴定该种的主要依据。其中种子和叶片等形态特征均完整时以形态特征作为鉴 定依据，种子或叶片等形态特征不完整时以分子特征作为鉴定的主要依据。 由于伯乐树科为单型科，鉴定为伯乐树科即为鉴定为伯乐树。 6设备和试剂 6.1 设备及器具 体视显微镜、电子天平、放大镜、解剖刀、解剖针、镊子、指形管、培养皿、白瓷盘、棉花、 样品袋、标
6、本夹、标签、记录纸、标本瓶、标本盒、常规 PCR 仪、微量分光光度仪、电泳仪、凝胶 成像系统、高速冷冻离心机、生物安全柜、烘箱、高压灭菌锅、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯 水仪、旋涡振荡器、冰箱、冷冻混合研磨仪、微量移液器（2 L，10 L，20 L，100 L，200 L， 1000 L）、离心管（2 mL）、PCR 反应管（0.2 mL，0.5 mL）。 6.2 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNA Marker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷 酸（dNTP）、Taq 聚合酶、10PCR 缓冲液、防虫剂、樟脑精、干燥剂、CT
7、AB 法提取试剂（参见附录 B）。 7实验室检测 选择现场检疫截获的原始样品的一部分为待检样品，该样品数量（株数或重量）的 1/2 至 3/4（较 少样品时）作为检验样品，剩余样品作为保存样品。送检样品不足 3 株或 1.0 kg 的全检。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5214 2020 8鉴定方法 8.1 形态学鉴定方法 依据伯乐树的形态特征、基于种子形态特征的伯乐树及近似属种鉴定检索表（参见附录 C）和叶 片形态特征的伯乐树及近似种分种检索表（参见附录 D 和附录 E）对疑似样品进行物种鉴定。 8.1.1 伯乐树科形态学特征 8.1.1.1 叶 叶互生，奇数羽状复叶；小叶对生或下部的
8、互生，有小叶柄，全缘，羽状脉；无托叶。 8.1.1.2 花 花大，两性，两侧对称，组成顶生、直立的总状花序；花萼阔钟状，5 浅裂；花瓣 5 片，分离， 覆瓦状排列，不相等，后面的 2 片较小，着生在花萼上部；雄蕊 8 枚，基部连合，着生在花萼下部， 较花瓣略短，花丝丝状，花药背着；雌蕊 1 枚，子房无柄，上位，3 室 5 室，中轴胎座，每室有悬 垂的胚珠 2 颗，花柱较雄蕊稍长，柱头头状，小。 8.1.1.3 果实及种子 果为蒴果，3 瓣裂 5 瓣裂，果瓣厚，木质；种子大。 8.1.2 伯乐树形态特征（参见附录 F） 8.1.2.1 全株及茎 乔木，高 10 m20 m，树皮灰褐色；小枝有较明
9、显的皮孔。 8.1.2.2 叶 奇数羽状复叶通常长 25 cm 45 cm，总轴有疏短柔毛或无毛；叶柄长 10 cm 18 cm，小叶 7 片 15 片，纸质或革质，狭椭圆形，菱状长圆形，长圆状披针形或卵状披针形，多少偏斜，长 6 cm 26 cm， 宽 3 cm9 cm，全缘，顶端渐尖或急短渐尖，基部钝圆或短尖、楔形，叶面绿色，无毛，叶背粉绿色 或灰白色，有短柔毛，常在中脉和侧脉两侧较密；叶脉在叶背明显，侧脉 8 对 15 对；小叶柄长 2 mm10 mm，无毛。 8.1.2.3 花序 总状花序长 20 cm 36 cm ；总花梗、花梗、花萼外面有棕色短绒毛；花淡红色，直径约 4 cm， 花
10、梗长 2 cm3 cm ；花萼直径约 2 cm，长 1.2 cm1.7 cm，顶端具短的 5 齿，内面有疏柔毛或无毛， 花瓣阔匙形或倒卵楔形，顶端浑圆，长 1.8 cm 2 cm，宽 1 cm1.5 cm，无毛，内面有红色纵条纹；花 丝长 2.5 cm3 cm，基部有小柔毛；子房有光亮、白色的柔毛，花柱有柔毛。 8.1.2.4果实 蒴果椭圆球形，近球形或阔卵形，长 3 cm 5.5 cm，直径 2 cm3.5 cm，被极短的棕褐色毛和常 混生疏白色小柔毛，有或无明显的黄褐色小瘤体，果瓣厚 1.2 mm 5 mm ；果柄长 2.5 cm3.5 cm，有 或无毛。 8.1.2.5种子 种子椭圆球形
11、，平滑，成熟时长约 1.8 cm，直径约 1.3 cm。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5214 2020 8.2分子生物学鉴定方法 8.2.1样品的处理 将需要提取 DNA 的伯乐树植物材料（新鲜植物组织 100 mg，硅胶干燥的叶为 10 mg），放入 2 mL 的 EP 管中，每个管内加 2 粒钢珠，加液氮后使用冷冻混合研磨仪研磨 3 min（30 次 /s）。 8.2.2核酸的制备 采用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的 CTAB 法提取植物基因组总 DNA。改良的 CTAB 法参见附录 B。 PCR 级 DNA 溶液的 OD260 /OD280 比值应为 1.71.9。 8
12、.2.3DNA 条形码片段扩增 利用 rbcL 基因的通用引物进行 rbcL 基因扩增，引物序列、PCR 反应程序和 PCR 反应体系参见附 录 G。 8.2.4PCR 产物的检测 取 PCR 产物 5 L，1.5% 琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。 rbcL 引物扩增可获得约 991 bp 的扩增片段。 8.2.5测序与序列处理 取剩余的 PCR 扩增产物 45 L，经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用 DNA 产物纯化试剂 盒纯化并测序。测序引物与 PCR 扩增引物相同。 测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，
13、两 端测序质量 Q 值小于 20 的序列去除。 8.2.6 标准 DNA 条码 伯乐树 rbcL 基因序列 GenBank 登录号：MG792130。 9结果判定 9.1 形态学结果判定 以果实、种子、叶的形态特征为依据，符合第 8 章所描述的形态鉴定特征并符合基于种子形态特 征的伯乐树及近似属种鉴定检索表（参见附录 C）和基于叶片形态特征的伯乐树及近似种分种检索表 （参见附录 D）中伯乐树特征的，可鉴定为伯乐树。 9.2 分子生物学结果判定 登录 GenBank 数据库 BLAST 鉴定系统（http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），在 BLAST 结果
14、中 查看序列相似性最高（Max ident or Similarity ）的物种，一般为与查询序列最接近的物种。当序列鉴 定率最高物种为 Bretschneidera yunshanensis 时，可作为鉴定为伯乐树的依据。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5214 2020 10标本和样品的保存与处理 10.1 保存方法 10.1.1 标本保存 将鉴定检出的伯乐树植株部分压制成干标本，将鉴定检出的伯乐树种子装入标本瓶内，加以标 识，注明编号、中文名称、学名、科别、产地、货物名称、进出境日期，经手人签字后妥善保存。 10.1.2 样品保存 保存样品按编号、中文名称、产地、进出境日期分别存放，
15、并由经手人标识确认和样品管理员 登记后，妥善保存。 10.2 保存时间 检出的伯乐树样品，妥善保存至少 6 个月。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5214 2020 附 录 A （资料性附录） 伯乐树其他信息 A.1 学名考证 陈焕镛和侯宽昭 1958 年把在湖南采得的两号标本（武冈云山，张宏达 4650 ；衡山方广寺，朱国 兴 99）发表为新种，定名“云山伯乐树 Bretschneidera yunshanensis Chun et How”；提出因果实较小， 近球形或阔卵状，果瓣较薄较阔，果瓣外面有明显的小瘤体，种子阔椭圆状，较小等特征而与本种相 区别。后傅书遐（1984）认为新种不应
16、成立，予以归并。 A.2 保护地位 伯乐树为国务院 1999 年公布的国家重点保护野生植物名录（第一批）中的 I 级重点保护野生 植物，1992 年林业部公布的国家珍贵树种名录一级。世界自然保护联盟濒危物种红色名录（IUCN Red List of Threatened Species）将其评估为“濒危 Endangered（EN）”等级。 A.3 经济价值 在研究被子植物的系统发育和古地理、古气候等方面都有重要科学价值。伯乐树树姿挺拔，雄伟 高大，绿荫如盖，主干通直，材质优良，出材率高，在阔叶树中十分少见。粉红色花序极为艳丽，蒴 果红褐色，观花观果效果非常好，是既可用材又可观赏的珍贵园林树种
17、。 A.4 地理分布 产四川、云南、贵州、广西、广东、湖南、湖北、江西、浙江、福建等省区。生于低海拔至中海 拔的山地林中。越南北部也有分布。模式标本采自云南勐遮和思茅。 A.5 生长环境 伯乐树经常长在阔叶林下，生长速度缓慢。 以正式出版文本为准 7 SN/T 5214 2020 附 录 B （资料性附录） DNA 提取方法（改良 CTAB 法） B.1试剂 CTAB 提取液：CTAB 20 g/L，氯化钠 1.4 mol/L，Tris 0.1 mol/L（pH 8.0），EDTA 0.02 mol/L（pH8.0）， 高压灭菌备用。 三氯甲烷与异戊醇的体积分数比为 24 ： 1。 50TAE
18、 缓冲液：242 g Tris，57.1 mL 冰乙酸，100 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），充分溶解混匀 后，加水定容至 1 L，高压灭菌备用。 10 加样缓冲液：0.25溴酚蓝，40% 蔗糖。 B.2提取步骤 在含植物粉末的 2 mL 离心管加入已预热至 65 的 600 L CTAB 提取液，充分振荡混匀；65 水浴 30 min，不时颠倒混匀；10 000 r/min 离心 5 min，取上清，等体积氯仿 - 异戊醇（三氯甲烷： 异戊醇 =24 ： 1）抽提一次；取上清，再加入等体积异丙醇，4 沉淀 10 min 以上，然后 12000 r/m 离 心 10 mi
19、n，弃上清；70% 乙醇洗涤 12 次，晾干后，加入 20 L TE 缓冲液溶解沉淀，保存于 -20 冰箱冷冻备用。 以正式出版文本为准 8 SN/T 5214 2020 附 录 C （资料性附录） 基于种子形态特征的伯乐树及近似属种鉴定检索表 1. 外种皮肉质，中种皮木质，两侧有两条棱脊，顶端有尖头 苏铁属 Cycas L. 1. 外种皮革质、膜质或纸质，无木质中种皮 2 2. 种脐位于侧面，着生于荚果内长短不一的珠柄上 3 2. 种脐位于顶端或者底端 4 3. 种子卵形、椭圆形或近球形，子叶肥厚 槐属 Sophora L. 3. 种子椭圆形，平滑具光泽，上部约三分之二为鲜红色，下部三分之一
20、为黑色 相思子属 Abrus Adans. 4. 种子具假种皮，假种皮基部二浅裂 牛栓藤属 Connarus L. 4. 种子不具假种皮 5 5. 种子椭圆球形，长约 1.8 cm，直径约 1.3 cm，种脐近圆形 伯乐树 Bretschneidera sinensis Hemsl. 5. 种子近球状或稍扁，种子宽约 2 cm，种脐大，横椭圆形 七叶树属 Aesculus L. 注：本检索表内种子皆为红色具光泽种子 以正式出版文本为准 9 SN/T 5214 2020 附 录 D （资料性附录） 基于叶片形态特征的伯乐树及近似种分种检索表 1. 二回羽状复叶或多回羽状复叶 蛇床属 Cnidiu
21、m Cusson、芍药属 Paeonia L. 等 1. 一回羽状复叶 2 2. 偶数羽状复叶，整个复叶的小羽叶的数目为偶数 落花生属 Arachis Linn.、香椿属 Toona Roem. 等 2. 奇数羽状复叶，整个复叶的小羽叶的数目为奇数 3 3. 小叶边缘有锯齿 蔷薇属 Rosa L.、瘿椒树属 Tapiscia Oliv. 等 3. 小叶全缘，小叶边缘无锯齿 4 4. 羽状复叶对生 梣属 Fraxinus Linn.、吊灯树属 Kigelia DC. 等 4. 羽状复叶互生 5 5. 羽状复叶长 50 cm80 cm，有小叶 13 片 25 片；叶柄长 10 cm20 cm ；小
22、叶膜质 猫儿屎属 Decaisnea Hook. f. et Thoms. 等 5. 羽状复叶长 25 cm45 cm，总轴有疏短柔毛或无毛；叶柄长 10 cm 18 cm ；小叶 715 片，纸 质或革质，狭椭圆形、菱状长圆形、长圆状披针形或卵状披针形，多少偏斜，长 6 cm 26 cm，宽 3 cm 9 cm，顶端急尖或急短渐尖，基部钝圆、短尖或楔形，全缘，叶面绿色，无毛，叶背粉绿色或灰白 色，有短柔毛，常在中脉和侧脉两侧较密；叶脉在叶背明显，侧脉 8 对 15 对；小叶柄长 2 mm 10 mm，无毛 伯乐树 Bretschneidera sinensis Hemsl. 注：本检索表内植
23、物叶片皆为羽状复叶 以正式出版文本为准 10 SN/T 5214 2020 图 E.1 与伯乐树种子形态接近的其他果实及种子形态特征图 e）铁属 Cycas L. 附 录 E （资料性附录） 与伯乐树种子形态接近的其他植物果实及种子 a）槐属 Sophora L. b）相思子属 Abrus Adans. c）牛栓藤属 Connarus L. d）七叶树属 Aesculus L. 以正式出版文本为准 11 SN/T 5214 2020 附 录 F （资料性附录） 伯乐树形态特征图 图 F.1 伯乐树的形态特征照片 注： 图 a），b），c），d），e），f）引自 。 a）植株 b）树皮 c）羽状
24、复叶 d）总状花序 e）蒴果 f）种子 以正式出版文本为准 12 SN/T 5214 2020 图 F.2 伯乐树的形态特征墨线图（仿傅书遐 1984 ） （d）种子 （a）花枝 （b）花纵切面 （c）果实 以正式出版文本为准 13 SN/T 5214 2020 附 录 G （规范性附录） 序列扩增引物及流程 G.1引物序列 引物序列见表 G.1。 表 G.1 引物序列 引物 引物序列 Forward rbcL-1F ATGTCACCACAAACAGAAAC Reverse rbcL-991R CGGTACCAGCGTGAATATGAT G.2 PCR 反应程序 PCR 反应程序见表 G.2
25、表 G.2 PCR 反应程序 步骤 反应温度（） 时间 循环数 预变性 94 5 min 变性 94 30 s 35退火 50 30 s 延伸 72 300 s 延伸 72 10 min 以正式出版文本为准 14 SN/T 5214 2020 G.3PCR 反应体系 PCR 反应体系见表 G.3 表 G.3 PCR 反应体系 成分 储备液浓度 50nullL 反应体系加样体积（ nullL） dNTP 混合物 ( 各 10 mmol/mL) 2.5 mmol/L 4.0 10PCR 缓冲液 ( 含 Mg2+） 5.0 正向引物 10 pmol/L 2.0 反向引物 10 pmol/L 2.0
26、Taq 酶 5 U/nullL 0.5 DNA 模板 0.3 ug/nullL6 ug/nullL 2.0 ddH 2 O 补至 50 nullL 同时要设置阳性对照，空白对照（以 ddH 2 O 代替 DNA 样品），每个样品重复 2 次。可用商品化 的 PCR Premix。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5214 2020 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 3.25 字数 91 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号： 155175155 定价 52.00 元 伯乐树鉴定方法 行 业 标 准 SN/T 52142020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
