1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5226 2019 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光 PCR 法 Detection of Trionyx Sinensis ingredient in export food Real-time rluorescent PCR method 2019-12-27发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5226 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及
2、专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国上海海关、中华人民共和国大连 海关、中华人民共和国厦门海关。 本标准主要起草人:苗丽、李想、张秀平、黄新新、郭德华、郑秋月、孔凡德、徐淑菲、黄世 英、李志娟。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5226 2019 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了出口食品中鳖源性成分的实时荧光 PCR 检测方法。 本标准仅适用于食品中中华鳖、黄沙鳖、黑鳖、珍珠鳖、山瑞鳖、刺鳖、小鳖、印度小头鳖和 缅甸缘板鳖
3、等鳖成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鳖 Trionyx Sinensis 是爬行纲龟鳖目鳖科鳖亚科的一类水陆两栖爬行动物。其肉营养丰富,是滋补佳品,同时鳖肉和 鳖甲等也用作药材。 3.2 聚合酶链式反应 polyme
4、rase chain reaction ;PCR 模板基因序列先经高温变性成为单链,在 DNA 聚合酶作用和适宜的反应条件下,根据模板序列 设计的两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合,接着在 DNA 聚 合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和 延伸这一循环,使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。 3.3 实时荧光 PCR real-time fluorescent PCR 在 PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5226 2019 3.
5、4 Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA :deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸。 PCR :polymerase chain reaction,聚合酶链式反应。 dNTP :deoxyribonuleoside triphosphate,脱氧核苷酸三磷酸。 dATP :deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺苷三磷酸。 dCTP :deoxycytidine triphosphate,脱氧胞苷三磷酸。 dGTP :deoxyguanosine tr
6、iphosphate,脱氧鸟苷三磷酸。 dTTP :deoxythymidine triphosphate,脱氧胸苷三磷酸。 Tris :Tris(Hydroxymethyl)aminomethane,三羟甲基氨基甲烷。 EDTA :Ethylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸。 Taq :Thermus aquaticus,水生栖热菌。 OD :optical density,光度密度。 FAM :Carboxyfluorescein,羧基荧光素。 BHQ1 :Black hole quencher 1,黑洞猝灭基团 1。 5 方法提要 样品经研磨后,提取
7、DNA,以 DNA 为模板,采用鳖线粒体细胞色素 b 基因的特异性检测引物和 探针,进行实时荧光 PCR 扩增,观察实时荧光 PCR 的增幅现象,判断样品中是否存在鳖成分。 6 试剂和材料 除另有规定外,所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均 用无 DNA 酶污染的容器分装。 6.1 检测用引物和探针 鳖成分扩增引物和探针详见表 1。鳖引物扩增的靶标序列见附录 A。 表 1鳖成分扩增引物和探针 名称 引物 / 探针序列(5 null 3 null) 扩增片段长度 靶基因 鳖 -F CCAYYTGATGAAACTTTGGATC 157 bp cytoc
8、hrome b鳖 -R CGGATTAGTCAACCGTATTGTAC 鳖 -P FAM-TCACCAAAYATCTCYACAGCATTCTC-BHQ1 注:Y 代表碱基 C 或 T。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5226 2019 6.2 试剂 6.2.1 组织裂解液:1 mol/L Tris -HCl(pH8.0);0.5 mol/L EDTA(pH 8.0);10%(质量浓度)SDS。 6.2.2 蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL)。 6.2.3 饱和酚。 6.2.4 三氯甲烷。 6.2.5 异戊醇。 6.2.6 75% 乙醇。 6.2.7 NaAc 溶液(3 mol/L)。 6
9、.2.8 TE 缓冲液(Tris -HCl、EDTA 缓冲液):10 mmol/L Tris -HCl(pH8.0),1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。 6.2.9 实时荧光 PCR 反应混合液:12.5 L 反应体系包括 1U3 U 的 Taq 酶、1PCR 缓冲液、2.5 mmol/L 4.0 mmol/L 的 Mg 2+ 、0.2 mmol/L 的 dNTP。如果具有等效的商品化试剂盒,也可使用这些等效产品。 7 仪器和设备 7.1 实时荧光 PCR 仪。 7.2 离心机:离心速度不低于 12 000 r/min。 7.3 恒温水浴锅。 7.4 天平:感量 0.1 g、0.01
10、 g。 7.5 微量移液器:10 L、100 L 、200 L、1 000 L。 7.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.7 涡旋振荡器。 7.8 研钵及粉碎装置。 7.9 pH 计。 7.10 冰箱 2 8 、-20 。 8 检验步骤 8.1 DNA 提取 称取待检样品 200 g,研磨混匀,然后称取 100 mg 上述样品于 1.5 mL 离心管中,加入 700 L预 热(56 )的组织裂解液和20 L 蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL),使用涡旋振荡器混匀,56 水浴 2 h, 期间振荡混匀;向各管加入 700 L 饱和酚,上下颠倒混匀,12 000 r/min 4 离心 10
11、min ;转移上清 于洁净离心管中,加入 1/2 上清体积的饱和酚及 1/2 上清体积的三氯甲烷:异戊醇(24 : 1)上下颠倒 混匀,12 000 r/min 4 离心 10 min ;转移上清于洁净离心管中,加等体积的三氯甲烷 : 异戊醇(24 : 1)上下 颠倒混匀,12 000 r/min 4 离心 10 min ;转移上清于洁净离心管中,加等体积的三氯甲烷, 12 000 r/min 4 离心 10 min ;取上清约 400 L,加 2.5 倍体积的冷的无水乙醇和 1/10 体积的 NaAc 溶液(3 mol/L), - 20 沉淀 2 h 或者沉淀过夜;12 000 r/min
12、4 离心 30 min,弃液,加 1 000 L 75% 冷的乙醇, 12 000 r/min 4 离心 10 min ;弃上清,自然干燥后加入 50 L TE 缓冲液(pH8.0)溶解 DNA 沉淀,于 - 20 保存备用。 注:也可采用等效的 DNA 提取试剂盒提取样品 DNA。 8.2 DNA 浓度和纯度的测定 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A 260 和A 280 。DNA 的浓度按照式(1)计算: 以正式出版文本为准 4 SN/T 5226 2019 c=A 260 N50 (1) 式中: c DNA 浓度,单位为微克每毫升(
13、 g/mL); A 260 260 nm 处吸光值; N 核酸稀释倍数。 A 260 /A 280 比值在 1.71.9 之间时,适于实时荧光 PCR 扩增。 8.3 实时荧光 PCR 检测 8.3.1 实时荧光 PCR 反应体系 按照表 2 配制实时荧光 PCR 反应体系。每个样品进行检测时应设置 2 个平行。 表 2 实时荧光 PCR 反应体系 试剂名称 工作液浓度 加样量 / nullL 反应体系终浓度 PCR 反应混合液(2) 1 12.5 1 鳖 -F 10 nullmol/L 1.0 400 nmol/L 鳖 -R 10 nullmol/L 1.0 400 nmol/L 鳖 -P
14、10 nullmol/L 0.5 200 nmol/L DNA 模板 10 ng/nullL100 ng/nullL 2.0 去离子水 补齐至 25 nullL 8.3.2 实时荧光 PCR 反应参数 实时荧光 PCR 反应条件,随着仪器不同略有改变,一般为:95 /10 min ;95 /15 s,58 /60 s,40 个循环。 8.3.3 实验对照 检验过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含有鳖成分的样品做阳性对照, 用已知不含鳖成分的样品做阴性对照,用等体积的双蒸水代替模板 DNA 做空白对照。 9 质量控制 9.1 空白对照:无荧光对数增长,相应的 Ct 值大于 40
15、.0。 9.2 阴性对照:无荧光对数增长,相应的 Ct 值大于 40.0。 9.3 阳性对照:有荧光对数增长,且荧光通道出现典型的扩增曲线,相应的 Ct 值小于等于 30.0。 10 结果判定及表述 10.1 结果判定 在符合第 9 章的情况下,可做出如下结果判定: a)如 Ct 值小于等于 35.0,则判定为被检样品阳性; 以正式出版文本为准 5 SN/T 5226 2019 b)如 Ct 值大于等于 40.0,则判定为被检样品阴性; c)如大于 35.0 小于 40.0,则重复一次。如再次扩增后 Ct 值仍为小于 40.0,则判定被检样品阳性; 如再次扩增后 Ct 值大于等于 40.0,则
16、判定被检样品阴性。 10.2 结果表述 10.2.1 结果为阳性者,表述为“检出鳖成分”。 10.2.2 结果为阴性者,表述为“未检出鳖成分”。 11 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 274032008 中附录 D 的规定执行。 12 检出限 本方法所规定的最低检出限为 0.01%(质量百分比)。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5226 2019 附 录 A (资料性附录) 鳖成分基因扩增参考序列 A.1 中华鳖 Pelodiscus sinensis ccatttgatgaaactttggatcattattaggagcctgcttaatactacaaatcatca
17、caggcctattcctagccatacattactcaccaaacatctcaacagcatt ctcgtcaatcgcccacattacccgagatgtacaatacggttgactaatccg A.2 山瑞鳖 Palea steindachneri ccacttgatgaaactttggatccctattaggtgcttgcctaatcctacaaatcattacaggactattcttagccatacattattcaccaaacatctcaacagcattct catcaatcgcccatatcacccgagacgtacaatacggttgactaatccg A.3 刺鳖 Apal
18、one spinifera ccatctgatgaaatttcggatccctattaggcgcttgcctagccatccaaatcatcacagggttattcctagccatgcattactcaccaaacatcttaacagcatt ctcatcagtttcccacatcacccgggatgtacaatacggctgattaatccg A.4 珍珠鳖 Apalone ferox ccatctgatgaaatttcggatccctactaggcgcttgcctggccatccaaatcatcacaggattattcctagccatacattactcaccaaacatcttaacagcat
19、t ctcatcaatttctcacatcacccgagacgtacaatacggctgattaatccg A.5 黑鳖 Nilsonia nigricans cggtgtgatgaaacttcggatcccttctgggactctgtctaatcacccaaatcctaacaggactcttcctagcaatacattatacctcggacatttcaaccgcctt ctcttctgtcgcacacatttgccgagatgtaagttatggatgactaatccg 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN / T 52262019 SN/T 5226 2019 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 14 千字 2019 年 月第一版 2019 年 月第一次印刷 印数 1500 书号: 1551752 定价 16.00 元 出口食品中鳖源性成分的检测 实时荧光 PCR 法 行 业 标 准 SN/T 52262019 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号(100023) 编辑部:(010)65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址