1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5224 2019 出口食品中单核细胞增生 李斯特菌检验方法 实时荧光 PCR 内标法 Detection of Listeria monocytogenes in food for exportnullReal-time PCR with internal amplification control method 2019-12-27 发布 2020-07-01 实施 ICS 67.050 C 53 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5224 2019 前 言 本标准按照 GB/
2、T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国杭州海关、上海交通大学、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：李可、施春雷、王娉、史贤明、方莹、张晓峰、崔妍。 I 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5224 2019 出口食品中单核细胞增生李斯特菌检验方法 实时荧光 PCR 内标法 1范围 本标准规定了出口食品中单核细胞增生李斯特菌的实时荧光 PCR 内标方法。 本标准适用于出口食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的
3、版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.302016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB / T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB / T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3定义、术语和缩略语 下列定义、术语和缩略语适用于本文件。 3.1定义和术语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 扩增内标 internal amplification control，IAC 添加到 PCR 反应体系中用以指示假阴性现象的一段人
4、工构建 DNA 序列或者是一段致病菌的看家基 因序列。主要原理是：在荧光定量 PCR 中使用与目的基因相似的扩增内标，它的两端引物结合序列与 目的基因完全一致，但具有不同的探针结合序列，使之不能与目的基因的探针结合，只能与内标探针 结合。将扩增内标添加到 PCR 反应体系中，使之与目标基因序列共同进行扩增，如果在反应体系中存 在一些抑制因素，则扩增内标和目标序列的扩增都将受到抑制，从而达到指示 PCR 反应假阴性的目的。 3.1.2 C t 值 cycle threshold C t 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR（pol
5、ymerase chain reaction）：聚合酶链反应。 DNA（deoxyibonuleic acid）：脱氧核糖核酸。 FAM（6-carboxyfluorescein）：6- 羧基荧光素。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5224 2019 HEX（6-hexachlorofluorescein）：6- 羧基 -2，4，4，5，7，7- 六氯荧光素琥珀酰亚胺酯。 4方法提要 荧光 PCR 反应体系中，预先加入能同时扩增目标片段和扩增内标的引物，以及目标菌探针、内 标检测探针以及内标质粒，然后将样品 DNA 加入 PCR 反应液中进行两步法荧光 PCR 反应，在扩增 内标质粒与样品
6、 DNA 的共同扩增中如果存在抑制现象，扩增内标的 PCR 扩增也将被抑制，从而达到 对样品的荧光 PCR 检测过程进行假阴性监控目的。 5试剂 除另有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/ T 6682 中一级水的要求。 所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。 5.1DNA 提取试剂：DNA 提取液：20 mmol / L Tris-HCl， 2 mmol / L EDTA，1.2% Triton X-100（pH 8.0），也可使用商业化的 DNA 提取试剂。 5.2Taq DNA 聚合酶。 5.3dNTP 混合液。 5.410PCR 缓冲液：200 mmol/ L
7、 Tris-HCl（pH 8.4），200mmol/ L KCl，15 mmol/ L MgCl 2 。 5.5引物和探针：见附录 A。 5.6内标质粒：参见附录 B。 6主要仪器和设备 6.1恒温水浴锅或加热套装置：100。 6.2恒温培养箱：36 1，30 1。 6.3离心机：最大转速 13 000 r/ min 以上。 6.4天平：感量 0.1 g。 6.5冰箱：-20 4。 6.6均质器。 6.7可调移液器：1 nullL-1000 nullL。 6.8荧光 PCR 仪。 7检验程序 食品中单核细胞增生李斯特菌的扩增内标荧光 PCR 检测流程见图 1。 图 1 食品中单核细胞增生李斯特
8、菌检验程序 以正式出版文本为准 3 SN/T 5224 2019 8操作步骤 8.1 样品制备、增菌培养 按照 GB 4789.302016 中第一法进行样品制备和增菌（两次增菌）。 8.2 细菌模板 DNA 的制备 取 8.1 中培养的二次增菌液 1 mL，加到 1.5 mL 无菌离心管中，8 000 r / min 离心 5 min，吸弃上 清液；加入 50 L DNA 提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴 10 min，置 冰上 10 min ；12000 r / min 离心 5 min，取上清保存于 -20备用以待检测。 也可采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒
9、并按其说明制备模板 DNA。 8.3 荧光 PCR 检测 8.3.1 荧光 PCR 反应体系 荧光PCR反应所用引物和探针见附录A，PCR反应体系见表1。也可采用商品化的PCR扩增体系。 每个 DNA 样品做 2 个平行管。加样时应使样品 DNA 溶液完全落入反应液中，不要粘附于壁上，加样 后尽快盖紧管盖。 表 1 PCR 反应体系 组分 工作液浓度 加样量 L 终浓度 10PCR 缓冲液 - 2 - dNTP Mixture（10 mmol / L） 10 mol / L 1.6 - 引物（上游） 10 mol / L 0.4 200 nmol / L 引物（下游） 10 mol / L 0
10、.4 200 nmol / L 单核细胞增生李斯特菌探 针 10 mol / L 0.6 300 nmol / L 内标质粒探针 10 mol / L 0.6 300 nmol / L Taq DNA 聚合酶 5 U / uL 0.4 0.1 U/ uL DNA 模板 - 1 - 内标质粒 1 去离子水 - 补至 20 - 8.3.2 阳性对照、阴性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照采用含有检测序列的DNA（或质粒） 和 IAC 片段同时作为荧光 PCR 反应的模板，阴性对照采用含 IAC 片段的质粒作为荧光 PCR 反应的模 板，空白对照用无菌水作为荧
11、光 PCR 反应的模板。 8.3.3 荧光 PCR 反应程序 荧光 PCR 反应循环参数为 95 4 min ； 95 5 s，65 20 s，45 个循环。信号采集设为 FAM、 HEX 荧光素（FAM 荧光素代表样品中单核细胞增生李斯特菌信号，HEX 荧光素代表扩增内标信号）。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5224 2019 注：因不同 PCR 仪的性能差异，可通过条件优化适当调整 PCR 循环的退火温度及时间。 9荧光阈值的确定 PCR 反应完成后应设定荧光阈值以分析样品的 Ct 值，以 PCR 反应的前 3 个 15 个循环的荧光信 号作为基线信号（噪音），荧光阈值理论上定义为基
12、线信号的标准偏差的 10 倍，在实际应用中可以根 据仪器基线信号进行人工调整，设定原则是以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线（无规则的 噪音线）的最高点，且不出现 Ct 值为准。 10结果及判断 10.1质控标准 质控标准如下： 空白对照：FAM 荧光素和 HEX 荧光素均无扩增曲线，C t 40.0 ； 阴性对照：FAM 荧光素无扩增曲线，C t 40.0 ；HEX 荧光素出现典型的扩增曲线，C t 值应 35.0 ； 阳性对照：FAM 荧光素出现典型的扩增曲线，C t 值应 35.0，而 40，建议样本重做，再次扩增后的结果 Ct 值如果仍小于 40，并有 典型的扩增曲线，且对照结果均
13、正常，则可判定该基因为阳性。 对于阳性结果，应对样品的二次增菌液或可疑纯菌落进一步按 GB 4789.30 中第一法操作步骤进 行确认后报告结果。 11生物安全和防污染措施 11.1生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行操作，所有培养物和废弃物应参照 GB 19489 中的有关规定。 11.2防污染措施 防污染措施应符合 GB/ T 27403 的规定。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5224 2019 附 录 A （规范性附录） 荧光 PCR 所用引物和探针 A.1 单核细胞增生李斯特菌检测所用引物、探针和内标序列检测探针见表 A.1，单核细胞增生李 斯特菌探
14、针 5 端为 FAM 标记，3 端为 ECLIPCE 标记，内标序列探针 5 端为 HEX 标记，3 端为 ECLIPCE 标记。 表 A.1 单核细胞增生李斯特菌检测所用引物和探针 单核细胞增生李斯特菌引物 上游引物：5-CATGGCACCACCAGCATC-3 下游引物：5-CATCCGCGTGTTTCTTTTCG-3 单核细胞增生李斯特菌探针 5-FAM-CCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAECLIPCE-3 内标探针 5-HEX-ATAGGAGCACTCGCCGCCCACATCECLIPCE-3 以正式出版文本为准 6 SN/T 5224 2019 附 录 B （资料性附录
15、） 内标质粒的制备 B.1 备样 人工合成一段 65 bp 的 IAC 序列（5-CATGGCACCACCAGCATCTATAGGAGCACTCGCCGCCCACA TCATCGAAAAGAAACACGCGGATG-3），将此片段连接至 pMD 19-T、pMD 18-T 等质粒载体上备用。 具体制备过程如下。 B.2 扩增内标序列与载体连接 取 3 l 合成 IAC 片段与 pMD 19-T、pMD 18-T 等质粒载体（T/A-type PCR cloning vector）在 0.5 ml 离心管中进行连接，反应体系为： Ligation Solution I 5 L pMD18-T 载
16、体（30 ng/ l） 1 L PCR 产物 3 L H 2 O 1 L 总体积 10 L 16水浴 8 h，将连接后的质粒转化感受态大肠杆菌。 B.3 感受态细胞的制备 B.3.1 以无菌接种环取保存的 E.coli TG1 菌株于 LB 琼脂平板划线，37培养。 B.3.2 挑取LB琼脂平板上的大肠杆菌TG1单菌落，接入5 mL LB液体培养基中，37摇床培养12 h。 B.3.3 按 1% 接种量将大肠杆菌过夜培养物转接入 50 mL LB 中，37摇床培养至 OD600 值约为 0.6， 置于冰中冷却 10 min。 B.3.4 在4，6000 r/ min条件下离心5 min，倒去上
17、清液，将细胞重悬于预冷的10 mL 0.1M CaCl 2 中， 在冰上放置 20 min 以上。 B.3.5 在 4，6000 r/ min 条件下离心 5 min，去上清，细胞重新悬浮于 2 mL 预冷的含有 15% 甘油 的 0.1 M CaCl 2 中，分装成 100 L 的小份，于 70保存或直接用于转化。 B.4 连接产物的转化 制备抗性平皿，在装有约 100 L 感受态细胞的 1.5 mL 离心管中加入连接产物 10 L，轻轻混匀 于冰上放置 30 min 后，42水浴中热击 90 s，热击后迅速置于冰上冷却 2 min。向管中加入 400 L LB 液。体培养基（不含 Amp）
18、，37 200 r/ min -220 r/ min 振荡培养 1 h, 取 100 L 菌液涂布合适的抗性 平板，37培养 16 h -18 h，观察单菌落的出现。如进行蓝 / 白斑筛选，则于转化前约 2 h 在 LB 平板 上避光涂布 40 L X-gal（20 mg/ mL）和 80 L IPTG （10 mg/ mL），正放平皿于 37温箱中，使 X-gal 和 IPTG 充分吸入琼脂中，然后如上用菌液涂布平板。 B.5 阳性转化子的筛选 用灭过菌的牙签挑取转化的单菌落，点种于相应的氨苄抗性平板后将牙签上菌体加入含 PCR 反 以正式出版文本为准 7 SN/T 5224 2019 应液
19、的 PCR 管中并编号，经相应检测引物的 PCR 扩增后，在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结 果在氨苄抗性平板相应编号处挑选所需的阳性克隆，并进行进一步的测序验证。 B.6 质粒的提取 挑取平板上经 PCR 筛选为阳性克隆的单菌落，接种 50 mL 含氨苄青霉素的 LB 培养液内，37 180 r/ min 振荡培养过夜后提取菌液质粒。 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 20 千字 2019 年 月第一版 2019 年 月第一次印刷 印数 1500 书号： 1551752 定价 16.00 元 出口食品中单核细胞增生 李斯特菌检验方法 实时荧光 PCR 内标法 行 业 标 准 SN/T 52242019 SN/T 52242019 * * * 网址 SN/T 5224 2019
