1、以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5275 2019 象牙及其制品鉴定技术规范 Protocol of technique identification for ivory and worked ivory 2019-12-27 发布 2020-07-02 实施 ICS 11.220 B 41 中华人民共和国海关总署发 布 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 SN/T 5275 2019 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国
2、海关总署提出并归口。 本标准主要起草单位：中华人民共和国南宁海关、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国 拱北海关。 本标准主要起草人：陈立军、罗兆飞、韦莹、盘宝进、杜智欣、金煜、张利峰、刘军义、莫丽、 刘艳华、孔祥军、韦献克、覃勉、罗宝正、陈应超、刘闯、白素英、洪体玉。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准 1 SN/T 5275 2019 象牙及其制品鉴定技术规范 1范围 本标准规定了象牙及其制品形态学和分子生物学鉴定方法。 本标准适用于象牙及其制品的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 标准。凡是不注日期的引用文
3、件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 象牙 ivory 哺乳纲长鼻目象科动物特化的上门齿。 3.2 现生象牙 elephant tusk 源于亚洲象（ Elephas maximus）和非洲象（ Loxodonta africana 和 Loxodonta cyclotis）的象牙，也 称大象牙。 3.3 猛犸象牙 mammoth tusk 源于已经灭绝的象科猛犸象属（Mammuthus primigenius）的象牙。 3.4 原象牙（生象牙）raw ivory 任何形状的未经过
4、抛光及雕刻处理的象牙，包括整根象牙和任何形式的象牙及象牙切片。 3.5 象牙制品 worked ivory 已全部或部分加工（雕刻、抛光、成型等）的象牙，包括整个表面经过抛光或雕刻的整根象牙。 其中使用现生象牙制作的为现生象牙制品，使用猛犸象牙制作的为猛犸象牙制品。 3.6 牙髓腔 ivory cavity 象牙根部的空腔，沿象牙伸展方向逐渐变小。 3.7 施氏结构 Schreger structure 象牙牙本质中存在的三维结构。在象牙横截面可见自中心向外缘辐射的、规则排列的、沿顺时针 和逆时针方向延伸的弧线或近斜线构成的网状或尖角状纹理；在象牙纵剖面上可见较规则排列的、断 续近直线型纹理，
5、或起伏的波纹、山峰状纹理。 以正式出版文本为准 2 SN/T 5275 2019 3.8 施氏线（施雷格线）Schreger lines 象牙横截面上构成施氏结构的弧形线条。 3.9 施氏角 Schreger angles 沿不同方向向外延展的施氏线相交形成的夹角。其中开口朝向牙骨质层的为凸面施氏角，开口朝 向牙髓腔的为凹面施氏角，分布靠近牙骨质层的为外缘施氏角。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） Nested PCR ：巢氏聚合酶链式反应，简称巢氏 PCR（Nested polymerase chain reaction
6、） PCR ：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） 5试剂和材料 以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯，所用的水为双蒸水或去离子水，应符合 GB/T 6682 所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无 DNA 酶、无 RNA 酶水。 5.1DNA 抽提试剂盒。 5.2PCR 扩增试剂。 5.3TBE 电泳缓冲液。 5.4琼脂糖（电泳级）。 5.5乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。 5.6DNA 分子量标准品（100 bp-2000 bp）。 5.7EB 或 EB 替代核酸染液。 5.8蛋白酶 K。 5.9次氯酸钠。 5.10无水乙醇。 5.11三氯甲烷
7、。 5.12PCR 反应管：200 L。 5.13Eppendorf 离心管：1.5 mL。 5.14带滤芯吸头（10 L、20 L、200 L、1000 L ）。 6仪器和工具 6.1PCR 仪。 6.2电泳仪。 6.3凝胶成像系统。 6.4遗传分析仪。 6.5水浴锅。 6.6台式高速冷冻离心机。 6.7体视显微镜。 6.8电子天平：精度 1 mg。 以正式出版文本为准 3 SN/T 5275 2019 6.9涡旋振荡器。 6.10各类型微量移液器。 6.11冰箱。 6.12放大镜（各类型）。 6.13波长 365 nm 的紫外光灯。 6.14切割工具（电钻、电锯、钢锯、手术刀等）。 6.1
8、5酒精灯。 6.16钢针。 6.17LED 手电。 6.18防护用具（防护眼镜、防护面罩等）。 6.19Image J 软件或其他具有角度测量功能的软件。 7鉴定一般原则 7.1象牙及其制品典型形态特征完整、明确的，直接采用形态学方法进行鉴定。 7.2形态学方法无法认定，结合分子生物学方法进行综合鉴定。 8鉴定方法 8.1形态学鉴定方法 8.1.1 肉眼观察 8.1.1.1 观察颜色、外形等项目。 8.1.1.2 观察横截面、纵剖面及一些纹理特征（施氏结构）。 8.1.2 显微观察 8.1.2.1 将样本的横截面清洗干净，置于放大镜或者体视显微镜下。 8.1.2.2 用反射光观察样品的横截面和
9、纵剖面结构特征。 8.1.3 焙烤及热针试验 8.1.3.1 取待检样本，酒精灯火焰上焙烤，闻其气味。 8.1.3.2 取钢针，放在酒精灯火焰上灼烧，待针尖烧红后迅速刺入待检样品，然后趁热取出，观察 样品上热针接触点的变化，并闻其气味。 8.1.4 荧光检查 8.1.4.1 清除样本上附着的可能影响检查结果的异物。 8.1.4.2 在暗室条件下，将样本置于波长 365 nm 的紫外光下，观察样本荧光反应。 8.1.5 外缘施氏角测定 8.1.5.1 将样本手工或机械打磨光滑，使其横截面的施氏结构充分显现。 8.1.5.2 用成像设备记录样本横截面图像。 8.1.5.3将样本横截面最外缘的环形区
10、域 ( 宽度约为其半径的 1/10) 设定为鉴定区域。此区域内的所 有施氏角均视为外缘施氏角。 8.1.5.4利用作图软件将横截面图像进行 20 等分，并将鉴定区域内与等分线重合的施氏线交点标记出来。 以正式出版文本为准 4 SN/T 5275 2019 8.1.5.5在每条平分线上随机选取 2 个点，分别用来确定凸面施氏角和凹面施氏角，以保证所选不同 类型施氏角在鉴定区域内呈均匀分布。若等分线未与任何交点重合，则选取与等分线距离最近的 2 个 交点加以标记。每个样本经标记的多个交点所确定的施氏角即为鉴定对象的外缘施氏角。 8.1.5.6过标记点沿两条施氏线的延展方向向内或向外分别引出射线 (
11、 该射线应最大限度地与弧形施 氏线重合 )，构成待测外缘施氏角的两条边，利用 Image J 软件（http:/rsb.info.nih.gov/ij/download.html） 或其他具有同等功能软件的角度测量功能测得每个外缘施氏角的度量值。 8.1.6判定指标 8.1.6.1外形 整支现生象牙呈月牙或镰刀形弯曲，一端较粗（俗称根部），另一端尖细（俗称牙尖）。猛犸象牙 弯曲度大，多呈扭曲状，由于长埋地下，表层或全部呈现化石状，表层出现颜色改变及矿物质沉积， 甚至形成不规则的斑渍。 8.1.6.2颜色 一般呈牙白本色（白色、奶白色、瓷白色、淡玫瑰白色），因环境影响，可能呈淡黄色、姜黄色、 深
12、黄色、浅棕色、深褐色等。部分象牙表面有油脂光泽或蜡状光泽。 8.1.6.3气味 象牙及其制品经焙烤一般产生骨焦味。 8.1.6.4热针试验 象牙及其制品热针用力无法扎进，仅留针尖扎痕，不会出现凹陷针眼、无白烟和浓烈气味。 8.1.6.5荧光 在波长 365 nm 的紫外光下，象牙及其制品呈现蓝白或蓝紫色荧光，猛犸象牙有时会伴有紫色瑕点。 8.1.6.6横截面 象牙及其制品的横截面上可见独有的施氏结构，横截面中部（有时也会偏向一侧）可见牙心，有 的横截面可能存在类似树木年轮样的环纹结构；相较于现生象牙，猛犸牙一般有很厚的牙皮（牙骨质 层），参考附录 A.1。 8.1.6.7纵剖面 象牙及其制品的
13、纵剖面可见较规则排列的、断续的近直线型纹理，或起伏的波纹、山峰状纹理。 8.1.6.8外缘施氏角 现生象牙外缘施氏角一般为钝角（平均值大于 115 null），猛犸象牙外缘施氏角一般为锐角（平均值 小于 90 null），外缘施氏角具有物种识别意义，但在 90 null115null 区间现生象牙和猛犸象牙的外缘施氏角存 在重叠区。现生象牙和猛犸象牙外缘施氏角参考附录 A.2。 8.2分子生物学检测方法 8.2.1 样品处理和 DNA 提取 8.2.1.1样品前处理 用 10 % 的次氯酸钠或去离子水擦洗样本表面，无水乙醇冲洗后室温干燥，最后紫外灯照射样本 以正式出版文本为准 5 SN/T 5
14、275 2019 表面 30 min。 8.2.1.2样品制备 用机械设备（电钻或电锯）或手工方法于象牙根部（象牙连接头盖骨的一端）最外层牙骨质部位 获取样品碎屑约 200 mg 500 mg。如果该部位不存在或无法确定，则需从样品底部多点取样。质量 较小的样品可根据实际情况酌量取样。 8.2.1.3样品脱钙 取样品碎屑约 200 mg 于离心管中，同一样品应取 2 管，每管加入 1 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0）， 37孵育过夜（亦可室温 48 h 孵育，钙化严重的样品可延长至 72 h），12 000 g 离心 2 min，保留 1/41/3 的脱钙液与沉淀一并用
15、于 DNA 提取。 8.2.1.4提取 DNA CTAB 法（试剂配置参考附录 B）提取样品 DNA，设提取对照。8.2.1.3 中脱钙后的样品，加入 1 mL CTAB 提取缓冲液、20 L 蛋白酶 K 和 10 L RNA 酶 A，65温浴裂解 2h3 h（样品难以裂解时可以适 当延长裂解时间甚至过夜），温浴裂解时可时常将样品取出震荡加速裂解。12 000 g 离心 15 min，上清 转移至一新的离心管。加入等体积的氯仿，充分混匀，12 000 g 离心15 min，上清转移至一新的离心管。 加入 0.6 体积的异丙醇、0.1 体积乙酸钾溶液，轻柔颠倒混合，室温放置 20min。12 0
16、00 g 离心 15 min， 弃上清，加入 500 L 70% 乙醇溶液，颠倒混合数次。12 000 g 离心 10 min，弃上清，加入 50-100 L TE 缓冲液溶解 DNA。提取的 DNA 可直接用于 PCR 扩增或 -20保存备用，长期需 -70保存。 也可采用等效 DNA 抽提试剂盒提取样品 DNA，按试剂盒说明书操作。 8.2.2巢氏 PCR 检测方法 8.2.2.1巢氏 PCR 扩增引物 扩增引物见表 1。 表 1 巢式 PCR 方法所用引物序列 引物序列（5 null-3null） 扩增片段长度（bp） 第一轮 Cytb F TGAGGACAAATATCATTCTGAGG
17、GG 472 Cytb R1 GGACACCTCCTAGTTTGTTTGGT 第二轮 Cytb F TGAGGACAAATATCATTCTGAGGGG 450 Cytb R2 TACAGATCGTAGAATGGCGTAAG 8.2.2.2PCR 反应体系 PCR 反应体系（25 L）见表 2、表 3。其中将第一轮 PCR 扩增的产物用灭菌去离子水进行 10 倍 稀释，以稀释后的扩增产物作为 DNA 模板，进行巢式第二轮扩增。 表 2 巢式 PCR 反应体系（第一轮扩增） 试剂名称 加入体积（ nullL） 2PCR Master Mix 12.5 Cytb F（5 mol/L） 1 以正式出版
18、文本为准 6 SN/T 5275 2019 试剂名称 加入体积（ nullL） Cytb R1（5 mol/L） 1 样品 DNA 5 ddH2O 5.5 注 1 ：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。 注 2 ：每个反应体系应设置两个平行反应。 表 3 巢式 PCR 反应体系（第二轮扩增） 试剂名称 加入体积（ nullL） 2PCR Master Mix 12.5 Cytb F（5 mol/L） 1 Cytb R2（5 mol/L） 1 稀释后的第一轮 PCR 扩增产物 2 ddH2O 8.5 注 1 ：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行
19、适当调整。 8.2.2.3PCR 反应程序 在 PCR 仪上执行如下反应程序：95预变性 10 min ；95变性 30 s，55退火 30 s，72延伸 60 s，35 个循环；72延伸 7 min，4保存。 8.2.2.4PCR 扩增产物凝胶电泳 称取 1.5 g 琼脂糖，加入 100 mL TBE 电泳缓冲液，制备 1.5% 琼脂糖凝胶（5560左右加入 EB 或者替代核酸染液至终浓度为 0.5 g/mL）。将 5 L PCR 扩增产物和 1 L 加样缓冲液混合，进行点 样。加入 DNA 分子量标记以判断 PCR 扩增产物大小。电压大小一般控制在 3 V/cm5 V/cm，电泳时 间约
20、30 min，凝胶成像仪观察并分析保存记录。 8.2.2.5PCR 扩增产物序列分析 扩增的特异性目的片段进行序列测定，测序结果与核苷酸序列数据库（如 GenBank: https:/www. ncbi.nlm. nih. gov）中的序列进行比对（参考序列见附录 C）。 8.2.2.6结果判定 8.2.2.6.1 质控标准：阳性对照出现 472 bp 或 450 bp 特异性目的条带，且阴性对照和空白对照无目 的条带。 8.2.2.6.2 经两轮 PCR 扩增，产物电泳后均未出现目的条带，则判为阴性。 8.2.2.6.3 如果经第一轮 PCR 扩增，电泳凝胶出现一条 472 bp 的特异性目
21、的条带，且该条带序列与 数据库对应的现生象或猛犸象序列同源性大于 98.5%，判为阳性。 8.2.2.6.4 如果经第一轮 PCR 扩增未出现特异性目的条带，或特异性目的条带不满足测序要求，则 进行第二轮 PCR 扩增，如果电泳凝胶出现一条 450 bp 的特异性目的条带，且该条带序列与数据库对 应的现生象或猛犸象序列同源性大于 98.5%，判为阳性。 续表 以正式出版文本为准 7 SN/T 5275 2019 9综合判定 9.1形态学指标特征明确，具有特征性的施氏结构，可判定为象牙或象牙制品。外缘施氏角平均值 大于 115判为现生象牙或牙制品，外缘施氏角平均值小于 90判为猛犸象牙或牙制品。
22、 9.2形态学无法直接判定种属的，如果分子生物学检测结果为阳性，可根据分子生物学检测结果直 接判定象牙种属（亚洲象牙、非洲象牙或猛犸象牙）；如果分子生物学检测结果为阴性，则无法判定 象牙种属。 9.3形态学无法直接判定的，如果分子生物学检测结果为阴性的，则判定为非象牙制品；如果分子 生物学检测结果为阳性的，则无法判定为象牙制品。 以正式出版文本为准 8 SN/T 5275 2019 附 录 A （资料性附录） 象牙横截面结构 图 A.1 象牙横截面结构图 猛犸象牙（锐角） 现生象牙（钝角） OA( outer Schreger angles) ：外缘施氏角 C (cementum) ：牙骨质
23、D (dentine) ：牙本质 图 A.2 猛犸象牙和现生象牙横截面的外缘施氏角 ( 图片引自 Espinoza E O, Mann M J, 1991） 以正式出版文本为准 9 SN/T 5275 2019 附 录 B （资料性附录） 试剂的配置 B.1 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） EDTA（二水乙二铵四乙酸二钠） 186.1 g ddH2O 800 mL NaOH 调 pH 至 8.0，加 ddH2O 至定容 1 L，121灭菌 15 min 后使用。 B.2 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5） Tris（三羟甲基氨基甲烷） 121.1 g ddH2
24、O 800 mL HCl 调 pH 至 7.5，加 ddH2O 至定容 1 L，121灭菌 15 min 后使用。 B.3 CTAB 提取缓冲液（pH 8.0） NaCl 81.7 g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵） 20 g 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5） 100 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） 40 mL HCl 或 NaOH 调 pH 至 8.0，加 ddH2O 至定容 1 L，121灭菌 15 min 后使用。 B.4 3 mol/L 乙酸钾溶液（pH 5.2） 乙酸钾 29.4 g ddH2O 60 mL 冰乙酸调 pH 至 5.2，加
25、ddH2O 至定容 100 mL，0.22 m 微孔滤膜过滤除菌。 B.5 TE 缓冲液（pH 8.0） 1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5） 10 mL 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） 2 mL 盐酸或氢氧化钠调 pH 至 8.0，加 ddH2O 至定容 1 L，121灭菌 15 min 后使用。 B.6 TBE 电泳缓冲液 B.6.1 10TBE 储存液 Tris 碱 108 g 硼酸 55 g 0.5 mol/L EDTA 溶液（pH 8.0） 40 mL 加 ddH2O 至定容 1 L。 B.6.2 1TBE 电泳缓冲液 10TBE 电泳缓冲液 100
26、mL 加 ddH2O 至定容 1 L。 以正式出版文本为准 10 SN/T 5275 2019 附 录 C （资料性附录） 象牙 PCR 扩增参考序列 C.1 非洲象靶标基因（cytb，KY616979.1，472 bp）参考序列 TGAGGACAAATATCATTCTGAGGGGCAACCGTAATCACTAACCTCTTCTCAGCAATTCCCTACATCG GCACAAGCCTAGTAGAATGAATCTGAGGAGGCTTTTCGGTAGATAAAGCAACCTTAAATCGATTCTTCGC CCTCCATTTCATTCTTCCATTTACTATAATTGCACTAGCAGGAGT
27、ACACCTAACCTTTCTTCACGAAACAG GCTCAAACAACCCACTAGGCCTCACTTCAGACTCAGACAAAATCCCCTTTCACCCGTACTATACCATCAA AGACTTCCTAGGATTACTTATCCTAATTTTACTTCTTCTACTCTTAGCCCTACTATCTCCCGACATACTAGG AGACCCTGACAACTATATACCAGCCGATCCACTAAATACTCCCCTACACATTAAACCAGAGTGATATTTC CTCTTTGCTTACGCCATCCTACGATCTGTACCAAACAAACTAGGAGGTGTCC C.2 亚
28、洲象靶标基因（cytb，DQ316068.1，472 bp）参考序列 TGAGGACAAATATCATTCTGAGGGGCAACCGTAATTACTAACCTCTTCTCAGCAATTCCCTACATCG GCACAAACCTAGTAGAATGAATTTGAGGAGGCTTTTCGGTAGATAAAGCAACCTTAAACCGATTCTTCGC CTTCCATTTCATCCTTCCATTTACTATAGTTGCACTAGCAGGAGTGCACCTAACCTTTCTTCACGAAACAG GCTCAAACAACCCACTAGGTCTCACTTCAAACTCAGACAAAATTCCCTTTCACC
29、CGTACTATACTATCAAA GACTTCCTAGGACTACTTATCCTAATTTTACTCCTTCTACTCTTAGCCCTACTATCTCCAGACATACTAGGA GACCCTGACAACTACATACCAGCTGATCCACTAAATACTCCCCTACATATCAAACCAGAGTGATACTTCC TTTTTGCTTACGCCATTCTACGATCTGTACCAAACAAACTAGGAGGTGTCC C.3 猛犸象靶标基因（cytb，MG334284.1，472 bp）参考序列 TGAGGACAAATATCATTCTGAGGGGCAACCGTAATCACTAACCTCT
30、TCTCAGCAATTCCCTACATCG GCACAGACCTAGTAGAATGAATCTGAGGAGGCTTTTCGGTAGATAAAGCAACCTTAAATCGATTCTTCGC CCTCCATTTTATTCTTCCATTTACTATAATTGCACTAGCAGGAGTACACCTAACCTTCCTTCACGAAACAG GCTCAAATAACCCACTAGGCCTCACTTCAGACTCAGACAAAATCCCCTTTCACCCGTACTATACCATCAA AGACTTCCTAGGACTACTTATCCTAATCCTATTCCTTCTACTCTTAGCCCTACTATCTCCTGAC
31、ATACTAGG AGACCCCGACAACTACATACCAGCTGATCCACTTAATACTCCCCTACACATCAAACCAGAGTGATACTTC CTCTTTGCTTACGCCATCCTACGATCTGTACCAAACAAACTAGGAGGCGTCC 以正式出版文本为准 11 SN/T 5275 2019 参考文献 1 LY/T 2200 象牙及其制品注册标记管理技术规范 2 LY/T 2501 野生动物及其产品的物种鉴定规范 3 Guidelines on Methods and Procedures for Ivory Sampling and Laboratory Anal
32、ysis（UNDOC: United Nations Office on Drugs and Crime. http:/www.unodc.org/documents/Wildlife/Guidelines_Ivory.pdf） 4 Espinoza E O, Mann M J. Identification guide for ivory and ivory substitutes. 1991.（https:/cites.org/ eng/resources/publications.php） 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 开本 8801230 1/16 印张 0.00 字数 00 千字 2019 年 月第一版 2019 年 月第一次印刷 印数 1500 书号：000000 定价 14.00 元 象牙及其制品鉴定技术规范 行 业 标 准 SN/T 52752019 SN/T 52752019 * * * 网址 SN/T 5275 2019
