1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 中华人民共和国海关总署发 布 ICS 65.020.30 B 43 2020-12-30 发布 2021-07-01 实施 梅花鹿物种鉴定技术规范 实时荧光 PCR 法 Protocol for species identification of Cervus Nippon Real-time PCR method SN/T 5202 2020 代替 SN/T 3011.12011 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 I SN/T 5202 2020 前 言 本文件根据 GB/T 1.12020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国
2、海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国长春海关。 本文件主要起草人：刘韬、刘婧、五准、王玮琳、刘金华、曲辉、彭博、高明。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5202 2020 梅花鹿物种鉴定技术规范实时荧光 PCR 法 1范围 本文件规定了梅花鹿物种鉴定实时荧光 PCR 方法。 本文件适用于梅花鹿源性产品（梅花鹿茸、梅花鹿血、梅花鹿胎盘、梅花鹿托等非深加工产品） 的定性检测。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单
3、）适 用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 Ct 值 clycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于文件。 PCR ：链式聚合反应（polymerase chain reaction）。 DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）。 dNTP ：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）。 CTAB ：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium ammonium
4、bromide）。 Tris ：三羟甲基氨基甲烷（ tris-( hydroxymethyl)-aminometha）。 EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）。 Taq ：水生栖热菌（thermusaquaticus）。 UNG ：尿嘧啶 -N- 糖基化酶（uracil-N-glycosylase）。 OD ：光密度值（optical density）。 ddH 2 O ：双蒸水（double distilled water）。 5试剂与材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB 6682 的要求。 5.1检测用引物和探
5、针 5端引物 F:5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 ； 以正式出版文本为准 2 SN/T 5202 2020 3端引物 R:5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 ； 探针 P:5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA-3 ； 梅花鹿基因扩展靶标参考序列参见附录。 5.2试剂 5.2.1CTAB 提取缓冲液：20 ng/L CTAB，0.1mol/L Tris-HCl，1.4 mol/L NaCl, 0.02 mol/L EDTA， pH 8.0 5.2.2CTAB 沉淀液：5 g/L CTAB，4
6、0 mmol/L NaCl 5.2.3蛋白酶 K 溶液（20 mg/mL） 5.2.4三氯甲烷 5.2.5异丙醇 5.2.670% 乙醇 5.2.7TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-HC(pH 8.0)，1 mmol/LEDTA(pH 8.0)。 5.2.8 荧光定量 PCR 预混液：10 L反应体系包括：1 U2 U 的 Taq 酶、1PCR 缓冲液、2.5 mmol/ L4.0 mmol/L 的 Mg 2 、0.2 U1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A，C，G)TPs、0.2 mmol/L0.4 mmol/L dUTP、400 nmol/L ROX 染料 (
7、 某些荧光 PCR 仪不需要 ROX 校正 )。如果具有等效的商品化试剂盒，则 可使用这些等效产品。 6仪器设备 6.1实时荧光 PCR 仪 6.2离心机（离心力 12 000 g） 6.3离心管（1.5 mL，2.0 mL） 6.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6.5微量移液器（2.5 L，20 L，200 L，1 000 L） 6.6研钵或粉碎装置。 6.7恒温水浴锅（10 90 ） 6.8天平（感量 0.01 g） 7检验步骤 7.1样品的 DNA 提取 称取研磨后的样品 200 mg 或 200 L 液体样品于 2.0 mL 离心管中，加入 1.5 mL CTAB 提取缓冲液 和 1
8、0 L 蛋白酶 K 溶液 ，65 30 min, 期间不时振荡混匀；13 000 g 离心 10 min，转移上清于洁净的 离心管中，加 750 L 三氯甲烷 / 异戊醇（24 ：1，V/V），混匀，13 000 g 离心 5 min，转移上清液于 洁净的离心管中；加 2 倍体积 CTAB 沉淀液，室温静止 60 min，13 000 g 离心 15 min，弃上清。加入 350 L NaCl 溶液将沉淀重悬浮。再加入 350 L 三氯甲烷，旋涡振荡进行混匀，13 000 g 离心 10 min。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5202 2020 转移上清后加入 0.6 倍体积的异丙醇用来
9、沉淀核酸，室温放置 20 min，13 000 g 离心 10 min，弃上清。 加入 500 L 70% 乙醇洗涤一次，晾干；加入 100 L TE，溶解沉淀。立即使用或 20保存备用。 也可以用等效的 DNA 提取方法提取 DNA 模版。 7.2实时荧光 PCR 检测 7.2.1扩增反应体系： 体积为 20 L ：2 荧光定量 PCR 预混液 10 L、引物对 (10 nmol/L) 各 1.0 L、模板 DNA （100 50 ng DNA）2.5 L、荧光探针（10 nmol/L）0.5 L、ddH 2 O 5.0 L。 7.2.2反应条件： 50 ，2 min ；95 ，10 min
10、 ；95 ，15 s，60 ，1 min，40 个循环。反应循环参数可根据基 因扩增仪型号的不同进行适当调整。 7.2.2反应体系中对照的设置 检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含梅花鹿或梅花鹿源性成分的样品作 阳性对照，用已知不含梅花鹿源性成分的样品作阴性对照，用等体积的 ddH 2 O 代替模板 DNA 作空白 对照。 8结果判断与表述 实时荧光 PCR 定性检验 8.1 如 Ct 值 35，阴性对照、阳性对和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中检出梅花鹿源 性成分。 8.2 如 Ct 值 40，阴性对照、阳性对和空白对照结果正常者，则可判定为该样品中未检出梅花鹿 源性
11、成分。 8.3 如 35Ct 值 40 应重做实时荧光 PCR 扩增。再次扩增的 Ct 值 40，且阴性对照、照和空 白对照结果正常，则可判定该样品中未检出梅花鹿源性成分。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5202 2020 附录A ( 资料性 ) 梅花鹿基因扩展靶标参考序列 ATGCTGACGAGGACTGATTTGACTCAATGTGCTATGTACGATAAGCAACATTATGTACTATGTACTG TAAATAATAGAAAATACATGCTTATAAGCATGGGGCATATAATATAATGTACTATTATACATAGTATGTC CTAATACATTAATTTATGTAC
12、TATTATGCATAATATGTCCTATACACCGATTTTATGTACCATTGTACATGT GTGCCTTAATGCATTAATTTTATGTACTACAAACACATAAGGTTATATCACGTGCTTTGTTGTGTAATTAG TAGGACATAAAATGTAAATTGGATGTTGAGTAGAAAGCTGTATTAAAATATTAAAATTTTTTGGAAATTT AATACTGATAAAGTTCTTGATTTTTATGGAACTATATTAATAAGCGT F 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5202 2020 中华人民共和国出入境检验检疫 开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 24 千字 2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷 印数 1500 书号：1551754 定价 21.00 元 梅花鹿物种鉴定技术规范 实时荧光 PCR 法 行 业 标 准 SN/T 52022020 * * * 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 中国海关出版社有限公司出版发行 网址
