1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5281 2020 禽坦布苏病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for avian Tembusu virus infection 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 ICS 1.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 24 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：1551752 定价 16.00元 禽坦布苏病毒病检疫
2、技术规范 行 业 标 准 SN/T52812020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242 -7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址 以正式出版文本为准 SN/T 5281 2020 I 前 言 本文件是根据 GB/T 1.12020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农科院畜牧兽医研究所、中华人民共和国 南京海关、东莞市中鼎检测技术有限公司、厦门市翰均科检测科技有限公司、中华人民共和国青岛 海关。 本文件主要起草人：郑腾、
3、万春和、王凯民、张体银、黄瑜、林杰、程龙飞、张险朋、傅光华、 曹维强、施少华、张志灯、陈红梅、王武军、傅秋玲、陈美传、陈国强、白泉阳、李宋钰、徐彪、 徐超。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5281 2020 禽坦布苏病毒病检疫技术规范 1 范围 本文件规定禽坦布苏病毒病的临床诊断和反转录 - 聚合酶链式反应鉴定技术。 本文件适用于禽坦布苏病毒病的临床诊断和实验室检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件
4、。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。以下缩略语适用于本文件。 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（Reverse transcriptionpolymerasechainreaction） DEPC 焦碳酸二乙酯（Diethy pyrocarbonate） DNA 脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（Ethidium bromide） PBS 磷酸盐缓冲液（Phosphate bufferedsa
5、line） RNA 核糖核酸（Ribonucleic acid） TAE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl aminomethane-boricacid- ethylenediaminetetraaceticacid） 4 临床诊断 4.1 发病症状 当禽（尤其是种禽、蛋禽）出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：体温急剧 升高，采食量骤降；双脚无力，共济失调或（和）双翅下垂；产蛋率骤降；种禽、蛋禽还会出现开产 种（蛋）禽产蛋率上升慢，持续低产蛋率，无产蛋高峰或（和）产蛋率时高时低，后备种（蛋）禽开 产推迟或（和）产蛋不整齐。 4.2
6、病理变化 当禽（尤其是蛋禽）出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一：种禽、蛋禽卵巢（卵 泡）出血；种禽、蛋禽卵泡内卵黄液化，卵泡变形；种禽、蛋禽腹腔内积有淡红色血水或淡黄色浑浊 液体；种禽、蛋禽卵巢（卵泡）萎缩，卵泡数量减少。肉禽肝脏局灶性出血或（和）脑组织轻度出血。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5281 2020 4.3 临床诊断 当禽（包括后备种禽、蛋禽）出现以上病症，结合剖检病变，可初步诊断为疑似禽坦布苏病毒病， 需要进一步进行实验室确诊。 5 样品采集 根据临床症状和剖检病理变化情况，无菌采集疑似发病的禽、濒死禽或死亡禽（尤其是种禽、蛋 禽）的卵巢、肝脏样品，采集的样品
7、在冷藏条件下 24 h 内送达实验室检测。 6 实验室诊断 6.1 设备 6.1.1 组织匀浆器。 6.1.2 高速台式冷冻离心机。 6.1.3 微量移液器。 6.1.4 PCR 仪。 6.1.5 电泳仪。 6.1.6 电泳槽。 6.1.7 紫外凝胶成像系统。 6.2 试剂 6.2.1 水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。 6.2.2 磷酸盐缓冲液（PBS），配制方法见附录 A.1。 6.2.3 RNA 提取试剂 Trizol。 6.2.4 三氯甲烷。 6.2.5 异丙醇。 6.2.6 DEPC 水，配制方法见附录 A.2。 6.2.7 75% 乙醇，配制方法见附录 A.3。
8、6.2.8 反转录酶。 6.2.9 TaqDNA 聚合酶。 6.2.10 RNA 酶抑制剂。 6.2.11 脱氧核苷酸三磷酸 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。 6.2.12 引物（Primer）：20 moL/L。根据禽坦布苏病毒的非结构蛋白 NS5 基因保守区序列设计，扩 增长度为 469 bp，序列中含有简并碱基 Y =C/T。 上游引物 F ：5 null CTAYCAYGGAAGYTACGAAGT-3null 下游引物 R ：5 null CTTTTCTCGCTTYCCCATCAT-3null 6.2.13 溴化乙锭溶液，配制方法见附录 A.4。 6.2.14
9、 1TAE 缓冲液，配制方法见附录 A.5。 6.2.15 1.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A.6。 6.2.16 10 加样缓冲液，配制方法见附录 A.7。 6.2.17 DNA 相对分子质量标准物 DL 2000DNAMarker。 6.2.18 DNA 纯化回收试剂盒。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5281 2020 6.3 样品处理 将采集的样品或组织经剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液按照体积比 1 ：4 的比例制成组织匀浆液， 反复冻融 3 次，8 000r/min 离心 30 min，取上清液冻存分装备用。 6.4 RNA 提取 6.4.1 以灭活的禽坦布苏病毒为阳性对照；以其
10、他灭活禽源 RNA 病毒（如鸭型肝炎病毒）为阴性 对照；以 DEPC 水为空白对照。对照样品与待检样品同步操作进行提取 RNA。 6.4.2 在经 DEPC 水处理的 1.5 mL 灭菌离心管中，分别加入 250 L 组织匀浆上清液或对照样品，再 加入 750 LRNA 提取试剂 Trizol，充分混匀 15 s。加入 200 L 预冷的三氯甲烷，充分混匀，室温静 置 10 min。 6.4.3 4下 12 000r/min 离心 15 min 后，小心吸取上清液 600 L，加入经 DEPC 水处理的 1.5 mL 灭 菌离心管中，再加入 600 L经 -20预冷的异丙醇，颠倒混匀。 6.4
11、.4 4下12 000r/min离心15 min后，轻轻倾倒掉上清液，分别加入800 L的75%乙醇清洗2次， 倒置于吸水纸上 5 min，室温晾干。 6.4.5 加入 20 LDEPC 水，轻轻混匀，溶解离心管壁上的 RNA，2 000r/min 离心 30 s。提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT -PCR 扩增或保存于 -20冰箱备用。 6.4.6 RNA 的提取也可采用市售等效的商品化核酸 RNA 提取试剂盒，按照说明书的要求进行操作。 6.5 RT-PCR 扩增 6.5.1 RT-PCR 反应体系为 50 L，每个反应管依次加入 20 LDEPC 水、5 L 的 10One S
12、tepRNA PCRBuffer、10 L 的 MgCl2 ( 浓度为 25 mol/L)、5 L 的 dNTP Mixture( 浓度为 10 mol/L)、1 L 的 RNA 酶抑制剂 ( 浓度为 40 U/L)、1 L 的反转录酶 AMV ( 浓度为 5 U/L)、1 L 的 Taq 酶 ( 浓度为 5 U/L)、 1L 的上游引物 F ( 浓度为 20 moL/L)、1 L 的下游引物 R ( 浓度为 20 moL/L)、5 L 提取核酸 RNA。 混匀后 2 000r/min 离心 15 s，使反应混合液都沉降到管底。 6.5.2 将上述反应混合液按照以下步骤进行一步法 RT -PC
13、R 扩增：第一步是反转录，42 反转录 30 min ； 第二步 PCR 循环，94 预变性 5 min 后进入 PCR 循环，循环参数为 94 变性 50 s、54 退火 30s、72 延伸 35 s，循环 30 次；第三步 72 延伸 7 min。 6.5.3 RT-PCR 的扩增也可采用等效的市售商品化的 RT -PCR 检测试剂盒，按照说明书的要求进行 操作。 6.6 琼脂糖凝胶电泳 用 1TAE 电泳缓冲液配制 1.0% 的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹 没胶面。将 5 LRT-PCR 产物与 0.5 L10 加样缓冲液混合混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA
14、 相对分子质量标准物 DL 2000DNAMarker 作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h 后在凝胶成像分析系统观察 结果。 6.7 测序 用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约 469 bp 的 DNA 片段，应对其切胶回收后进行测序，测序结果和参考序列进行核苷酸同源性比较。 6.8 结果判定 经核酸扩增电泳后，阳性对照会出现一条大小约 469 bp 特异性条带（参见附录 B.1 中 2 号泳道）， 以正式出版文本为准 4 SN/T 5281 2020 而阴性对照和空白对照均没有该扩增条带（参见附录 B.1 中 3 号和 4 号泳道）。待检样品经核酸
15、扩增 电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证，测序结果和参考序列（参见附录 C.1）的核苷 酸同源性在 95% 以上方可判为阳性。无条带或条带的大小不是约 469 bp 或有约 469 bp 条带但测序结 果和参考序列的核苷酸同源性在 95% 以下的为阴性。 7 综合判定 7.1 经 RT -PCR 扩增出 469 bp 片段并经测序判为阳性，且存在相应的发病症状和病理变化，可确诊 为禽坦布苏病毒病。 7.2 经 RT -PCR 扩增出 469 bp 片段并经测序判为阳性，无相应的发病症状和病理变化，可确诊为禽 坦布苏病毒感染。 以正式出版文本为准 5 SN/T 5281 2020 附
16、 录 A （规范性） 试剂的配制 A.1 0.01 mol/L PBS 的配制 NaCl 8.0g KCl 0.2g Na 2 HPO 4 12H 2 O 2.9g KH 2 PO 4 0.2g 将上述试剂溶于 800 mL 水中，定容至 1 000mL，121 高压灭菌 30 min，4 保存备用。 A.2 DEPC 水的配制 按 0.1% 的浓度在水中加入 DEPC，室温静置过夜，121 高压灭菌 30 min，冷却备用。 A.3 75% 乙醇的配制 750 mL 的无水乙醇加入 250 mL 水中， -20保存备用。 A.4 EB 溶液的配制 20 mg 的溴化乙锭加入 20 mL 水中
17、。 A.5 1TAE 电泳缓冲液的配制 A.5.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液 （pH 8.0）的配制 二水乙二铵四乙酸二钠 18.61g 氢氧化钠 调 pH 至 8.0 加水至 100 mL。 A.5.2 50TAE 电泳缓冲液的配制 羟基甲基氨基甲烷（Tris） 242g 冰乙酸 57.1mL 0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0） 100mL 加水至 1 000mL，使用时用水稀释 50 倍。 A.5.3 1TAE 电泳缓冲液的配制 50TAE 电泳缓冲液 20mL 加水至 1 000mL。 以正式出版文本为准 6 SN/T 5281 2020 A
18、.6 1.0% 琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖 1.0g 加入 1TAE 电泳缓冲液至 100 mL。 置微波炉中加热至完全融化，待冷至 50 60 时，加溴化乙锭（EB）溶液 5 nullL，摇匀后倒 入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。 A.7 10 加样缓冲液 聚蔗糖 25g 溴酚蓝 0.1g 二甲苯青 0.1g 加水至 100 mL。 以正式出版文本为准 SN/T 5281 2020 附 录 B （资料性） 电泳图 B.1 禽坦布苏病毒 RT -PCR 检测结果电泳图（GenBank 序列号：KP096415.1） 图 B.1 禽坦布苏病毒 RT -PCR 检测结果电泳图 1DNA 相
19、对分子质量标准物 DL 2000DNAMarker ；2阳对照； 3阴性对照；4空白对照；5阳性样品；6阴性样品。 以正式出版文本为准 SN/T 5281 2020 附 录 C （资料性） 参考序列 C.1 禽坦布苏病毒非结构蛋白 NS5 基因保守区序列（GenBank: KP096415.1） CTATCATGGAAGCTACGAAGTGAAAGCCACAGGCTCAGCCAGCTCAATGGTTAATGGGGTAGTTAG GATACTGTCAAAACCTTGGGACACCTTGCAAAACGTGGTGAATATGGCCATGACGGACACCACTCCTTTT GGGCAACAGCGCG
20、TTTTTAAAGAAAAGGTTGATACTAAAGCCCCAGAACCACCTGCAGGAACAGCTAGG GTCATGAACATCGTGGCAAGATGGATGTGGAACTTTGTTGGCAGAAACAAACAACCGAGGATGTGTACA AAAGAAGAGTTCATAGAAAAGGTGAATAGTAACGCAGCCCTGGGGGCCATGTTTGAGGAGCAACACAA ATGGGCCAGCGCCAGGGAAGCGGTTGAGGATCCTGAGTTTTGGAGTCTTGTTGACAGAGAGAGAGAACT GCACCTGCAAGGGAAGTGTGAGACCTGCATTTACAACATGATGGGAAAGCGAGAAAAG 书号：1551753 定价： 14.00元
