1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5201 2020 代替 SN/T 11622002 林麝物种鉴定技术规范 Protocol for species identification of moschus berezovskii 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 65.020.01 CCS B 43 2019-12-30 发布 2021-07-01 实施 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 52012020 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科
2、学研究院、东北林业大学。 本文件主要起草人：吕继洲、吴绍强、林祥梅、袁向芬、王晓龙、王彩霞。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 52012020 林麝物种鉴定技术规范 1范围 本文件规定了林麝物种的形态学和 PCR 鉴定方法。 本文件适用于林麝及其产品的物种鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489实验室生物安全通用要求 GB/T 2740
3、3实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 COI ：细胞色素 c 氧化酶亚基 I（cytochrome c oxidase subunit 1）； DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）； dNTP ：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）； PCR ：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）； SDS ：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）。 4形态特征 林麝典型形态特征见附录 A。
4、 5PCR 检测 5.1仪器设备 5.1.1常规 PCR 仪。 5.1.2组织研磨器。 5.1.3超净工作台。 5.1.4制冰机。 5.1.5高速冷冻离心机。 5.1.6水浴锅。 5.1.7台式小型离心机。 5.1.8常规冰箱。 以正式出版文本为准 2 SN/T 52012020 5.1.9旋涡振荡器。 5.1.10电泳仪。 5.1.11凝胶成像系统。 5.1.12微量可调移液器（10 L、100 L、1 000 L）及配套吸头。 5.2试剂与材料 5.2.1无水乙醇。 5.2.2蛋白酶 K（20 mmol/ L ）。 5.2.350TAE 缓冲液（试剂配制见附录 B 中 B.1）。 5.2.
5、4阳性对照（林麝的基因组 DNA）。 5.2.5Tirs-HCl 缓冲液（试剂配制见附录 B 中 B.3）。 5.2.6生理盐水（试剂配制见附录 B 中 B.4）。 5.2.7EDTA 溶液（试剂配制见附录 B 中 B.5）。 5.2.8TES 缓冲液（试剂配制见附录 B 中 B.6）。 5.2.910% SDS 溶液（试剂配制见附录 B 中 B.7）。 5.2.10氯化钠。 5.2.11三氯甲烷。 5.2.12异丙醇。 5.2.13冰乙酸。 5.2.14Tris 饱和酚。 5.2.1570% 乙醇。 5.2.16Goldview 核酸染料。 5.2.17 Taq DNA 聚合酶。 5.2.1
6、8dNTP（2.5 mmol/L）。 5.2.19琼脂糖。 5.2.20灭菌双蒸水（应符合 GB/T 6682 中一级水的规格，见附录 B 中 B.8）。 5.3引物对 MBF: 5- CTTTCTTATTACTTCTAGCCTCC-3（扩增林麝 COI 5端基因通用上游引物） MBR: 5- ATACTGATCATACAAATAATGGA-3（扩增林麝 COI 5端基因通用下游引物） 用双蒸水将引物稀释为 20 mol/L 工作浓度，-20保存备用。 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，试验用水应符合 GB/T 6682 的规定。 5.4检测方法 5.4.1样品的处理 5.4.1.1直
7、接取新鲜的、冷藏的或冷冻的样品 200 L 用于核酸提取。 5.4.1.2 使用生理盐水洗去血污，取 100 mg200 mg 样品置于液氮中充分研磨，将所研磨的粉末放入 1.5 mL 的离心管中用于核酸提取。 5.4.2样品 DNA 的提取 采用以下方法提取 DNA，也可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按操作说明书进行操作。 a）取 5.4.1 中处理好的样品，加入 450 L TES 缓冲液混匀后再加入 50 L SDS 溶液 （10%），5 L 蛋白酶 K（20 mg/mL），充分混匀后，于 56 保温 4 h，每 2 h 摇 1 次。 以正式出版文本为准 3 SN/T 52012
8、020 b）加入等体积的 Tris 饱和酚（500 L），混匀。 c）取上层水相于新管，加入等体积的酚三氯甲烷异戊醇（25241）（试剂配制见附录 B 中 B.9）混匀，12 000 r/min 室温离心 5 min。 d）取上层水相于新管，加入等体积的三氯甲烷混匀，12 000 r/min 室温离心 5 min。 e）取上层水相，加入 2.5 倍体积的无水乙醇，混匀，置于 -20 2 h 以上或过夜，12 000 r/min 室温离心 15 min。 f）弃上清液，加入 1 mL 预冷的 70% 乙醇，12 000 r/min 室温离心 5 min。 g）吸弃残留液体，室温干燥 10 min
9、 左右，用 50 L 灭菌双蒸水溶解，-20 保存备用。 5.4.3PCR 扩增检测 5.4.3.1PCR 反应体系 10PCR 缓冲液 5.0 L dNTPs （2.5 mmol/L） 5.0 L MBF（20 pmol/ L） 1.0 L MBR（20 pmol/ L） 1.0 L 样品 DNA 2.0 L Taq DNA 聚合酶 0.5 L 灭菌双蒸水 35.5 L 总体积为 50 L 体系，用漩涡混匀器进行混匀，瞬间离心，4备用。 注： 也可使用其他商品化 PCR 扩增试剂盒，如 Promega GoTaq null G2 DNA Polymerase 试剂盒。 样品检测时，同时要设阳
10、性对照和空白对照。阳性对照是已知的林麝提取的基因组 DNA（见附 录 B.2），空白对照是灭菌双蒸水。 5.4.3.2PCR 程序及反应条件 反应参数为 95 1 min ；95 变性 30 s，48 退火 30 s，72 延伸 1 min，38 个循环；然后 72 延伸 10 min，最后 4保存。 注：没有热盖 PCR 仪器需加入矿物油 40 L。 5.4.4PCR 产物的电泳检测 用 TAE 电泳缓冲液配制 1% 琼脂糖凝胶板（Goldview 染料终浓度 0.5 g/mL）。将平板放入水平电 泳槽中，加入 1TAE 电泳缓冲液刚刚高出凝胶表面，将 PCR 扩增产物 5 L 和相应的上样
11、缓冲液混 合，分别加入样品孔中，电压 80 V100 V，电流 40 mA50 mA，电泳 30 min45 min。 5.4.5凝胶成像系统观察 扩增产物经电泳结束后，用凝胶成像仪观察检测结果、拍照，记录试验结果。 5.5结果判定 5.5.1形态初筛 根据附录 A 所述林麝及其近似种形态特征，初步筛查出林麝疑似样品，以待进一步核酸扩增、 测序检测鉴定。 5.5.2PCR 实验成立的判定依据 在经过琼脂糖凝胶电泳后，只有阳性对照引物扩增条带大小与预期一致（243 bp），同时阴性对 以正式出版文本为准 4 SN/T 52012020 照无相应片段时，才可判定 PCR 扩增试验成立，否则本次实验
12、无效。 5.5.3疑似样本的判定依据 若样品有条带扩增且大小与预期一致，可判定样品中疑似含有林麝源性成分，后将扩增获得的 COI 序列进行测序；若样品无目的条带，则判定样品林麝源性成分阴性。 5.5.4林麝物种的判定 将测序获得序列与附录 C 中参考 COI 序列（也可使用国际 DNA 条形码鉴定数据库 Boldsystems 中的数据，www.boldsystems.org）进行 BLAST 多重序列比对，具体判定如下：如果与所获序列相似性 最高的序列属于林麝，且相似性达到 99% 以上时，则判定为对应实验的阳性结果，进而确定为检出 林麝源性成分。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5201
13、2020 附录A （规范性） 林麝形态特征概述 林麝形态态特征概述见表 A.1 表 A.1林麝形态特征概述 物种 被毛特征 其他特征 林麝 体毛粗硬色深，呈橄榄褐色，并染以橘红色 下颌、喉部、颈下以至前胸间为界限分明的白色 或橘黄色，臀部毛色近黑色 安徽麝 体毛毛色较棕红，体背部有桔黄色斑点，在腰及 臀部两侧明显而密集 头骨的颧宽较小。颊、额及耳背灰黑色，耳壳边 缘黑褐色，耳壳内为白色。颏及喉白色，有白色 条纹向两颊伸延，向后沿下颈两侧有两条白纹在 胸前连成长环状，中央为灰褐色，在颊后的颈侧 有两个小的白色斑点 原麝 身体的毛色为黑褐色，背部隐约有六行肉桂黄色 的斑点，颈部两侧至腋部有两条明显
14、的白色或浅 黄色纵纹，从喉部一直延伸到腋部 耳长，大而直立 马麝 被毛多为棕褐色、黄褐色 前额、头顶及面颊褐色，略带青灰色；颈纹黄白 色，纹的轮廓不明显 以正式出版文本为准 6 SN/T 52012020 附录B （规范性） 试剂的配制 B.150TAE 电泳缓冲液 Tris 242 g Na 2 EDTA2H 2 O 37.2 g 冰乙酸 57.1 mL 双蒸水定容至 1 000 mL 充分溶解，室温保存。 B.2阳性对照 称取 100 mg 林麝组织（肌肉、毛发等），应用 5.4.2 中 DNA 提取方法或商品化 DNA 提取试剂盒， 提取基因组 DNA，使用 50 L 灭菌双蒸水溶解或洗
15、脱基因组 DNA，-20保存。 B.31 mol/L Tris-HCL 缓冲液（pH=8.0） 40 mL 双蒸水，6.057 g 固体 Tris 放入烧杯中溶解，用浓盐酸调 pH 值到 8.0，转移到 50 mL 容量 瓶中，加入双蒸水定容，摇匀后，转到准备好的溶液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 保存备用。 B.40.85% NaCl 溶液（生理盐水） 在 20 mL 双蒸水中溶解 0.85 g 固体 NaCl，加水定容至 100 mL，摇匀后，转到准备好的输液瓶中， 贴上标签，高压灭菌后，降至室温，4 保存备用。 B.50.5 mol/L EDTA 溶液（pH=8.0） 将 9.
16、08 g 的 Na 2 EDTA2H 2 O 溶解于 40 mL 双蒸水，用 1 g 的 NaOH 颗粒（慢慢逐步加入）调 pH 值 到 8.0，用 50 mL 容量瓶定容，如果 EDTA 难溶，先加 NaOH 溶解，然后逐步加入 Na 2 EDTA2H 2 O。 B.6TES 缓冲液 将 0.584 4 g 的 NaCl 溶解于 80 mL 双蒸水，在分别加入 1mL 的 0.5 mol/L EDTA、0.2 mL 的 Tris- HCl （pH=8.0），加定容至 100 mL, 摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室 温，4 保存备用。 B.710% SDS 溶液 将
17、10 g的十二烷基硫酸钠（SDS）溶解于80 mL双蒸水于68 加热溶解，用浓HCl调至 pH=7.2，定容至 100 mL，摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，4 保存备用。 以正式出版文本为准 7 SN/T 52012020 B.8灭菌双蒸水 双蒸水是重蒸水的一种，是将经过一次蒸馏后的水，再次蒸馏得到的水。双蒸水再经过高压蒸汽 灭菌（压力升至 103.4 kPa，温度达 121 ，持续 20 min），得到灭菌双蒸水。 B.9酚三氯甲烷异戊醇 饱和酚（pH8.0） 25 mL 三氯甲烷 24 mL 异戊醇 1 mL 使用前配制，4 可保存 2 月。 以正式出版文本为准 8 SN/T 5
18、2012020 附录C （规范性） 参考序列 C.1 林 麝（ Moschus berezovskii） 扩 增 线 粒 体 COI 片 段 基 因 序 列（243 bp）（NCBI 序 列 号： JX627395.1） CTTTCTTATTACTTCTAGCCTCCTCTATAGTTGAAGCTGGAGCAGGAACAGGCTGAACTGTATATCCC CCTTTAGCTGGCAACCTGGCTCACGCAGGAGCCTCTGTAGACCTAACTATTTTTTCTTTACACCTAGCAGG TGTTTCCTCCATTCTAGGGGCTATTAATTTTATTACAACAATTATTAA
19、TATAAAACCCCCAGCTATATCAC AATATCAAACTCCATTATTTGTATGATCAGTAT C.2 林 麝（ Moschus berezovskii） 扩 增 线 粒 体 COI 片 段 基 因 序 列（243 bp）（NCBI 序 列 号： GQ329033.1） CTTTCCTATTACTTCTAGCCTCCTCTATAGTTGAAGCTGGAGCAGGAACAGGCTGAACCGTATATCCC CCTTTAGCTGGCAACCTGGCCCACGCAGGAGCCTCTATAGACCTAACTATTTTTTCTCTACACCTAGCAGG TGTTTCCTCCATT
20、CTAGGGGCTATTAATTTCATTACAACAATTATTAATATAAAACCCCCAGCTATATCAC AATATCAAACTCCATTATTTGTATGATCAGTAT C.3 林 麝（ Moschus berezovskii） 扩 增 线 粒 体 COI 片 段 基 因 序 列（243 bp）（NCBI 序 列 号： MH047347.1） CTTTCCTATTACTTCTAGCCTCCTCTATAGTTGAAGCTGGAGCAGGAACAGGCTGAACCGTATATCCC CCTTTAGCTGGCAACCTGGCTCACGCAGGAGCCTCTGTAGACCTAACTAT
21、TTTTTCTCTACACCTAGCAGG TGTTTCCTCCATTCTAGGGGCTATTAATTTTATTACAACAATTATTAATATAAAACCCCCAGCTATATCAC AATATCAAACTCCATTATTTGTATGATCAGTAT C.4 林 麝（ Moschus berezovskii） 扩 增 线 粒 体 COI 片 段 基 因 序 列（243 bp）（NCBI 序 列 号： JX627397.1） CTTTCTTATTACTTCTAGCCTCCTCTATAGTTGAAGCTGGAGCAGGAACAGGCTGAACCGTATATCCC CCTTTAGCTGGCAAC
22、CTGGCCCACGCAGGAGCCTCTGTAGACCTAACTATTTTTTCTCTACACCTAGCAGG TGTTTCCTCCATTCTAGGGGCTATTAATTTTATTACAACAATTATTAATATAAAACCCCCAGCTATATCAC AATATCAAACTCCATTATTTGTATGATCAGTAT 以正式出版文本为准 9 SN/T 52012020 参考文献 1盛和林等 . 中国麝科动物 M. 上海：上海科学技术出版社，2007. 2汪成海 . 安徽麝的种群分布及保护措施 J. 安徽林业科技，2010（3）: 65-66. 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 24 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：15517534 定价 18.00 元 林麝物种鉴定技术规范 行 业 标 准 SN/T 52012020 * * * SN/T 5201 2020 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
