1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5203 2020 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 65. 150 CCS C 50 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 鱼类物种鉴定基因条形码的检测 技术规范 Identification of fish species null Technical specification based on DNA barcoding 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5203 2020 前 言 本文件按照 GB/T 1.12020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
2、本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳海关、深圳华大海洋研究 院、深圳市农产品质量安全检验检测中心。 本文件主要起草人：郑晓聪、王敏、温智清、阚式绂、刘荭、石琼、何俊强、黄玉、于力、王 津津、刘莹、贾鹏、史秀杰、兰文升、秦智锋。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5203 2020 鱼类物种鉴定基因条形码的检测技术规范 1范围 本标文件定了鱼类基因条形码鉴定中的样品处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定 等操作程序和规范。 本文件适用于对自然环境种化产生的野生型鱼类或其残存的组织进行物种鉴定 , 不适合杂交选育 的品种。 2规范性引用文件 下列文
3、件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 基因条形码DNA barcoding 可用于物种鉴定的具有生物物种序列特征的 DNA 片段，本标准中专指鱼类线粒体基因组中 COI 基因 658 bp 的标准片段。 3.2 基因条形码鉴定技术DNA barcoding identification technique 一种利用基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系
4、研究的技术，建立在基因扩增和序列比对 的基础之上，它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家 的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。 3.3 序列相似度similarity of the sequences 反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。 3.4 FASTA 格式FASTA format 生物信息学术语，又称 Pearson 格式，是一种用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核 苷酸或者氨基酸碱基用单个字母表示，序列的第一行一般用“”起始，随后可以添加序列名或者注 释，第二行为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或
5、者氨基酸编码符号，如核苷酸使用 ATCG 表示， 序列中不能出现回车等字符。 示例： GTGTGTGGGTATGATTCTAAACTGACAAATCGCGCCTATTTATACTTTTTCCCCGGGGTTTAAATTCCTTGGCCCCCAT GTGGTTTCTTTAATTTTAGATTGTGGAACCCATTTTCTTAATCCGTAATCG 以正式出版文本为准 2 SN/T 5203 2020 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BOLD ：生物条形码数据系统（barcoding of life datasystem）。 5试剂和材料 5.1水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。
6、 5.2醋酸铵，分析纯。 5.3乙醇，分析纯。 5.4异丙醇，分析纯。 5.5蛋白酶 K，分析纯。 5.6 高保真 DNA 聚合酶、dNTPs （含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、MgSO 4 、PCR 缓冲液（不含 Mg 2+ ） 和溴酚蓝等试剂，可选用专业试剂公司提供的商品化试剂。 5.7 引物：用去离子水将每条引物配制成 100 mol/L 储存液，置 -20 以下冻存；使用时取适量配制 成 10 mol/L 工作液，避免多次冻融。序列见表 1。 表 1引物和序列 引物 名称 5-3 备注 上游引物 FishF2t1 TGTAAAACGACGGCCAGTCGACTAATCAT
7、AAAGATATCGGCAC 其中下划线部分为通用 测序引物 M13F（ -20） VF2t1 TGTAAAACGACGGCCAGTCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC 下游引物 FishR2t1 CAGGAAACAGCTATGACACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA 其中下划线部分为通用 测序引物 M13R（ -27） FR1dt1 CAGGAAACAGCTATGACACCTCAGGGTGTCCGAARAAYCARAA 扩增线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基（ CO ）基因约 700 bp 片段。 5.8标准分子量：推荐使用 100 bp DNA marker。 5
8、.9琼脂糖，分析纯。 6器材与设备 台式离心机、各量程可调移液器、可调式恒温浴、微量核酸蛋白测定仪、超净工作台、PCR 扩 增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。 7取样 样品包括活鱼、鱼卵、鲜冻的肉块、单一鱼类制作的肉糜等。宜取鲜活的组织，成鱼优先选取肌 肉组织（心、脑、脾、肾、肝、肠、胃等器官也适用），鱼卵取卵膜。如需非致死性取样，剪取部分 鳍条或者刮去部分皮肤后取皮下一小块 3 mm 3 5 mm 3 的肌肉块即可。 采集的组织置于冰上低温保存备用，如需长期保存，应置于 -20 冷冻或置于 75% 乙醇中固定 保存。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5203 2020 8实验步骤 8.1设
9、立对照 设置空白对照、阴性对照和阳性对照。用已知含鱼类成分的样品作阳性对照，用已知不含鱼类成 分的样品作阴性对照，用等体积的去离子水代替模板 DNA 作空白对照。 8.2DNA 提取 取 20 mg 样品组织剪碎置于洁净 1.5 mL 离心管中，加入 600 L 裂解液（见附录 A 中 A.1）和 20 L 蛋白酶 K 溶液（见附录 A 中 A.2），混匀，于 56 水浴 1 h3 h，期间不时轻微振动混匀；待组 织消化完全，冷却至室温，加入 200 L 醋酸铵溶液（见附录 A 中 A.3），混匀，冰上放置或 4 冷却 5 min10 min，使蛋白质盐析出来；于 4 ，12 000 g 离心
10、10 min，将上清液转移至另一洁净的 1.5 mL 离心管中，于 4 ，12 000 g 离心 10 min，取上清液至另一个洁净 1.5 mL 离心管中，加等体积 异丙醇，轻轻摇匀，4 放置 15 min ；4 ，12 000 g 离心 10 min 沉淀 DNA ；弃上清，加 1 mL 75% 乙醇，轻轻混匀，于 4 ，12 000 r/min 离心 5 min，弃上清，晾干；干燥后加入 50 L 去离子水溶解； DNA 提取液应置于冰上备用，若需长期保存应置于 -20 保存。 也可采用经验证可靠的 DNA 提取纯化试剂盒进行核酸提取，参照说明书使用。 8.3DNA 浓度和纯度的测定 吸
11、取 DNA 提取液 2 L，以去离子水作为空白对照，使用 NanoDrop微量核酸蛋白测定仪测定 DNA 模板的质量浓度及 A 260 /A 280 。DNA 的质量浓度根据式（1）计算： DNA 的质量浓度 = A 260 50 稀释倍数（ng/ L） （1） 提取的 DNA 浓度要求大于等于 5 ng/ L，A 260 /A 280 的比值在 1.7 1.9 之间。 8.4PCR 扩增 在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 2 配制反应体系， 加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳 性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。 表 2PCR 反应体系 组分 加样量 / L 含量 /
12、 浓度 10PCR 缓冲液（不含 Mg 2+ ） 5 1 MgCl 2 （25 mmol/L） 5 2.5 mmol/L dNTPs（10 mmol/L each） 1 0.2 mmol/L FishF2t1（10 mol/L） 0.5 0.1 mol/L VF2t1（10 mol/L） 0.5 0.1 mol/L FishR2t1（10 mol/L） 0.5 0.1 mol/L FR1dt1（10 mol/L） 0.5 0.1 mol/L 高保真 DNA 聚合酶（5 U/ L） 0.5 0.05 U/l 模板 / 对照 1 50 ng 500 ng 去离子水 35.5 加至 50 L 将已加
13、样的 PCR 反应管短暂离心后放入 PCR 仪，扩增反应条件设定： 94 预变性 2 min ；94 变性 30 s, 50 退火 30 s, 72 延伸 45 s, 30 个循环；72 7 min ；4 保存。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5203 2020 8.5琼脂糖电泳 用新鲜配制的 1TAE 电泳缓冲液（见附录 A 中 A.4）配制含 1 g/mL 溴化乙锭（见附录 A 中 A.5） 的 2% 琼脂糖凝胶。取适量扩增产物和溴酚蓝指示剂按比例混匀后进行电泳检测，设 DNA Marker 同 步电泳；采用 5 V/cm8 V/cm，电泳 1 h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记
14、录结果。 8.6电泳结果 当阳性对照扩增片段大小为 700 bp、阴性对照和空白对照没有扩增片段时，结果成立。此时，若 待测样品出现 700 bp 扩增片段则判断该样品 PCR 扩增结果阳性，无扩增片段或者片段大小不符则判 断为 PCR 扩增结果阴性（参见附录 B）。 8.7序列测定 将 PCR 扩增结果阳性产物进行序列测定，测序引物使用通用引物 M13F（-20）和 M13R（-27）。 需要时可先进行 PCR 产物的纯化或克隆（参见附录 C）。 8.8序列有效性分析 通过查看序列的原始峰图，有效序列段峰高、基部杂峰少且低的序列（见附录 D 中 D.1）且长度 大于 500 bp 为有效序列
15、。将符合要求的序列进行拼接，去除引物片段后应能得到一个具有完整开放 阅读框的拼接序列，并可翻译成一条完整的蛋白质序列；否则序列仅供参考（见附录 D 中 D.2）。 8.9序列比对鉴定 与 BOLD 系统的序列进行比对，具体操作按照附录 E 进行。 9结果判断 9.1根据序列的相似度判定鱼类的种类，相似度最高且大于 98.0者，可判定为同一种类。 9.2若相似度大于 98.0时系统给出两个或以上的物种，需参考形态学特征进行综合判断。 9.3序列相似度小于等于 98.0者，不能进行种类的判断。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5203 2020 附录A （规范性） 试 剂 配 制 A.1裂解液
16、1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0） 1 mL 0.5 mol/L EDTA 1 mL 0.5 mol/L NaCl 20 mL 10% SDS 10 mL 加去离子水定容至 100 mL。 A.2蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL） 将 200 mg 蛋白酶 K 加入 9.5 mL 水中，轻轻摇动，直至蛋白酶 K 完全溶解。不应涡旋混合。加去 离子水定容到 10 mL，然后分装成小份，置于 -20 保存。 A.3醋酸铵溶液（7.5 mol/L） 称取 578.12 g 醋酸铵，加去离子水定容到 1 L。 A.41TAE 电泳缓冲液 称取 242 g Tris 和 37.2 g N
17、a 2 EDTA2H 2 O 加 800 mL 去离子水充分搅拌溶解后，加入 57.1 mL 醋酸， 加去离子水定容至 1 L，即为 50TAE 电泳缓冲液，灭菌后室温保存。使用时用去离子水稀释 50 倍 即得 1TAE 电泳缓冲液。 A.5溴化乙锭 用去离子水配制成 10 mg/mL 的浓缩液。用时每 100 mL 琼脂糖凝胶中加 10 L。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5203 2020 附录B （资料性） PCR 产物凝胶电泳示意图 PCR 产物凝胶电泳示意图见图 B.1。 说明： M DNA 分子量标准； 1 阳性对照； 2 阴性对照； 3 空白对照； 4 目的片段。 图 B.1
18、PCR 产物凝胶电泳示意图 以正式出版文本为准 7 SN/T 5203 2020 附录C （资料性） PCR 产物克隆步骤 C.1PCR 产物的连接 将 DNA 产物纯化后 50 ng 用连接酶连接到 50 ng 载体中。具体操作方法参考连接酶说明书。 C.2转化平板的制备 向铺好的含有 100 g/mL 相应抗生素的 LB 固体培养基表面加入 L 的 IPTG（异丙基硫代半乳 糖苷，50 mg/mL）和 20 L的X -Gal（5 -溴 -4-氯 -3-吲哚 - -D-半乳糖苷，20 mg/mL），使用灭菌的涂布 棒将其均匀涂布，避光置于 37 放置 1 h3 h，使溶解 X -Gal 的二
19、甲基甲酰胺尽量挥发干净。 C.3转化 将感受态细胞从 -80 冰箱取出放于冰上，取 10 L 连接产物加入 100 L 刚刚解冻的感受态细 胞中。轻弹混匀，冰浴 30 min，置于 42 水浴 90 s，取出后立即置于冰浴中放置 2 min3 min，期 间不要摇动离心管。向离心管中加入 500 L 37 预热的培养基（不含抗生素），150 r/min、37 振 荡培养 45 min。将离心管中的菌液混匀，加到已制备好的转化平板中，用无菌的涂布棒轻轻地将细胞 均匀涂布。待平板表面干燥后，倒置平板，37 培养 12 h16 h。 C.4挑取阳性克隆 过夜培养生长出的白色菌落根据载体特性选择 PC
20、R 或酶切方法鉴定插入片段是否正确。挑取阳 性克隆，用mL LB 液体培养基（含有 100 g/mL 相应抗生素），37 过夜培养后提取质粒，送测序 公司进行测序。 C.5阳性转化子的保存 将经序列比对分析确定无污染的阳性克隆重组菌落（转化子）保存于终浓度为 1520的甘 油中，置于 -80 冷冻保存。 以正式出版文本为准 8 SN/T 5203 2020 D D 附录D （规范性） 序列的有效性判定 D.1通过原始峰图判断 如图 D.1 所示，段峰高、基部杂峰少且低的序列，且长度大于 500 bp 为有效序列。 图 D.1原始峰图 D.2通过翻译成氨基酸判断 D.2.1登录网站 http:/
21、www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_transeq，序列输入窗口截图见图 D.2。 D.2.2 将序列复制至图D.2 S TEP 1中的空格处， STEP 2中的 FRAME 栏中选择“6（All six frames）”， CODON TABLE 栏中选择“Vertebrate Mitochondrial”，点击 Submit，得到图 D.3 所示画面。 D.2.3 给出的六条氨基酸序列中，只要有一条没有星号，就表明可以得到一条具有完整开放阅读框的 拼接序列，并能翻译成完整的蛋白质，即可判定为有效序列；否则序列仅供参考。 以正式出版文本为准 9 SN/T 5203 2
22、020 图 D.2序列输入窗口示意图 图 D.3输出的翻译蛋白质序列窗口示意图 以正式出版文本为准 10 SN/T 5203 2020 附录E （规范性） 基因条形码在 BOLD 系统中物种鉴定流程示意图 E.1鉴定流程 E.1.1登录网站 http:/www.boldsystems.org/，进入图 E.1 所示画面。 图 E.1BOLD 登陆窗口示意图 E.1.2点击 IDENTIFICATION 进入图 E.2 所示画面。 图 E.2序列输入窗口示意图 以正式出版文本为准 SN/T 5203 2020 E.1.3 将有效的序列以 Fasta 格式黏贴在图 E.2 的空格内，点击 SUBM
23、IT。注意 BOLD 网站不会 自动进行反向互补序列比对，当序列无匹配项时，需要把序列反向互补后进行比对。得到图 E.3 所示 报告。 图 E.3BOLD 系统 BLAST 比对呈现结果 E.2结果判定 序列相似度最高且大于 98.0者，鉴定为查询结果所示种类；若相似度大于 98.0时系统给出两 个或以上的物种，需参考形态学特征进行综合判断；序列相似度小于等 98.0者，不作为结论进行 种类判断。 以正式出版文本为准 SN/T 5203 2020 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 1 字数 28 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：155175109 定价 18.00 元 鱼类物种鉴定基因条形码的检测 技术规范 行 业 标 准 SN/T 52032020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
